用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条及其制备与检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条及其制备与检测方法，属于抗原检测技术领域。试纸条包括底板；底板顶部设有依次相连的样品区、检测区与吸附区；检测区设有测试线与质控线；样品区设有用于检测血清淀粉样蛋白A的探针及样品上样位；探针位于更靠近检测区一侧；探针由有机长余辉发光材料与检测抗体或核酸适配体组成；检测抗体或核酸适配体能与血清淀粉样蛋白A特异性结合。本发明中的有机长余辉发光材料可以发出更长时间和更高亮度的余辉，用于免疫层析试纸条对血清淀粉样蛋白A进行检测时，能轻松被手机等常见电子设备采集分析，甚至可以肉眼观察，极大提高了检测的便利性及拓宽了使用场景，真正做到POCT。

说明书

技术领域

本发明涉及抗原检测技术领域，更具体的说是涉及用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条及其制备与检测方法。

背景技术

血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A，SAA)是由肝脏合成的104个氨基酸构成的蛋白质，是一种急性期蛋白，通常是在高密度脂蛋白颗粒运输的伴随作用中产生的作为载脂蛋白的蛋白质。在“急性期反应”期间，如细菌、病毒、真菌等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应期间，为了对抗组织损伤、感染和创伤的挑战，身体对炎症刺激产生即时反应，血浆中的SAA水平从正常水平1-5mg/L增加到1000-5000mg/L的水平。此外，SAA与淀粉样斑块的形成也有关；淀粉样斑块的形成与许多功能障碍有关，包括阿尔茨海默病和多发性硬化等，这些斑块是截短的不溶性淀粉样纤维积聚的结果，而淀粉样纤维被认为是由许多细胞相关蛋白酶和血清蛋白酶自然发生的SAA分解代谢过程引起的。因此，检测血清中SAA对临床研究具有重大意义。

目前的血清中SAA的检测技术主要包括：比色法(如酶联免疫吸附实验(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条等)、化学发光法(如管式的磁化学发光法和板式的磁化学发光法)、电化学法(循环伏安法和线性扫描伏安法)和荧光法(荧光均相免洗实验)等。上述四类技术都有各自的优缺点，其中ELISA需要专业的操作人员操作且耗时较长；化学发光和电化学发光灵敏度非常高，在大型医院已经实现自动化、高通量、高灵敏的定量检测，但这两种方法目前大多数由国外诊断公司提供技术服务，试剂和全自动化仪器价格昂贵，不适合单人份或小批量检测，尤其是在经济条件落后的基层医院、社区诊所、卫生院等，无法大面积推广使用。而荧光均相免洗检测技术所有试剂都需要4℃冷藏保存，运输成本较高，也限制了其在经济条件落后的基层医院、社区诊所、卫生院等地的使用。

近年来发展了胶体金免疫层析检测技术，其主要以胶体金作为输出信号，由于胶体金探针的光密度不足，导致检测灵敏度较低，且难以定量，无法满足临床检测的要求。随后，荧光探针在免疫层析应用上得到发展，其中基于荧光染料的荧光探针应用最为广泛。荧光染料通常直接标记在抗体或包被抗体的微球上，或包埋于纳米颗粒内再修饰抗体。但是传统荧光染料存在激发光源主要是紫外光且斯托克斯位移较小等缺点，在检测过程中会导致自发的荧光信号干扰(血液或血清样本在紫外光激发下会产生荧光信号)和激发光源光信号的干扰等问题，这些不利因素将严重影响到检测信号的准确性和稳定性。

长余辉发光材料是一类特殊的发光材料，其在去除激发光源后还可以持续长时间的发光。现有技术中，长余辉发光材料的发光寿命通常要大于一百毫秒，其在许多重要领域内均具有重要的应用价值。目前商品化的长余辉发光材料多为稀土或过渡金属掺杂的铝酸盐、硅酸盐、钛酸盐或硫化物等无机长余辉材料。

