一种负载热休克蛋白的异体mRNA-DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种负载热休克蛋白的异体mRNA‑DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用。该多肽疫苗包括热休克蛋白以及与其复合的抗原肽；其制备方法为：(1)诱导树突状细胞分化，并将异体来源的骨肉瘤细胞mRNA转染至该树突状细胞中，制备得到异体mRNA‑DC瘤苗细胞；(2)利用免疫沉淀技术从异体mRNA‑DC瘤苗细胞中分离得到该HSP‑多肽疫苗。本发明通过对抗原肽组成成分进行优化，能够根本上提高HSP.PC的免疫原性，以弥补肿瘤细胞来源的HSP.PC“免疫原性不够强”的缺点。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种负载热休克蛋白的异体mRNA-DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤的免疫治疗机制主要是通过调节或增强机体本身固有的内在性防御机制(主要是机体对肿瘤细胞的免疫监视和免疫排斥)来抑制或杀伤肿瘤细胞，或通过抑制肿瘤细胞转化，促进恶性细胞分化来降低肿瘤的恶性程度。肿瘤疫苗(简称“瘤苗”)的制备，是肿瘤免疫治疗的重要手段之一，而各种肿瘤疫苗中伴侣分子抗原肽瘤苗则是当前的研究热点，其原理是通过激活患者自身的免疫系统，利用肿瘤抗原肽诱导机体的非特异性抗肿瘤机制及特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤生长、扩散和复发，达到清除或控制肿瘤的目的。

热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)是细胞受到应激刺激包括受热、惊厥、癫痫、缺血、缺氧等后诱导染色体HSP基因的表达而合成的蛋白质。HSP作为体内最重要的分子伴侣之一，主要负责新生肽段及蛋白质的折叠、展开及在不同细胞腔隙中的转运，在抗原处理、加工、呈递发挥关键作用，在DC细胞表面上亦有其高亲和力受体(主要是CD91)。HSP是生物体内普遍存在，进化上高度保守的蛋白质，Morimoto等按其分子量可分为以下几个家族：HSP110、HSP 90、HSP70、HSP60、小分子量HSP(相对分子量为22232kD)及泛素(相对分子质量为728kD)，它们除了具有重要的分子伴侣功能外，还参与细胞抗损伤、分化等。其中HSP70家族成员最多，共有21种蛋白质，功能最为重要，特别是其在抗肿瘤的免疫效应中发挥着关键性作用，能够将与其结合的抗原多肽通过内源性途径传递给MHC I类分子，引发特异性的T细胞反应，该领域已成为目前的研究热点之一。

在肿瘤细胞中，肿瘤抗原蛋白经蛋白酶水解成丰富的肿瘤抗原肽段后，与HSP70形成抗原肽复合物HSP.PC，然后通过抗原处理相关转运蛋白(transporters associatedwith antigen processing,TAP)将抗原肽运输至内质网并与MHCI类分子进一步结合，最终将抗原肽呈递于细胞表面。因此，HSP.PC也被誉为肿瘤细胞抗原肽的指纹。HSP.PC被提取或释放出肿瘤细胞后，与抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)的膜受体结合进入细胞内，被胞质中的蛋白酶体降解成肽段，经TAP途径将抗原肽转运到内质网腔内，与MHC分子形成复合体转入高尔基复合体内，再通过分泌泡转运到细胞表面，激活肿瘤抗原特异性的适应性免疫反应(CD8及CD4淋巴细胞反应)，以及非特异性的固有免疫反应(细胞因子释放，自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)细胞活化，促DC成熟)，最终诱导有效的抗肿瘤免疫效应。

但现有的HSP.PC存在免疫原性不够强的缺点：主要表现为在早期肿瘤患者有效，在晚期患者中无显著抗瘤效应。2008年，权威杂志lancet报道了全球最大的(728例患者)III期临床试验，结果表明：在早期患者中，HSP.PC治疗组与对照组无统计学差异。同年Testori A等人报道了另一起大规模3期临床试验(322例患者)，其结果与lancet报道一致，HSP.PC治疗仅对早期肿瘤患者有效。②HSP.PC疫苗获得量有限：HSP.PC获得量是受患者来源的肿瘤组织及细胞数量而限制的，很多患者无法获得要求的最低治疗剂量(最低免疫次数4次)。Testori A等进行的III期临床试验表明仅有49％的患者分离到了最低需要的治疗剂量。

因此，增强免疫原性既能提高其在晚期患者中的抗瘤效应，又能减少疫苗使用剂量，能从根本上拓宽其临床应用范围，意义重大。2006年长期从事融合细胞研究的波士顿大学Gong Jianlin教授与长期从事HSP.PC研究的哈佛大学Studart教授合作，从融合细胞中提取HSP70.PC(融合细胞-HSP70.PC)，并免疫小鼠，发现融合瘤苗来源的HSP70.PC比肿瘤细胞来源的HSP70.PC(肿瘤细胞-HSP70.PC)具有明显增强的免疫原性及抗肿瘤效应，并且能够逆转肿瘤免疫耐受。在DC/肿瘤融合细胞中，HSP也与肿瘤抗原肽形成复合物。不同的是融合细胞由于整合了DC强大的抗原处理、加工的功能，所以比其肿瘤具有更强大的抗原处理、加工功能，其可对肿瘤抗原进行更充分的处理、加工。这一特点使融合细胞比肿瘤细胞可能含有更宽的肿瘤抗原肽谱，而抗原肽决定着HSP.PC的免疫原性。

