小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用

摘要

小分子RNAhsa‑miR‑451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用，属于生物技术研究领域。本发明保护一种小分子RNAhsa‑miR‑451a在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。本发明提供的应用可有效保护细胞免受缺血诱导的死亡，减少梗死面积，有效提升制备治疗缺血性脑卒药物的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用。

背景技术

脑卒中每年影响全世界数百万人，是导致死亡的主要原因之一[1-2]。缺血性脑卒中是最常见的中风类型，占所有中风病例的80％[3]。缺血性中风的发病机制源于受影响脑组织的血液供应不足，脑组织接受的氧气和葡萄糖少于所需的氧气和葡萄糖。结果，发生脑损伤，这可能导致永久性和不可逆转的细胞死亡。多年来，在缺血性中风的治疗中几乎没有治疗突破。因此，广泛的研究集中在鉴定有效的疗法以拯救受影响的细胞免于死亡。

在缺血性脑卒中药物研究中，近年来小分子RNA(microRNA或miRNA)逐渐被众多研究者所重视[4-7]。miRNA成为研究热点的主要原因是：1)可以调控成百上千个基因，能在系统水平上对细胞进行调控；2)只有21–23个核苷酸，可以作为易吸收的小分子药物；3)更加容易合成，作为药物的成本较低；4)细胞本身就具有的一种小分子，可以避免潜在的免疫(排斥)反应；5)可以由细胞释放入血液，更加易于血液检测和诊断。

miRNA是一种非编码RNA，由细胞核内的基因转录而来，最后在细胞质内形成大小约为22个核苷酸的单链RNA。miRNA可以和mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)结合，从而达到减少蛋白翻译的作用[8-10]。目前已经探明miRNA在哺乳动物中调控超过60％的编码RNA(能最终翻译成蛋白)。这些蛋白参与细胞活动的各个环节，如发育、增殖、命运决定、生长控制、凋亡[11-12]。由于miRNA只能靠5'端约7个核苷酸(称为种子区)识别靶mRNA的3'UTR，理论上一个miRNA可以与几百个mRNA结合；一个mRNA的3'UTR上也可以有多个与miRNA种子区互补的序列。因此作为药物靶点，少量miRNA就可以在细胞的系统水平上控制细胞的多个信号通路及活动。

国内外的一些研究组已经开展miRNA与缺血性脑卒中的基础和应用研究，例如，通过靶向5-脂氧合酶以减少细胞死亡，发现miR-193b在缺血性脑卒中中具有潜在的神经保护作用[13]。miR-27b的下调可以增强缺血性脑卒中后AMPKα2介导的血管生成，从而可以促进长期恢复[14]。脑室内注射miR-3473b抑制剂可能通过在缺血性卒中期间靶向SOCS3来降低促炎蛋白的表达。上述事实表明：1)miRNA做为药物治疗缺血性脑卒中有着切实可行的应用基础和研究价值；2)miRNA已进入大医药公司的研发计划，开发新miRNA做为缺血性脑卒中的治疗药物具有良好的市场前景。

参考文献

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发明内容

针对上述不足本发明提供一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒药物中的应用。该应用有效保护细胞免受缺血诱导的死亡，减少梗死面积。

本发明解决技术问题采用的的小分子RNA hsa-miR-451a，其核苷酸序列如下：

5’-a

其中5’-

本发明保护一种小分子RNA hsa-miR-451a在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

进一步的，小分子RNA hsa-miR-451a在制备抑制治疗缺血性脑卒中凋亡药物中的应用。

进一步的，小分子RNA hsa-miR-451a种子区序列为核心构建的小分子RNA在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

进一步的，小分子RNA hsa-miR-451a种子区序列为核心构建的小分子RNA在制备抑制治疗缺血性脑卒中凋亡药物中的应用。

本发明利用qRT-PCR技术检测缺血性脑卒中后的第一天、第三天、第七天hsa-miR-451a的表达，发现在所有三个时间点，小鼠大脑皮层的患侧均检测到更高的hsa-miR-451a表达，尤其在第三天表达最高。

本发明将hsa-miR-451a注入小鼠大脑后观察到了较高的hsa-miR-451a表达显着降低了梗死脑组织的体积，而hsa-miR-451a抑制剂增加了梗死组织的体积。

本发明在MCAO小鼠的大脑切片上进行了TUNEL染色。与对照组相比，从接受hsa-miR-451a模拟物(具有较低的Phd3和p53)的小鼠中观察到凋亡细胞的百分比更低。但是，当使用hsa-miR-451a抑制剂(具有更高的Phd3和p53)降低hsa-miR-451a水平时，可以看到更多的凋亡细胞。