高温固相合成是制备无机长余辉发光材料最普遍、有效的生产方法。高温有利于获得较好的长余辉发光性能，但高温固相反应条件苛刻、能耗高，材料形貌均匀度也难以控制，且材料的粒径普遍较大。经研磨后筛选可以缩小高温固相法合成材料的粒径，但粒径变小至纳米量级后，材料的发光亮度也会急剧下降；例如，将商业化的微米级无机长余辉发光粉体研磨到100nm量级时，发光亮度会降低两个数量级。此外，无机长余辉发光纳米材料发光性能较弱，需要借助专业设备进行检测，因而限制了其进一步推广和临床辅助应用。

现有技术中可以将无机长余辉发光纳米粒子与血清淀粉样蛋白A的抗体结合制备得到能特异性检测血清淀粉样蛋白A的无机长余辉发光纳米探针，但其发光较弱，无机长余辉发光材料本身的缺陷也限制了血清淀粉样蛋白A检测的灵敏度。因此，如何克服无机长余辉发光材料的缺陷，提供一种用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条及其制备与检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条及其制备与检测方法，解决现有无机长余辉发光探针发光强度低，应用受限的技术问题。

本发明的目的一是为了提供：用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条，包括底板；底板的顶部设有依次相连的样品区、检测区与吸附区；

检测区设有测试线与质控线；样品区设有用于检测血清淀粉样蛋白A的探针；探针由有机长余辉发光材料与检测抗体组成，或由有机长余辉发光材料与核酸适配体组成；检测抗体与核酸适配体均分别能与血清淀粉样蛋白A特异性结合；

所述样品区设有样品上样位；所述探针位于靠近检测区一侧，样品上样位设于远离检测区一侧。

其中，核酸适配体为是一段脱氧核糖核酸或核糖核酸序列，通常是在体外利用指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，适配体与血清淀粉样蛋白A发生特异性的免疫结合。

作为优选地，免疫层析试纸条的检测灵敏度为0.9μg/mL，线性范围为0.9-290μg/mL。

作为优选地，免疫层析试纸条的检测灵敏度为0.5μg/mL，线性范围为0.5-500μg/mL。

在免疫层析试纸条的检测过程中，线性范围的最小值为灵敏度，为能够检测的最大限。本发明的试纸条中选材的不断优化能够进一步实现线性检测的范围扩大。

作为优选地，样品区设有样品垫；检测区设有NC膜；吸附区设有吸水纸；NC膜设于底板的中部，样品垫与吸水纸分别搭设于NC膜的两侧；测试线与质控线平行设置于NC膜上，质控线相较于测试线更靠近吸水纸；样品垫上设有探针上样线，用于检测血清淀粉样蛋白A的探针上样于探针上样线处。传统的样品垫上采用喷金工艺上样，此处的探针上样线只是用于指代试纸条上探针上样的位置，可以是非实体的线。

作为优选地，底板为PVC板。

作为优选地，有机长余辉发光材料与检测抗体或核酸适配体通过羧基-氨基、醛基-氨基或巯基-马来酰胺生物偶联；检测抗体为SAA-Ab

作为优选地，二抗为驴抗鼠IgG、兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG。

作为优选地，二抗为驴抗鼠IgG。

作为优选地，有机长余辉发光材料包括吸光剂、光化学缓存剂、发光剂与纳米载体介质；光化学缓存剂经过加成、重排或断键反应步骤，于吸光剂与发光剂之间进行能量储存和能量交换；纳米载体介质用于负载吸光剂、光化学缓存剂与发光剂。

纳米载体介质的形态实际上取决于载体介质的结构形态或者加工工艺，因此可以直接有利地采用本身为微球状的纳米载体介质来形成有机长余辉发光材料，也可以通过已知的微球形成工艺由非球形的纳米载体介质如聚合物单体来形成有机长余辉发光材料。

作为优选地，纳米载体介质为微球状；所述微球状的纳米载体介质包括核壳结构、水包油结构、油包水结构、介孔结构、中空结构、可溶胀结构等。

作为优选地，微球状的纳米载体介质为中空结构、介孔结构、可溶胀结构或核壳结构。

纳米微球所有的颗粒的形貌和粒径可以通过电子显微镜拍摄图像表征，并且将多次测量得到的纳米微球的平均直径记录为粒径。这样的纳米微球的表征方法是技术人员已知的并且可以例如采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)仪器测得。

