一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法

摘要

一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，属于茶叶杀螨剂残留检测技术领域。包括1）茶鲜叶、绿茶/红茶样品：1%甲酸水浸泡，加入1‑5%甲酸乙腈或乙酸乙腈提取，再加入NaCl，离心后，取出上清液，残渣再加入1‑5%甲酸乙腈或乙酸乙腈重复提取，合并上清液浓缩至干，甲酸乙腈复溶后转移至装有C18、GCB、MgSO4的离心管中，净化离心，分取上清液浓缩至干，乙腈定容；2）茶汤样品：茶汤加入1‑5%甲酸乙腈或乙酸乙腈混匀，加入NaCl，离心后，取出上清液，下层重复提取，合并上清液浓缩至干，乙腈定容；3）超高效液相色谱‑质谱基质外标法测定。本方法满足残留分析要求，能满足茶叶和茶汤中螺螨酯残留检测的需要。

说明书

技术领域

本发明属于茶叶杀螨剂残留检测技术领域，具体涉及一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法。

背景技术

螺螨酯（Spirodiclofen，C

茶叶是一种重要的经济作物，化学农药的使用有助于防治茶树病虫害，从而提高茶叶产量、增加农民收入。然而，农药的不合理使用引起的残留问题也受到越来越多的关注。近年来，我国茶园主要登记使用有苦参碱、矿物油和石硫合剂来防治茶毛虫、茶橙瘿螨、叶螨和红蜘蛛等。有研究表明，24%螨危（螺螨酯）悬浮剂采用3000～5000倍液防治茶橙瘿螨，药后1 d的防治效果即达 81.08%～99.37%，药后15 d防治效果达100%，速效性和持效性均较好，可作为茶园替代农药用于防治茶橙瘿螨来减少现有农药的抗性。然而，目前国内外未见到专门针对茶叶和茶汤中螺螨酯的残留分析的方法报道。虽然现有技术中公开了螺螨酯在柑橘和土壤等中的残留分析，同样采用液相色谱质谱检测，但条件不同，与本申请区别在于：本申请进行了前处理优化和液相质谱条件改进，涉及到的样本处理基质也更复杂。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法。本方法在茶鲜叶、红茶和绿茶、红茶汤和绿茶汤中的定量限（LOQs）分别为0.002 mg/kg、0.005 mg/kg和0.0002 mg/L，满足残留分析的要求，能够用于茶叶和茶汤中螺螨酯残留检测的需要。本申请中茶鲜叶是指直接从茶树上采摘的叶片；红茶、绿茶是指经过加工的茶叶。

一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于包括以下步骤：

1）茶鲜叶、绿茶、红茶样品：称取样品于离心管中，加入1%甲酸水涡旋混匀，静置，加入1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈，涡旋混匀，静置后均质，加入NaCl，振荡后超声，再离心取出上清液，残渣再加入1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈重复提取一次，合并两次上清液，浓缩至干后，用1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈超声复溶，转移至装有C

或2）茶汤样品：茶水冲泡后，双层滤纸过滤得到茶汤样品，量取茶汤置于离心管中，加入1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈，涡旋混匀，加入NaCl，振荡后离心，取上层清液于烧瓶中，下层再加入1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈重复提取一次，转移合并两次上清液，浓缩至干，乙腈定容，过0.22 µm滤膜，备用；

3）超高效液相色谱-串联质谱基质外标法测定。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤1）中当样品是茶鲜叶时，1%甲酸水与茶鲜叶的体积质量比为2：1 mL/g；第一次和第二次1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈加入量与茶鲜叶的体积质量比为4：1 mL/g；用1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈超声复溶时加入量与茶鲜叶的体积质量比为2：1 mL/g。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤1）中当样品是绿茶/红茶时，1%甲酸水与绿茶/红茶的体积质量比为5：1 mL/g；第一次和第二次1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈加入量与绿茶/红茶的体积质量比为5：1 mL/g；用1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈超声复溶时加入量与绿茶/红茶的体积质量比为5：1 mL/g。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤1）中加入1%甲酸水涡旋混匀后静置30 min；所述加入1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈后涡旋混匀，静置2h后均质1-3 min；所述加入NaCl后震荡5 min，超声10 min，7500 r/min下离心5 min；所述浓缩至干过程中温度均为42℃；所述超声复溶后将溶液于4000 r/min下离心5 min，取上清液至离心管中，涡旋混匀2 min，振荡5 min，12000 r/min下离心5 min。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤1）中乙腈定容的加入量为1 mL。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤1）中装有C

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤2）中茶水的茶与水的质量比为1：50，水温100 ℃冲泡10 min；所述茶汤与1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈的体积比为1：1；所述NaCl与茶汤的质量体积比为8：25 g/mL；所述振荡5 min，离心条件为7500 r/min下离心5 min；所述乙腈定容加入量为1 mL。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述1-5%甲酸乙腈或乙酸乙腈优选为1%甲酸乙腈。

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤3）中色谱条件为：Acquity UPLC BEH C