本发明利用qRT-PCR技术检测在缺血性脑卒中发作后的第一天、第三天、第七天Phd3的表达，发现在所有三个时间点，小鼠大脑皮层的患侧均检测到更低的Phd3的表达，尤其在第三天表达最低，这与hsa-miR-451a的表达呈负相关。

本发明利用生物信息学方法确定了hsa-miR-451a的靶基因为Phd3，并构建了hsa-miR-451a靶基因Phd3的报告载体，命名为psiCheck-Phd3。双荧光检测结果表明Phd3的确是hsa-miR-451a的靶基因。

本发明体外转染hsa-miR-451a后，对靶基因进行RT-PCR和免疫荧光检测，其结果表明靶基因Phd3在mRNA和蛋白水平均表达下调。

本发明hsa-miR-451a注入小鼠大脑后(Phd3水平下调)，p53水平显着降低，而施用hsa-miR-451a抑制剂(Phd3水平上调)显着提高p53水平。

因此，本发明hsa-miR-451a的过表达可能通过其靶基因Phd3，及其下游基因p53减少缺血性中风期间大脑凋亡细胞的数量，这可能是hsa-miR-451a减少梗死体积并保护细胞免于死亡的治疗效果的原因，这对hsa-miR-451a与缺血性脑卒中的关系意义重大。

原理：缺血性脑卒中模型MCAO中，小鼠大脑皮层内hsa-miR-451a的更高表达。脑室内注射hsa-miR-451a模拟物显着降低了MCAO小鼠的梗塞体积。在用hsa-miR-451a模拟物注射的小鼠中，通过TUNEL染色检测到hsa-miR-451a保护细胞免受缺血诱导的死亡。探索了hsa-miR-451a抗凋亡作用的机制，并在体外和体内均将Phd3(也称为Egln3)作为hsa-miR-451a的靶标。最后，p53被认为是介导hsa-miR-451a抗凋亡作用的Phd3的下游靶标。这项研究确定了hsa-miR-451a在缺血诱导的细胞凋亡中的新作用，并揭示了涉及hsa-miR-451a-Phd3-p53的新途径。目前关于hsa-miR-451a的研究还没有将其应用于缺血性脑卒中的治疗，因此可以根据hsa-miR-451a的差异表达设计针对缺血性脑卒中的治疗研究，这对于治疗缺血性脑卒中药物的研究具有重要意义。

有益效果：本发明提供的应用可有效保护细胞免受缺血诱导的死亡，减少梗死面积，有效提升制备治疗缺血性脑卒药物的治疗效果。

附图说明

图1为qRT-PCR检测MCAO后hsa-miR-451a的表达图。

图2为hsa-miR-451a降低MACO小鼠的梗死面积的图。

图3为hsa-miR-451a减少MCAO小鼠的细胞凋亡图。

图4为qRT-PCR检测MCAO后Phd3的表达图。

图5为hsa-miR-451a与其推测的靶基因Phd3的双荧光报告检测；hsa-miR-451a降低了MCAO小鼠中Phd3mRNA的表达图。

图6为hsa-miR-451a降低了MCAO小鼠中Phd3蛋白的表达图。

图7为qRT-PCR检测p53在MCAO小鼠中的表达图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：hsa-miR-451a在缺血性脑卒中脑组织中表达水平的检测

Trizol法分别提取缺血性脑卒中(MCAO)脑组织中的总RNA。用PBS将细胞洗涤2遍，每瓶加入1mL Trizol，吹打混匀，室温孵育5min；将细胞液转移入DEPC处理过的1.5mL离心管中，每管加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s混匀，冰上静置3～5min使分层；4℃，12000rpm，离心15min；小心吸取上层液体，转移到另一个DEPC处理过的1.5mL离心管中，加入等体积已在4℃预冷的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀15～30s，冰上(室温)静置5～10min；4℃，12000rpm，离心15min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀2次；4℃，7500rpm离心10min，弃上清，离心管倒置晾干，加入DEPC水30μL溶解RNA。紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度。

利用Takara的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系(20μL)如下：总RNA 0.1-lμg，5×逆转录反应缓冲液4μL，逆转录酶1μL，EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀，PCR仪上进行逆转录，反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃保存。

再以cDNA为模板，利用特异性hsa-miR-451a TaqMan引物，在实时定量PCR仪上进行Real-time PCR。反应体系(20μL)如下：20×TaqMan MicroRNA Assays 1μL，