作为优选地，光化学缓存剂为不是聚合物的小分子化合物，分子量优选小于2000；更优选为小于1000。不是聚合物的化合物是指化合物不是通过常规的聚合反应得到，优选该化合物中不包含或包含不超过2个的重复单元。

作为优选地，光化学缓存剂由以下物质组成：

其中，

G和T分别为O,S,Se和N中的任意一种；

R

L为羟基、羧基、氨基、巯基、酯基、硝基、磺酸基、卤素、酰胺基，或具有1-50个碳原子的烷基、烯基、炔基、烷氧基和烷氨基中的一种；

R

作为优选地，纳米载体介质为聚苯乙烯微球；吸光剂与发光剂的摩尔比为1:2～10000；光化学缓存剂的质量为吸光剂、光化学缓存剂与发光剂总质量的0.1％～80％；抗体或核酸适配体的质量为探针总质量的1％～20％。

作为优选地，聚苯乙烯微球为表面含有羧基的聚苯乙烯纳米微球，粒径为5nm～1000nm；吸光剂与发光剂的摩尔比为1:10～8000；光化学缓存剂的质量为吸光剂、光化学缓存剂与发光剂总质量的0.3％～60％；抗体或核酸适配体的质量为探针总质量的2％～15％。

作为优选地，表面含有羧基的聚苯乙烯纳米微球的粒径为50nm～800nm；吸光剂与发光剂的摩尔比为1:100～4000；光化学缓存剂的质量为吸光剂、光化学缓存剂与发光剂总质量的0.5％～40％；抗体或核酸适配体的质量为探针总质量的5％～12％。

作为优选地，表面含有羧基的聚苯乙烯纳米微球的粒径为100nm～500nm；吸光剂与发光剂的摩尔比为1:200～2000；光化学缓存剂的质量为吸光剂、光化学缓存剂与发光剂总质量的1％～20％。

作为优选地，发光剂为铱配合物、稀土配合物、并苯类化合物、氟硼二吡咯类化合物，以及其衍生物或共聚物中的至少一种。

在一种优选的方案中，发光剂的结构上修饰有位阻基团或柔性链，以增强聚苯乙烯纳米微球的长余辉发光性能。位阻基团和柔性链以共价键连接的方式修饰在发光剂分子结构的外围。在聚苯乙烯纳米微球中，位阻基团的修饰可以减少发光剂分子之间的聚集，降低聚集淬灭发光的不利影响，对增强发光是有利的；柔性链的增加可以增加发光剂分子在聚苯乙烯纳米微球中的负载量，对增强发光是有利的。位阻基团选自叔丁基、金刚烷基，更优选叔丁基。柔性链选自长链烷基，更优选碳原子个数在4到20的烷基。

作为优选地，吸光剂为卟啉类染料、酞菁类染料、过渡金属配合物、量子点，以及其衍生物或共聚物中的至少一种。

本发明的目的二是为了提供：一种免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S11、将吸光剂、光化学缓存剂与发光剂三种组分分散或溶解于溶剂中，制得混合溶液；将混合溶液均匀分散或吸附至表面含有羧基的聚苯乙烯纳米微球上，制得有机长余辉发光材料；

S12、将步骤S11制得的有机长余辉发光材料均匀分散至pH为7.35～7.44的缓冲液后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHSS)活化，活化反应结束后的中间产物与SAA-Ab