尽管融合细胞为增强HSP.PC的免疫原性提供了一种途径，然而面对临床应用，融合细胞来源的HSP.PC同样存在明显缺陷：细胞经过融合电流冲击后，活性减低，难以质控，也影响到其HSP.PC的产量与活性；异体肿瘤细胞来源的融合细胞携带较多的异体肿瘤蛋白，容易诱发比较强烈的排异反应，这些缺陷均限制了融合细胞来源的HSP.PC的临床应用。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一一种负载热休克蛋白的异体mRNA-DC肿瘤疫苗及其制备方法和应用，通过对抗原肽组成成分进行优化，能够从根本上提高HSP.PC的免疫原性，以弥补肿瘤细胞来源的HSP.PC“免疫原性不够强”的缺点。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种从异体mRNA-DC瘤苗中获得多肽复合物的方法，包括以下步骤：

(1)诱导树突状细胞分化，并将异体来源的骨肉瘤细胞mRNA转染至该树突状细胞中，制备得到异体mRNA-DC瘤苗细胞；

(2)从异体mRNA-DC瘤苗细胞中分离得到该多肽复合物。

进一步地，树突状细胞由大鼠骨髓单核细胞分化形成。

进一步地，步骤(1)中的异体来源指的是两个不同的大鼠个体。

进一步地，多肽复合物由热休克蛋白以及与其复合的抗原肽组成。

进一步地，多肽复合物为HSP70.PC。

进一步地，抗原肽还包括KIF20A、STAT3和TPM3等抗原肽。

进一步地，步骤(2)中的分离多肽复合物的方法为免疫沉淀技术。

上述方法获得的包括热休克蛋白以及与其复合的抗原肽的多肽复合物。

一种负载热休克蛋白的异体mRNA-DC肿瘤疫苗，包括上述的多肽复合物。

一种抗肿瘤药物，包括上述的异体mRNA-DC肿瘤疫苗。

本发明的有益效果为：

本发明通过制备异体mRNA-DC瘤苗细胞，能够根本上提高HSP.PC的免疫原性，以弥补肿瘤细胞来源的HSP.PC“免疫原性不够强”的缺点。

通过对荷瘤模型在接受HSP70.PC疫苗治疗的前后，机体的免疫抑制状态的比较，表明HSP70.PC多价瘤苗能够通过打破免疫抑制来实现其抗肿瘤功效。

附图说明

图1为UMR108细胞的PCR检测结果图；

图2为DC细胞表面MHCII、CD80、OX62、CD86、CD40表达情况检测结果；

图3为UMR108细胞mRNA电转检测结果；

图4为异体mRNA-DC瘤苗细胞中HSP70.PC表达检测结果；

图5为HSP70.PC预防免疫保护作用检测结果；

图6为HSP70.PC荷瘤大鼠主动免疫治疗检测结果；

图7为HSP70.PC诱导的CD8+T细胞表型分析检测结果；

图8为HSP70.PC诱导的CTL杀伤效应检测结果；

图9为MDSC流式细胞检测结果图；

图10为HSP70.PC诱导的CD8+T细胞表面抑制性受体表达(CTLA-4、TIM3、PD-1)与大鼠体内MDSC含量的相关性分析图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1异体mRNA-DC瘤苗的制备

1、磁珠法纯化mRNA

取UMR108细胞，液氮冷冻研磨，在严格消毒、无RNase污染条件下，用Trizol试剂(invitrogen)提取总RNA，普通琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，其结果见图1(A)，如图1A所示，细胞具有完整的18s、28s的完整RNA。

按测定浓度将总RNA样品稀释为800μg/mL，取0.5mL置无RNase污染的离心管中(上样量为400μg)65℃温浴10min，加生物素标记的oligo(dT)探针混匀后室温下完全冷确。将该杂交液转入磁珠法试剂盒盛有磁珠的离心管中，用磁力架吸附磁珠，弃上清液。洗涤磁珠3次，洗脱2次。在洗脱液中加NaAc和异丙醇，在-20℃沉淀过夜。离心后，75％乙醇洗涤沉淀，风干后加无RNase ddH

2、DC的体外定向诱导、培养及鉴定

取健康4周龄SD大鼠，处死后，收集骨髓细胞，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化骨髓单核细胞。调整细胞密度，接种于6孔板，贴壁2h，吸去未贴壁细胞；贴壁细胞以无血清RPMI-1640培养，并加入细胞因子rGM-CSF、rIL-4；继续于37℃，5％CO