Real-timePCR结果表明，相对于正常脑组织，在MCAO后第1天，第3天和第7天hsa-miR-451a在小鼠大脑皮层的患侧均检测到更高的hsa-miR-451a表达，在第3天hsa-miR-451a表达最高(图1)。

实施例2：hsa-miR-451a降低了MACO小鼠的梗塞面积

将3.5μL hsa-miR-451a模拟物或hsa-miR-451a抑制剂与3.5μL siRNA-Mate转染试剂混合，制备体内转染溶液。将转染溶液注射到C57BL/6小鼠的患侧(MCAO的一侧)的脑室，位置为前囟：-2.5mm，腹侧：1mm，侧开：1.5mm)。脑室内注射后一天，进行MCAO，48h后将小鼠脑组织行冰冻切片，将脑切片浸入Nissl染色溶液中15分钟，用蒸馏水洗涤，并用95％乙醇孵化5s。将脑部的Nissl染色图像加载到Adobe PhotoShop中以进行梗死体积测量(图2)。

实施例3：hsa-miR-451a减少了MCAO小鼠的细胞凋亡

hsa-miR-451a模拟物、hsa-miR-451a抑制剂体外转染到C57BL/6小鼠的患侧中，方法如实施例2，将小鼠脑组织行冰冻切片上用4％多聚甲醛固定20min，在冰上将细胞用渗透液中浸泡2min,用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加20μLTunnel反应液，置湿盒中于37C反应1h，在荧光显微镜下观察细胞染色可见经hsa-miR-451a抑制剂转染的小鼠脑组织中的凋亡细胞更多，经hsa-miR-451a模拟物转染的小鼠脑组织中的凋亡细胞减少(图3)。

实施例4：Phd3在缺血性脑卒中脑组织中表达水平的检测

利用Trizol法提取脑组织中的总RNA。提取方法同实施例1，紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度后，利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。

利用Takara的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系(20μL)如下：总RNA 0.1μg–lμg，5×逆转录反应缓冲液4μL，逆转录酶1μL，EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀，PCR仪上进行逆转录，反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃保存。

再以cDNA为模板，对靶基因进行RT-PCR。反应体系(20μL)如下：2×反应缓冲液10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，cDNA 1μL，DEPC水8.2μL。反应条件：95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环，4℃保存。以β-actin为靶基因的内参对照。

RT-PCR结果表明，与对照相比，MCAO后第一天、第三天及第七天Phd3的表达均降低，其中第三天表达最低(图4)。

实施例5：hsa-miR-451a靶基因的预测

通过生物信息学方法，利用网上数据库(TargetScan：http://www.targetscan.org/；miRWalk：mirwalk.umm.uni-heidelberg.de；and MiRtaget2：mirdb.org)预测hsa-miR-451a相关的靶基因，暂确定hsa-miR-451a的靶基因为Phd3。

实施例6：hsa-miR-451a靶基因报告载体的构建

依据GenBank中Phd3基因的序列，选取包含与hsa-miR-451a匹配的一段序列设计引物，(Phd3-F和Phd3-R)，并在Phd3-F的5′端悬垂内切酶XhoI的酶切位点和保护碱基，在Phd3-R5′端悬垂另一内切酶NotI的酶切位点和保护碱基。然后进行PCR扩增，，PCR反应体系(20μL)如下：5×反应缓冲液4μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，DNA 0.9μL(小于1μg)，10mM dNTPs 1.6μL，Phusion DNA Polymerase 0.2μL，ddH

再对载体psiCheck control进行双酶切，酶切体系为(10μL)：10×T Buffer 1μL，XhoI 1μL，Not I 1μL，psiCheck control 4μL，ddH2O 3μL。酶切反应在37℃水浴中进行，3h后利用凝胶回收试剂盒回收酶切产物，产物最终溶于10μL Buffer EB中。

将上述酶切产物进行连接，连接体系为(12μL)：10×连接Buffe 1.2μL，载体片段4.6μL，目的基因片段2.3μL，T4DNA连接酶1μL，ddH2O 2.9μL。连接反应室温(10min)进行，16～20h后，70℃水浴10min灭活连接酶，终止连接反应。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂菌平皿于37℃孵箱内培养12～16h。然后挑选阳性克隆，分别进行PCR扩增，酶切和测序验证，获得正确的hsa-miR-451a表达载体，命名为psiCheck-Phd3。