S13、将步骤S12制得的探针溶解后喷涂于样品垫上的探针上样线上，再经干燥后备用；于NC膜的测试线与质控线上分别包被SAA-Ab

作为优选地，步骤S11所述溶剂为苯乙醇-乙二醇和水的混合物、均三甲苯和乙醇的混合物、四氢呋喃或二氯甲烷。

作为优选地，步骤S12所述中间产物与SAA-Ab

作为优选地，步骤S13所述测试线与质控线两线间距为6～10mm。

本发明的目的三是为了提供：检测血清淀粉样蛋白A的方法，包括以下步骤：

S21、将血清淀粉样蛋白A抗原储备液稀释为不同浓度的血清SAA抗原溶液后，上样至免疫层析试纸条上；以激发光(300nm～1000nm)照射免疫层析试纸条(2s～10s)后，关闭激发光；测定测试线与质控线的长余辉发光强度，计算出强度的比值，通过比值与抗原浓度的对应关系建立标准曲线；

S22、将待测血清样本上样至免疫层析试纸条上；以激发光(300nm～1000nm)照射免疫层析试纸条(2s～10s)后，关闭激发光；测定测试线与质控线的长余辉发光强度，计算出强度的比值，通过比值结合步骤S21中绘得的标准曲线，计算得到样品中血清淀粉样蛋白A的浓度。

作为优选地，步骤S21中选用的作为稀释剂的血清为通过罗氏化学发光测定过无SAA阳性反应的血清。

作为优选地，有机长余辉发光材料的发光时间为1s～600s。

作为优选地，有机长余辉发光材料的发光时间为2s～60s。

作为优选地，测定长余辉发光强度使用智能手机、发光成像系统和/或专业长余辉发光检测设备。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于检测血清淀粉样蛋白A的免疫层析试纸条及其制备与检测方法，具有如下有益效果：

不同于现有技术中基于光物理过程的无机长余辉发光材料，本发明的长余辉发光材料是基于有机体系的，该体系利用光化学反应的特性，在光能输入和光能输出之间引入光化学反应，将光物理与化学有机融合。如图3、4所示，在基于该有机体系的长余辉发光材料中，发光过程涉及多种化学物质间的光化学相互作用，其中经过一系列的光化学能量转化与代谢过程，输入的激发光能量最终以发光的形式释放出来，从而实现长余辉发光。能量转化与代谢过程包括能量输入、能量缓存、能量提取、能量转移和能量释放。通过光化学反应使原本非常迅速的光子辐射跃迁进程(纳秒量级至微秒量级)发生改变，能量缓慢释放并最终以光能的形式发射出来，由此获得超长的发光时间(毫秒量级至小时量级)，大大改善了有机分子发光寿命短的限制。

吸光剂和发光剂本身是现有技术已知的，吸光剂通常指能吸收并捕获来自于自然光源或人工光源的光能的物质，吸光剂的选取范围包括传统的光敏试剂和其他能量给体材料等；而发光剂通常指能够将能量最终以光能的形式发射出来的物质，发光剂可以是能够产生荧光或磷光等的发光物质。为了实现本发明的长余辉材料的有益效果，特别是例如改善余辉发光强度和发光时间，在本发明的组合物中对发光剂和吸光剂两个组分做了明确区分，使其各自分别承担吸收光能和释放光能的作用，从而在与经过特定筛选的光化学缓存剂组合之后实现能量输入、能量缓存和能量输出的能量利用路径。这也意味着，在有利的实施方式中，在结构上既具有吸光基团也具有发光基团，同一分子发挥两种功能的化合物不是本发明的发光剂或吸光剂，并且也不会得到本发明的有益技术效果。一方面，这样的化合物等同于把吸光剂与发光剂连同它们的性质一起打包绑定，就无法分别地对长余辉材料的激发和发光性能进行调节，例如当其根据实际的激发充能的需要选取了一个化合物后，材料的发光性质也同时固定了，反之亦然；另一方面，这样的化合物等同于把吸光剂与发光剂的比例固定为例如1:1，无法同时调节吸光程度的强弱和发光水平的高低；而且，同时具备高效吸光功能与高效发光功能的材料相对较少，这就限制了长余辉材料的种类丰富性。

吸光剂与发光剂的选取中，将具有较大的摩尔吸光系数的化合物选取作为吸光剂，例如光敏剂或能量给体染料；将具有更高发光量子效率的化合物选取作为发光剂，例如发光染料。另外，吸光剂的吸收峰与发光剂的发射峰重叠尽可能少，避免发光剂被吸收剂吸收而减弱发光强度。

