一种快速区分细菌革兰氏类型的荧光检测法

摘要

本发明提供一种快速区分细菌革兰氏类型的荧光检测法，属于生物分析检测领域。该方法通过单一小分子荧光探针实现快速区分细菌的革兰氏类型。这一探针分子具有高灵敏和高选择特性，由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表面的结构明显不同，探针分子响应不同革兰氏类型菌后产生差异的荧光信号，分别以探针荧光比率变化和荧光增强信号作为横纵坐标得到二维图谱，通过对大量细菌检测后获得区分细菌革兰氏类型的标准曲线，待测菌株的二维图谱与标准曲线对照后即确定细菌的革兰氏类型。该方法具有操作简单，检测灵敏快速，普适性强的特点，性能优于已有的细菌革兰氏类型的检测法。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种快速区分细菌革兰氏类型的荧光检测法。

背景技术

细菌的交叉感染能够诱导各种重大疾病甚至致人死亡，严重威胁着全球公共安全。控制细菌感染的有效方法是快速将这些细菌分类鉴别，并选择合适的药物进行治疗。根据细菌细胞壁结构的不同，细菌被分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。初步分析细菌的革兰氏类型能有效缩小鉴定范围，有利于快速做出诊断。当前，医院对于细菌的常规检测方法为：首先检测细菌的革兰氏类型；然后根据其革兰氏类型采用不同的生化实验确定细菌的菌种，给医生初步用药意见；最后根据菌种选择合适的药物共孵育，通过细菌的生长程度确定其耐药性，给医生指导性的用药意见。可见细菌革兰氏类型的鉴定是细菌感染快速诊断的关键步骤。

目前常用的鉴定方法是革兰氏染色法，其检测原理是通过结晶紫初染和碘液媒染后在细胞壁内形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物，由于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞壁结构差异，脱色复染后，革兰氏阳性菌仍呈紫色，而革兰氏阴性菌呈红色，通过镜下观察细菌的颜色来区分其革兰氏类型。尽管这一方法已经沿用了近百年，却存在步骤繁琐、使用的有机溶剂污染环境、耗时(约需24-48小时)的缺点，并且在实验中经常会出现假阳性或假阴性结果。近期，一些新的鉴定方法被开发出来，如拉曼、红外光谱法等，但是这类方法需要高的激光功率、高浓度细菌、长时间采集并且采集信号通常非常弱。因此，当前急需研发快速、准确区分细菌革兰氏类型的新方法。

荧光探针具有快速、简单、灵敏、能够实时监测等优点而被广泛应用于细菌的检测，在细菌革兰氏类型鉴定方面也有初步应用。利用带正电荷的量子点与细菌细胞壁作用，根据光谱来判断细菌革兰氏类型。另外通过基于革兰氏阴性菌细胞壁特有的脂多糖，科学家发明了一种选择性标记不同类型细菌的双光子成像方法。尽管如此，这些方法只初步试用与少数几个细菌，其普遍性还有待探究，无法实际应用。因此开发一种简单快速且能够广谱性鉴别细菌的革兰氏类型的方法仍是当前的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速区分细菌革兰氏类型的荧光检测法，单一小分子荧光探针响应不同革兰氏类型菌后产生差异的荧光信号，通过对大量细菌检测后获得区分细菌革兰氏类型的标准曲线，待测菌株的荧光图谱与标准曲线对照后即确定细菌的革兰氏类型。该方法具有操作简单，检测灵敏快速，普适性强的特点，性能优于已有的细菌革兰氏类型的检测法。

小分子荧光探针具有高灵敏和高选择特性，由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表面的结构明显不同，探针分子响应不同革兰氏类型菌后产生差异的荧光信号，分别以探针荧光比率变化和荧光增强信号作为横纵坐标得到二维图谱，通过对大量细菌检测后获得区分细菌革兰氏类型的标准曲线，待测菌株的二维图谱与标准曲线对照后即确定细菌的革兰氏类型。