所述的一种茶叶和茶汤中螺螨酯残留分析测定方法，其特征在于所述步骤3）中质谱条件为：电喷雾正电离多反应监测模式ESI

本发明方法利用优化好的QuEChERS前处理方法，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测，从而为后续研究螺螨酯在茶叶生长加工和冲泡过程中的残留迁移降解规律，进行膳食风险评估，指导在茶园中合理使用螺螨酯，并科学制定茶叶中螺螨酯最大残留限量标准。在茶鲜叶、红茶和绿茶、红茶汤和绿茶汤中的定量限（LOQs）分别为0.002 mg/kg、0.005 mg/kg和0.0002 mg/L，方法满足残留分析的要求，能够用于茶叶和茶汤中螺螨酯残留检测的需要。

附图说明

图1为螺螨酯化学结构和二级质谱图；

图2为螺螨酯在不同种类、不同质量净化剂下的回收率情况；

图3为螺螨酯在茶鲜叶生长过程中的消解动态。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例：

1 实验部分

1.1仪器与试剂

UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配有电喷雾电离(ESI)源，MassLynx 4.1质谱工作站）：美国Waters公司产品；高速离心机：德国Sigma公司产品；电子分析天平（0.000 1 g 和0.01 g）：美国Mettler公司产品；R-210 BUCHI旋转蒸发仪：瑞士BUCHI Labortechnik A G公司产品；DFT-200食品粉碎机：温岭市林大机械有限公司产品；KQ-250DB超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；T18均质器：德国IKA公司产品；Vortex-2涡旋混合器：美国Scientific公司产品；0.22 µm Filter Unit滤膜：宁波哈迈仪器科技有限公司产品。

乙腈、甲醇（色谱纯）：德国Merk公司产品；甲酸、乙酸、乙酸铵（色谱纯）：上海安普实验科技股份有限公司产品；无水MgSO

螺螨酯标准品（纯度98%）：德国Dr. Ehrenstorfer公司产品；240 g/L螺螨酯悬浮剂：德国拜耳公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

茶鲜叶、绿茶和红茶：称取茶鲜叶5.00 g（绿茶、红茶为2.00 g）样品置于50 mL离心管中，加入10 mL 1%甲酸水涡旋混匀，静置30 min；加入20 mL 1%甲酸乙腈（绿茶、红茶为10 mL），涡旋混匀，静置2 h后均质1-3 min；加入5.0 g NaCl（绿茶、红茶为3.0 g），振荡5min，超声10 min，7500 r/min下离心5 min；取上清液至250 mL圆底烧瓶中，重复提取1次，合并两次上清液，并于42 ℃下浓缩至干；10 mL 1%甲酸乙腈溶液超声复溶后，将溶液转移至15 mL离心管中，并于4000 r/min下离心5 min；取6.0 mL上清液至装有200 mg C

茶汤：按照茶/水比为1/50，水温100 ℃，冲泡10 min后，双层滤纸过滤，分别得到红茶汤、绿茶汤样品；量取25.0 mL茶汤置于100 mL离心管中，加入25.0 mL 1%甲酸乙腈溶液，涡旋混匀，加入8.0 g NaCl，振荡5min，7500 r/min下离心5 min；取上清液于250 mL圆底烧瓶中，15.0 mL 1%甲酸乙腈溶液重复提取下层水溶液1次，合并两次上清液并浓缩至干，1.0 mL乙腈定容，过0.22 µm滤膜，UPLC-MS/MS基质外标法测定。

1.2.2 色谱质谱条件

色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm × 1.7 µm）；柱温40 ℃；进样量5 µL；流动相A：0.1%甲酸乙腈溶液；流动相B：10 mmol/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序见表1，螺螨酯的保留时间为7.49 min。

质谱条件：电喷雾正电离多反应监测模式（ESI

表1螺螨酯的UPLC-MS/MS检测条件

1.2.3 标准溶液配制与标准曲线

准确称取一定量的螺螨酯标准品，乙腈溶解，稀释得到100 mg/L螺螨酯标准储备液。利用按照1.3节方法处理得到茶鲜叶、红茶、绿茶、红茶汤和绿茶汤基质空白，将储备液稀释成2.5, 1.0, 0.5, 0.25, 0.10, 0.05, 0.025, 0.01和0.005 mg/L的溶剂和不同基质标准溶液，UPLC-MS/MS分析测定，每个浓度测定３次，以浓度为横坐标（x），峰面积平均值为纵坐标（y），获得螺螨酯在溶剂和不同基质中的标准曲线和线性相关系数R

同时，利用公式ME=A/B计算基质效应（Matrix Effect），其中，A为不同基质标准曲线的斜率，B为溶剂标准曲线的斜率。若ME大于1，说明存在基质增强效应，反之则说明存在基质减弱效应。

1.2.4 添加回收率、精密度

分别添加不同浓度水平的螺螨酯标准溶液于空白茶鲜叶（0.002、0.010、0.10和1.0 mg/kg）、红茶和绿茶（0.005、0.025、0.250和2.50 mg/kg）、红茶汤和绿茶汤（0.0002、0.001、0.010和0.10 mg/kg）中，按上述提取、净化测定步骤，进行添加回收率试验，计算得到螺螨酯在不同样品基质中不同添加浓度下的回收率和相对标准偏差（RSD）。