光化学缓存剂主要用于光化学能量的转化，与主要功能为发光的发光剂不同，缓存剂分子本身不发光或发光很弱，其分子结构中一般不包含能直接发光的基团或共轭结构。本发明的光化学缓存剂在种类上区别于发光剂或吸光剂，尤其是本发明所列的发光剂或吸光剂物质。本发明的光化学缓存剂能够协助参与光化学反应，在发光剂和吸光剂之间构建能量交换和存储的桥梁。在光化学反应中经过加成、重排或断键的反应步骤，激活在能级间跃迁的能量提取过程。

本发明对应各种物质的配比也是非常重要的，因为当吸光剂比例过高时，有机长余辉材料发光被吸光剂吸收，而减弱发光强度。当吸光剂比例过低时，吸收的激发光能量比较有限，也会导致长余辉发光较弱。当光化学缓存剂过少时，能量缓存能力较弱，导致长余辉发光的性能受到限制，例如影响到长余辉发光的稳定性和发光亮度等。缓存剂过多时，则会阻碍各组分之间的碰撞传能，缓存的能量无法有效地传输出去而被耗散掉，使得长余辉发光性能降低。

本发明选择的聚苯乙烯微球可以吸附吸光剂、光化学缓存剂与发光剂，随着聚苯乙烯纳米微球粒径的增大，单个微球中含有吸光剂、光化学缓存剂与发光剂的量增多，增强对免疫层析过程中测试信号的高效检出是有利的；但是粒径太大则不利于微球在试纸条上的侧向层析。为了获得理想的免疫层析检测效果，则要求作为纳米载体介质的聚苯乙烯纳米微球的粒径不可过大，也不可过小。

本发明有机长余辉发光材料的组分配制灵活，可以根据实际需求来设计材料的组成与性质，获得灵活多样的纳米结构，且可剪裁发光性能。充能的激发光波长与长余辉发光的波长可以分别地进行调节，调整吸光剂和发光剂的组合方案，就可高效地实现色彩丰富的长余辉发光。

本发明的有机长余辉发光材料，体系的激发与发射波长容易调控，可以覆盖紫、蓝、绿、黄、红和近红外的光谱区域。通过选取吸光剂或发光剂的种类和必要时适当的结构修饰，使得激发和发射的可操作范围都非常宽，所以实际的激发与发射性质的组合非常丰富。

基于有机体系的长余辉材料不仅能够获得更长时间和更高亮度的余辉，制成有机长余辉发光材料时也不会损失余辉亮度和持续时间，由此特别适用于免疫层析检测技术中。在很多情况中，其余辉亮度甚至可以提高到肉眼可见及以上的水平，长余辉发光信号能够被手机等常见的电子设备采集分析，也极大地扩展了长余辉材料的适用范围。而且本发明的长余辉材料可以从溶液直接加工，制备成有机长余辉发光材料，从而方便地应用于免疫层析试纸条检测领域。长余辉发光的聚苯乙烯纳米颗粒能够为免疫层析检测技术提供完备的材料基础。长余辉发光纳米微球或探针的发光强度越高(或发光亮度越大)，在免疫层析试纸条上产生的发光信号越强，对于免疫层析试纸条中的发光信号检测是有利的。本发明的有机长余辉发光材料也可以直接制备成余辉亮度高的免疫层析纳米探针，可获得稳定性高、重复性好、灵敏度高的用于免疫层析检测的试纸条。

本发明有机长余辉发光材料的长余辉发光亮度更高，超过肉眼可见的亮度水平，可供选择的检测设备更普遍。检测中用于读取发光信号的仪器为智能手机、发光成像系统、专业长余辉发光检测设备等。商业化手机配备有信号读取的软件，可以对手机拍照的图片直接进行信号强度的数据分析。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1合成的粒径为300nm，表面含有羧基的聚苯乙烯纳米微球的透射电镜图；