如图2所示，在DC细胞表面MHCII、CD80、OX62、CD86、CD40均表达阳性。

3、电转染过程及电转染率的观察

应用电转仪(BTX-ECM2001)进行瞬间和稳定电转染，所有操作均在无菌条件下进行。电转前计数收集DC，将细胞悬液与大鼠细胞UMR108的mRNA及绿色荧光蛋白mRNA混合均匀，选择设定的电压、脉冲时程、温度等条件下电击细胞。电穿孔后30min加入含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液。细胞涂片在荧光显微镜的可见光下固定1个视野，计数细胞总数，然后转换荧光光源，计数发出荧光的细胞(其为绿色荧光，但在申请文件图3中无法体现出绿色)，检测电转结果，见图3。如图3所示，成功提取UMR108细胞中的mRNA并将其电转进DC细胞。

实施例2异体mRNA-DC瘤苗细胞来源的HSP70.PC的分离提取

使用免疫沉淀技术分离细胞HSP70.PC(本研究使用免疫沉淀技术分离HSP70.PC，是由于其有利于抗原肽成分的完整，前期研究中使用此法获得了满意的HSP70.PC)。同时收集异体mRNA-DC瘤苗细胞与肿瘤细胞，计数后使用裂解液裂解细胞团，高速离心获得上清后，加入抗HSP70一抗，4℃混匀过夜，加入蛋白A，蛋白G Sepharose，离心收获beads后，使用洗脱缓冲液解离，获取HSP70.PC，-80℃低温保存。

免疫沉淀过程中用HSP70抗体将DC细胞中HSP70-PC纯化，可检测到肿瘤相关抗原KIF20A在mRNA-DC来源的HSP70.PC中高表达(见图4)。

实施例3异体mRNA-DC瘤苗来源的HSP70.PC在荷瘤动物模型的体内实验

1、HSP70.PC体内诱导预防免疫保护作用

以10只SD大鼠作为1组，于第0天和第14天在实验组每只大鼠腹股沟皮内注射异体mRNA-DC瘤苗来源的HSP70.PC，分别以PBS(空白对照组)、未经转染的DC(PC/UMR108)以及骨肉瘤细胞UMR108来源的HSP70.PC(PC/Mrna-EP DC)对大鼠进行皮内接种，1周之后采用盲法在实验组和对照组大鼠右后肢外侧皮下均注射致死量的骨肉瘤细胞UMR106，观察动物生存状况，并绘制动物生存曲线，其结果见图5。如图5所示，本申请制备得到的HSP70.PC具有良好的预防免疫保护作用。

2、HSP70.PC对荷瘤大鼠进行主动免疫治疗

以10只SD大鼠作为1组，于第0天在每只SD大鼠右后肢外侧皮下注射1×10

实施例4异体mRNA-DC瘤苗来源的HSP70.PC抗肿瘤免疫作用研究

1、CD8+T细胞表型分析

将CD8+T细胞分别与三色标记的抑制性受体PD-1、CTLA-4和Tim-3共孵育后，使用FACS分析上述转录因子和抑制性受体在接受HSP.PC疫苗治疗的后的变化，其结果见图7。使用不同来源的HSP-PC疫苗刺激大鼠产生的CD8+T细胞其表面抑制性受体PD-1、CTLA-4、TIM-3表达相较于对照组(PBS)均明显下降；而用mRNA-DC(图中PC/mRNA-EP DC)来源的HSP-PC疫苗刺激大鼠产生的CD8+T细胞其表面抑制性受体PD-1、CTLA-4、TIM-3的表达较异体UMR108来源的HSP70.PC(PC/UMR108)刺激的CD8+T细胞明显减少，差异具有统计学意义。

2、CTL杀伤实验

将实施例3中各组体内实验动物处死后，采用T细胞分离试剂盒获得CD8+T细胞，并计数。使用Cytotoxicity Assay试剂盒进行CTL实验。并与靶细胞(自体骨肉瘤细胞)按照不同效靶比混合作用4-5h后，采用非放射性乳酸脱氢酶(LDH)检测CTL杀伤效应，并以PBS和HSP70-PC/UMR108作为对照组，其检测结果见图8。如图8所示，本申请分离得到的异体mRNA-DC瘤苗来源的HSP70.PC诱导的CTL杀伤效果最佳。

3、调节免疫

MDSC分析：将实施例3中各组体内实验动物处死后，收集脾细胞和TIL，与双色标记的抗CD11b/Gr-1共孵育后，使用流式细胞仪分析MDSC(CD11b+Gr-1+)细胞在各组之间的比例变化，其结果如图9和图10所示，其中，图9A为流式细胞检测结果；图9B为MDSC细胞数量检测结果。

使用不同来源的HSP-PC疫苗刺激大鼠后体内MDSC比例相较于对照组(PBS)均有下降；而mRNA-DC来源的HSP-PC疫苗(PC/mRNA-EP DC)刺激大鼠后，大鼠脾脏中MDSC细胞比例较异体UMR108来源的HSP70.PC(PC/UMR108)刺激后MDSC比例明显下降，差异有统计学意义，大鼠体内MDSC含量与HSP70.PC刺激后CD8+细胞表面异质性受体的表达呈正相关。