实施例7：hsa-miR-451a靶基因报告载体的体外转染

用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染试剂将psiCheck-Phd3及从Invitrogen公司购买用于转染的psiCheck-mut-Phd3转染至KEK293A细胞，转染步骤简述如下：转染前一天，以每孔4×10

实施例8：体内、体外检测hsa-miR-451a直接靶向抑制Phd3

(1)双荧光报告的检测

KEK293A细胞接种24h后进行转染。转染方法同实例7，然后进行双荧光报告的检测。双荧光素酶报告系统的检测，采用Promega的Dual-luciferase荧光素酶报告基因检测系统，按试剂盒说明操作，简要过程如下：转染KEK293A细胞48h后用PBS洗一遍细胞，然后每孔用被动裂解液100μL裂解细胞，取15μL裂解产物加入50μL Luciferase反应底物，然后用荧光测量仪测定Firefly荧光，再加入StopGlo试剂50μL，马上测量Renilla荧光。分析检查得到Firefly荧光素酶和Renilla荧光素酶的荧光值，用Renilla荧光素酶荧光值对Firefly荧光素酶荧光值进行归一化。每组实验至少重复3次，取平均值。

双荧光报告检测结果显示，当hsa-miR-451a靶基因报告载体Phd3-WT-3'UTR与hsa-miR-451a共转染KEK293A细胞后，荧光素酶的荧光值显著降低，表明Phd3的确是hsa-miR-451a的靶基因(图5)。

(2)RT-PCR检测靶基因在mRNA水平上的表达差异

hsa-miR-451a模拟物、hsa-miR-451a抑制剂体外转染到C57BL/6小鼠的患侧中，方法如实施例2，利用Trizol法提取细胞的总RNA。提取方法同实施例1，紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度后，利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。

利用Takara的逆转录试剂盒将上述所提总RNA进行cDNA的合成。反应体系(20μL)如下：总RNA0.1μg–1μg，5×逆转录反应缓冲液4μL，逆转录酶1μL，EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀，PCR仪上进行逆转录，反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃保存。

再以cDNA为模板，对靶基因进行RT-PCR。反应体系(20ul)如下：2×反应缓冲液10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，cDNA 1μL，DEPC水8.2μL。反应条件：95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环，4℃保存。以β-actin为靶基因的内参对照。

RT-PCR结果表明，与对照相比，转染了hsa-miR-451a的靶基因Phd3在mRNA水平表达降低(图5)。

实施例9：免疫荧光检测靶基因在蛋白水平上的表达差异

利用免疫荧光检测靶基因在蛋白水平上的表达差异，检测步骤简述如下：

将3.5μL hsa-miR-451a模拟物或hsa-miR-451a抑制剂与3.5μL siRNA-Mate转染试剂混合，制备体内转染溶液。将转染溶液注射到C57BL/6小鼠的患侧(MCAO的一侧)的脑室，制备冰冻切片，方法同实施例2。将小鼠脑的冷冻切片与PBS中的0.3％TritonX-100和5％山羊血清孵育30min，然后与一抗孵育过夜，然后将二抗在室温孵育4h。一抗是兔抗Phd3(1：200)，二抗是与Cy3缀合的山羊抗兔IgG(1：400)。细胞核用DAPI染色。

免疫荧光结果表明，与对照相比，转染了hsa-miR-451a的靶基因Phd3在蛋白水平表达明显降低(图6)。

实施例10：p53在脑组织中表达水平的检测

hsa-miR-451a模拟物、hsa-miR-451a抑制剂体外转染到C57BL/6小鼠的患侧中，方法如实施例2，利用Trizol法提取细胞的总RNA。提取方法同实施例1，紫外吸收测定法和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度后，利用试剂盒将所提总RNA进行cDNA的合成。

反应体系(20μL)如下：总RNA 100pg-lug，5×逆转录反应缓冲液4μL，10×SuperScript逆转录酶2μL，EDPC水补足到20μL。将上述体系混匀，PCR仪上进行逆转录，反应条件：42℃30min，95℃5min，4℃保存。

再以cDNA为模板，对靶基因进行RT-PCR。反应体系(20ul)如下：2×反应缓冲液10μL，10μM上游引物0.4μL，10μM下游引物0.4μL，cDNA 1μL，DEPC水8.2μL。反应条件：95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环，4℃保存。以β-actin为靶基因的内参对照。

RT-PCR结果表明，与对照相比，hsa-miR-451a注入小鼠大脑后(Phd3水平下调)时，p53水平显着降低，而施用hsa-miR-451a抑制剂(Phd3水平上调)显着提高p53水平(图7)。

上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。