图2附图为本发明实施例2的有机长余辉发光材料的透射电镜图像；

图3附图为本发明制备的用于检测血清淀粉样蛋白A的探针结构示意图；

图4附图为本发明长余辉发光纳米材料的发光机制示意图；

图5附图为本发明免疫层析试纸条示意图；

其中，1-样品垫；11-探针上样线；2-NC膜；21-测试线；22-质控线；3-吸水纸；4-PVC板；

图6附图为本发明带有探针的免疫层析试纸条检测血清淀粉样蛋白A的标准曲线；

图7附图为本发明实施例6免疫层析试纸条(图7左)与对比例1无机长余辉发光材料的检测体系(图7右)检测灵敏度对比照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的长余辉发光测试中，使用发光二极管(LED)作为激发光源，不同波长激发光源的输出光功率密度保持一致。特定波长的激发光照射样品进行充能，照射充能的时间为3s。充能结束后关闭激光，开始测试发光性能。使用英国爱丁堡仪器公司的荧光光谱仪(Edinburgh FS-5)进行长余辉发光强度的测试。本发明使用商业化智能手机或常见的数码相机拍照，记录明场及长余辉发光图片。

本文使用的短语“肉眼可见”是长余辉发光材料领域的专业名词，意味着材料的发光亮度大于或等于0.32mcd·m

实施例1

作为纳米载体介质的聚苯乙烯纳米微球的制备方法如下：首先取39.3g苯乙烯、2.1g甲基丙烯酸和0.5g十二烷基苯磺酸钠分散到100mL超纯水中，再加入到500mL的三口烧瓶中，通入氮气，温度保持在25℃，持续搅拌30分钟。然后把温度缓慢升到70℃，立即加入0.3g过硫酸钾(溶解在25g超纯水中)，持续反应4小时。反应结束后，用超纯水和乙醇清洗，常温放置备用。此方法制得的聚苯乙烯纳米颗粒表面含有羧基，其扫描电子显微镜图像如图1所示，聚苯乙烯纳米颗粒的粒径为300nm，纳米粒子之间的变异系数<5％。对于该专业领域内的技术人员来说，上述聚苯乙烯纳米的合成及调控方法是容易理解的，通过调节合成原料的加入量可以得到其它不同粒径的聚苯乙烯纳米颗粒。

实施例2

有机长余辉发光材料的制备方法，首先将

制备的具体步骤为：将吸光剂(A

实施例3

参照实施例2重复操作，吸光剂(A

实施例4

有机长余辉发光材料的制备方法，首先将

将吸光剂(A

实施例5

有机长余辉发光材料的制备方法，首先将

将吸光剂(A

实施例6

用于检测血清淀粉样蛋白A的探针、含有探针的侧向层析免疫层析试纸条及制备方法与对样品的定量检测方法。

(1)用于检测血清淀粉样蛋白A(SAA)的探针的制备：

取实施例3制得的有机长余辉发光材料100mg离心，复溶到18mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，充分超声使其分散均匀；向其中分别加入10mg的EDC和2.5mg的NHSS，室温下反应2小时；反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL的pH为7.4的BBS缓冲液中，向其中加入10mg的SAA-Ab

(2)含有探针的侧向层析免疫层析试纸条的制备：

2-1)NC膜2的制备

使用PBS缓冲液(1％的BSA，1％蔗糖)分别将SAA-Ab

2-2)样品垫1的制备：

样品垫1为玻璃纤维材质，是一块完整非拼接的玻璃纤维，一方面在其上可以滴加待检测的样品(位置为远离NC膜2一端)，另一方面在其上可以喷涂用于检测血清淀粉样蛋白A的探针(位置为靠近NC膜2一端)。在制备样品垫1时，还未滴加样品，所以玻璃纤维上远离NC膜2的一端是空白的。而在靠近NC膜2的一端，按照下面的方法喷涂用于检测血清淀粉样蛋白A的探针。