一种快速区分细菌革兰氏类型的荧光检测法，具体按照如下步骤进行：

(1)细菌培养：细菌于培养基中，在37℃下震荡培养。

(2)细菌收集：在10000-14000rpm条件下离心5-10分钟，弃上清，用20mM、pH＝7.4的PBS缓冲液清洗细菌2-3次，最后用PBS重悬细菌；

(3)荧光检测：在待检测细菌中加入荧光探针，用荧光光谱仪检测，在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图；

(4)数据处理：以荧光比率变化(I

所述步骤(1)中细菌培养至OD

所述步骤(2)中用PBS重悬至细菌的OD

所述步骤(3)中应用的荧光探针的分子结构式如下：

该探针为在两个芘间连接二联咪唑盐，其中二连咪唑为识别官能团，芘为荧光响应官能团，它能够发射芘单体或芘激基复合物荧光，分别在375nm和482nm；该化合物带有2个正电荷，在水溶液中由于疏水作用形成纳米聚集体而导致荧光淬灭。

所述步骤(3)中细菌的最终OD

所述步骤(4)中标准曲线的方程式为y＝0.32x-(0.184±0.192)

所述的一种快速区分细菌革兰氏类型的荧光检测法，其特征在于该方法可以用于区分任一细菌的革兰氏类型。

本发明的优点和有益效果为：

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞表面的结构有明显的不同，探针分子响应不同革兰氏类型菌后产生差异的荧光信号(芘单体和芘激基复合物荧光信号)，分别以探针荧光比率变化和荧光增强信号作为横纵坐标得到二维图谱，通过对大量细菌检测后获得区分细菌革兰氏类型的标准曲线，待测菌株的二维图谱与标准曲线对照后即确定细菌的革兰氏类型。该方法具有操作简单，检测灵敏快速，普适性强的特点，性能优于已有的细菌革兰氏类型的检测法。

附图说明

图1为荧光探针与50种不同细菌作用前后的荧光光谱图。

图2为荧光探针与50种不同细菌作用后的二维图谱，以及标准曲线。

图3临床未知菌株1与探针作用后的二维图谱。

图4临床未知菌株2与探针作用后的二维图谱。

图5临床未知菌株3与探针作用后的二维图谱。

图6临床未知菌株4与探针作用后的二维图谱。

图7临床未知菌株5与探针作用后的二维图谱。

图8临床未知菌株6与探针作用后的二维图谱。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

荧光探针对50种不同细菌的革兰氏类型区分

细菌培养：取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mL PBS缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到图1。

图1中只有di-PYIM探针存在时显示微弱的荧光，加入各种细菌后375nm发射峰的荧光和482nm发射峰的荧光均发生变化，但是各种菌增强的幅度不同。

实施例2

荧光探针对50种不同细菌的革兰氏类型区分

由图1中荧光强度换算得到di-PYIM探针与50种细菌作用后的二维荧光比率图2，横坐标为di-PYIM探针与细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I

实施例3

荧光探针对临床未知菌株1的革兰氏类型区分

从医院获得的临床未知菌株1，经过革兰氏染色法鉴定其为革兰氏阳性菌。

取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

图3的横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I

实施例4

荧光探针对临床未知菌株2的革兰氏类型区分

从医院获得的临床未知菌株2，经过革兰氏染色法鉴定其为革兰氏阳性菌。

取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

图4的横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I

实施例5

荧光探针对临床未知菌株3的革兰氏类型区分

从医院获得的临床未知菌株3，经过革兰氏染色法鉴定其为革兰氏阳性菌。

取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

图5的横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I

实施例6

荧光探针对临床未知菌株4的革兰氏类型区分

从医院获得的临床未知菌株4，经过革兰氏染色法鉴定其为革兰氏阴性菌。

取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

图6的横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I

实施例7

荧光探针对临床未知菌株5的革兰氏类型区分

从医院获得的临床未知菌株5，经过革兰氏染色法鉴定其为革兰氏阴性菌。

取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

图7的横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I

实施例8

荧光探针对临床未知菌株6的革兰氏类型区分

从医院获得的临床未知菌株6，经过革兰氏染色法鉴定其为革兰氏阴性菌。

取过夜培养的细菌100μL于20mL液体培养基中在37℃摇床震荡培养，长至细菌浓度OD

图8的横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I