一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法

摘要

本发明公开了一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其通过配制不同pH值标定液，收集标定液的荧光强度信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程，通过将待测红细胞样品中的平均荧光强度代入标准曲线，即可得到待测红细胞内pH值。本发明的方法用于检测红细胞内的pH值具有操作简单、耗时短、检测结果稳定等优点。本发明的利用红细胞自发荧光特性，不需另加或配制荧光染料，建立不同pH环境下与红细胞荧光强度变化的标准曲线，反过来计算出不同荧光强度红细胞内对应的pH值。此方法的pH的精度值能够达到0.01个pH单位，精度高。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法。

背景技术

体液占人体的60％-70％，其中2/3位于细胞内。酸碱度(pH)尤其是细胞内液酸碱度在各种细胞生物学行为中发挥重要调控作用，例如酶活性、细胞增殖与凋亡、信息传递和肿瘤细胞抗药性等，是影响细胞功能的重要微环境指标。

然而，目前临床上的血气分析技术测的是血清中的酸碱度，相当于细胞外液的酸碱度，而对占体液绝大多数的细胞內液的酸碱变化以及细胞内、外液酸碱平衡之间的关系，研究甚少。然而，近年来，人们越来越意识到细胞内环境稳定的重要性，尤其是主要生理功能为携带氧气和二氧化碳，并将其输送到人体的各个组织和器官的红细胞，红细胞内的环境(尤其酸碱)的变化对胞内血红蛋白的结构和功能有着重要的影响，因此对红细胞内影响环境变化的pH值检测与监控尤为重要。而现有的普通细胞内pH检测的手段主要是采用孵育pH敏感的比率型纳米探针，但是红细胞具有自荧光效应，其应用于红细胞胞内pH检测时易受影响，检测误差大。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，耗时短，测量结果稳定的利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法。

本发明的技术方案为：

一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其包括以下步骤：

S1:取全血，进行离心，弃上清，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，进行离心后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体离心后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，进行孵育，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；

S7：根据S6收集的荧光信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程；

S8：按照S1-S4步骤制备将待测红细胞样品，将待测红细胞样品采用流式细胞仪收集的平均荧光强度代入S7方程内计算即可得到待测红细胞内pH值。

进一步地，其包括以下步骤：

S1:取全血，1500rpm离心5min后，弃上清后，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，1500rpm离心5min后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体离心10min后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，在37℃条件下孵育15min，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；

S7：根据S6收集的荧光信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程；

S8：按照S1-S4步骤制备将待测红细胞样品，将待测红细胞样品采用流式细胞仪收集的平均荧光强度代入S7方程内计算即可得到待测红细胞内pH值。

进一步地，所述标定液的配制为：

母液：120mM KCl、30mM NaCl、1mM CaCl

调节液为尼日利亚菌素，其与母液的使用体积配比为1:200，其中尼日利亚菌素为溶于无水乙醇的2mM溶液，其为现配现用。

进一步地，步骤S6中流式细胞仪采用488nm激发，BL3通道(PerCP-Cy5.5)收集荧光信号。

采用上述技术方案，具有的有益效果如下：

本发明的方法用于检测红细胞内的pH值具有操作简单、耗时短、检测结果稳定等优点。本发明的利用红细胞自发荧光特性：红细胞的自发荧光信号与pH值呈线性正相关关系，不需另加或配制荧光染料，通过加入不同的pH值的标定液和样品缓冲液来处理红细胞，使得红细胞内外的pH值相同，在通过对不同pH值的红细胞样品的荧光信号的收集，建立不同pH环境下与红细胞荧光强度变化的标准曲线，反过来计算出不同荧光强度对应的pH值。此方法的pH的精度值能够达到0.01个pH单位，精度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的红细胞荧光强度随pH值变化的标准曲线图。

图2为本发明实施例中标定样品中的红细胞的分布；

图3为本发明实施例中待测红细胞样品中的红细胞的分布；

图4为本发明实施例中红细胞荧光强度直方图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：一种利用红细胞自发荧光检测红细胞内pH值的方法，其包括以下步骤：

S1:取全血50μl，1500rpm离心5min后，弃上清后，得到红细胞；

S2：将步骤S1制备的红细胞用PBS液进行洗涤后，1500rpm离心5min后，弃上清；

S3：将S2弃上清后的悬浮液加入PBS后进行重悬，然后将等量分装在若干个EP管内；

S4：将EP管内的液体，300×g离心10min后，弃上清；

S5：向EP管内加入不同pH值的标定液和样品缓冲液，在37℃条件下孵育15min，配制出不同pH值的红细胞标定液样品；对标定样品中的红细胞的分布进行表征，其表征结果见图2。则图2反映了pH标定液平衡后的红细胞的分布情况，在平衡过程中可能会出现的细胞团聚现象。

S6：将S5样品采用流式细胞仪收集荧光信号；

S7：根据S6收集的荧光信号，绘制出平均荧光强度与pH的标准曲线，得到线性方程，绘制出的标准曲线与拟合线性方程见图1；

S8：按照S1-S4步骤制备将待测红细胞样品，对待测红细胞样品中的红细胞分布进行表征，其表征结果见图3，图3反映样品缓冲液中红细胞的分布情况，将待测红细胞样品采用流式细胞仪收集的平均荧光强度代入S7方程内计算即可得到待测红细胞内pH值，其中采用流式细胞仪检测时样品中的红细胞荧光强度直方图，见图4，图4显示了在红细胞自发荧光所在波段收集的荧光分布，单峰峰形完整，说明在接收范围内发射荧光均一，峰对应横坐标数值即为荧光强度。

其中，标定液的配方如下：

母液：120mM KCl、30mM NaCl、1mM CaCl

调节液为尼日利亚菌素，其与母液的使用体积配比为1:200，其中尼日利亚菌素为溶于无水乙醇的2mM溶液，其为现配现用。

S8中配制出101个待测红细胞样品(样品来源于肾穿患者全血样本)，将其采用流式细胞仪收集的平均荧光强度，并将收集的平均荧光强度代入图1，得到各样品中的红细胞内的pH值，见表一。

表一：待测红细胞样品中红细胞内pH的检测结果

采用本发明能够对红细胞内的pH值做到精确到达0.01pH单位的精度检测，具有操作简单，耗时短，检测结果稳定等优点，所检测出的红细胞内的pH值相比于全血pH值(7.35-7.45)偏低，即为偏酸性。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，上述实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。