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱条件的优化

液相色谱中的流动相直接影响到色谱峰的分离度和峰型，也影响着化合物的离子化程度及响应。现有技术中对螺螨酯的残留分析中，选用的流动相有甲醇-0.1%甲酸水、10mmol/L乙酸铵溶液和乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、甲醇和5 mmol/L的甲酸铵、5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）和甲醇。本研究通过比较不同流动相条件下螺螨酯的峰型及响应情况，最终选择0.1%甲酸乙腈和10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，优化后的梯度洗脱程序见1.2.2。此外，通过比较不同比例（10/0、9/1、8/2、7/3、6/4、5/5、4/6、3/7、2/8、1/9和0/10，v/v）下的乙腈/水作为定容进样溶剂进样时螺螨酯的峰型和响应情况，发现不同比例的乙腈/水对螺螨酯的峰型影响较小，但响应值存在差异，纯乙腈进样条件下螺螨酯的响应最高，最终选择纯乙腈作为进样定容溶剂。

在全扫模式(Scan)下，分别用电喷雾正离子模式(ESI+)和电喷负离子模式(ESI-)对螺螨酯进行扫描，结果表明，在ESI+模式下，螺螨酯的离子化效果更好，能获得更高的[M+H]+（

2.2 前处理方法优化

不同基质中螺螨酯的常见提取溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、正己烷等，本实验选择乙腈作为提取溶剂，并比较了在不同酸化条件（1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈和5%乙酸乙腈）下螺螨酯在茶叶中的回收率情况。结果表明，螺螨酯在几种提取剂条件下都能满足回收率要求，回收率范围为80.8%-103.0%，RSD为1.6%-9.5%，并且甲酸的效果大于乙酸和纯乙腈，且提取剂为1%甲酸乙腈溶液时，回收率效果最好。此外，提取前，先用1%甲酸水溶液对茶叶样品进行充分浸泡，提高螺螨酯在茶叶中的提取效果。

同时，由于茶叶基质较为复杂，富含茶多酚、咖啡碱和色素等，对目标物的分析带来一定的困难。本实验采用QuEChERS前处理方法对茶叶样品进行处理，比较一系列不同质量、不同种类净化填料条件下（5、10、20、50、100和150 mg的PWAX、SCX、C

因此，综合茶叶基质、样品处理方法以及螺螨酯在其它基质提取过程中净化剂的选择情况，最终选择C

2.3方法标准曲线、基质效应和检测限

采用不同基质空白提取液配制螺螨酯基质匹配标准曲线，不同茶叶等基质中的线性方程、相关系数、定量限和基质效应（MEs）见表1。结果表明：在0.005-2.50 mg/L浓度范围内，螺螨酯在不同基质中标准曲线都具有良好的线性，相关系数R2在0.9936以上。不同基质中螺螨酯的基质效应MEs为0.12-0.58，MEs小于1，意味着在这些基质中螺螨酯表现出基质减弱效应，基质减弱效应强度大小为茶汤（红茶汤和绿茶汤）<鲜叶<干茶（红茶和绿茶）。以基质标准曲线上的最低浓度水平下的响应，信噪比

2.4添加回收率、精密度和方法定量限

为了评估分析方法的准确性和精密度，进行标准添加回收率试验，螺螨酯在不同基质中的添加回收率和精密度见表2。结果表明：螺螨酯在鲜叶中的回收率为99.3-107.5%，相对标准偏差（RSD）为4.3%-6.8%；在绿茶中的回收率为92.0%-99.2%，RSD为2.3%-5.1%；在红茶中的回收率为78.8%-86.5%，RSD为7.3%-13.9%；在绿茶汤中的回收率为85.1%-95.8%，RSD为1.3%-9.3%；在红茶汤中的回收率为83.4%-98.6%，RSD为2.9%-7.7%。

以满足回收率和相对标准偏差要求下的最低添加浓度水平来定义方法定量限（LOQs），螺螨酯在鲜叶中的LOQ为0.002 mg/kg，在绿茶和红茶中的LOQ为0.005 mg/kg，在绿茶汤和红茶汤中的LOQ为0.0002 mg/L。方法能够满足农药残留分析方法要求，可以用于不同茶叶基质中螺螨酯的残留分析测定。

表2 螺螨酯在不同基质中的线性方程、相关系数、基质效应（MEs）、检测限（LODs）、平均添加回收率、相对标准偏差（RSDs）和定量限（LOQs）

注：C

2.5茶叶中螺螨酯实际样品检测

采用此方法，检测按照田间残留试验规定，在浙江茶园喷施螺螨酯后的茶鲜叶上的螺螨酯残留量。结果表明：茶鲜叶上螺螨酯的初始沉积量为12.870 mg/kg，施药8 d后，在茶树上的残留量为1.828 mg/kg，降解率为85.8%，在茶鲜叶上的残留量随着时间的增长而逐渐降低，见图3，螺螨酯在茶鲜叶生长过程中的消解动态方程为C=14.697e