取步骤(1)中制得的用于检测血清淀粉样蛋白A的探针，离心处理，用喷膜缓冲液复溶为50mg/mL，通过喷膜仪将探针溶液倒吸入仪器，以1.2μL cm

2-3)层析免疫层析试纸条的组装：如图5所示，免疫层析试纸条包括样品垫1、NC膜2、吸水纸3与PVC板4；样品垫1为玻璃纤维材质，样品垫1上设有标记了SAA-Ab

NC膜2设于PVC板4的中部；所述样品垫1与吸水纸3分别搭设于NC膜2的两侧；所述用于检测血清淀粉样蛋白A的探针制得溶液于靠近NC膜2一侧线性喷涂于样品垫1上的探针上样线11处；在PVC板4上依次相互交错3mm地贴上样品垫1，NC膜2与吸水纸3。接着将组装好的层析板通过高速斩切机切割成3.8mm宽的试纸条，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条，即得到免疫层析试纸条。

(3)SAA标准曲线的建立：

3-1)使用通过罗氏化学发光测定过无SAA阳性反应的血清将SAA抗原储备液稀释为不同浓度的血清SAA抗原溶液，浓度分别为0μg/mL、0.9μg/mL、9μg/mL、18μg/mL、36μg/mL、72μg/mL、145μg/mL和290μg/mL。

3-2)取2μL血清SAA抗原溶液加入到98μL的PBS缓冲液中(含有1％的BSA、0.1％的SDS和0.1％的B66)，并充分混合。

3-3)将混合均匀的100μL混合液加入到免疫层析试纸条加样孔(位于样品垫上远离NC膜2一端)处，液体会通过毛细作用依次通过样品垫、NC膜和吸水纸。检测样本中含有抗原溶液时，抗原首先与样品垫上的探针结合形成免疫复合物，然后随着液体泳动到测试线21(T线)与SAA-Ab

3-4)反应进行5分钟后，将免疫层析试纸条使用长余辉发光检测仪检测。使用540nm激发光照射，照射时间为3s，停止激发后开始采集试纸条上的长余辉发光信号。通过测定T线和C线的长余辉发光信号的强度，计算出强度的比值，通过比值与抗原浓度的对应关系建立标准曲线，标准曲线如图6所示。

(4)实际样本中SAA的定量检测：

取实际待检测的样本，滴加到试纸条的样品垫1上的样品上样位(位置为远离NC膜2一端)。将样本中测得的发光强度结合步骤(3)中建立的标准曲线，计算得到样本中SAA抗原的浓度。

由标准曲线可知，本发明中含有探针的侧向层析免疫层析试纸条，其最低检测限为0.9μg/mL，其线性区间为0.9-290μg/mL。其最低检测限远低于无机长余辉检测材料，且拥有较宽的线性区间，变异系数CV值小于5％，本发明的探针、免疫层析试纸条以及检测方法均具有很好的检测准确性和可重复性。

稳定性测试

表1稳定性测试

将实施例6制备好的试纸条检测卡在37℃放置8天，每天分别进行灵敏度和线性范围测试，结果如表1所示，检测卡在37℃分别放置1到8天的检测灵敏度和线性范围没有发生任何变化。

实际样本测试

采用本发明实施例6制备的免疫层析试纸条直接测试10份经过医院定值过的血清样本。医院的定量结果与测得结果如表2所示。

表2

由表2可知，本发明制得的免疫层析试纸条直接测试血清样本中血清淀粉样蛋白A的浓度与医院定值非常接近，由此可以看出免疫层析试纸条测试的测试速度快、准确性较高、反应灵敏且使用方便。结果表明，根据本发明制备的长余辉发光免疫层析试纸条具有重大的推广价值。

对比例1

商业化的无机长余辉发光材料的制备：

通过离心分离获得粒径约250nm的SrAl

使用该无机长余辉发光材料按照实施例6方法进行检测体系的构建。在对含有SAA抗原的样本(SAA浓度为36μg/mL)进行检测时发现，经过365nm激发光源照射3s后关闭光源，实施例6免疫层析试纸条(图7左)在检测灵敏度上比基于无机长余辉发光材料的检测体系(图7右)提高了100倍以上，但对检测样品处理要求上没有明显变化。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。