用于同种异体γ/δ-T细胞的扩增和使用的方法和组合物

摘要

本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法。此类方法包括向受试者施用供体来源的同种异体γδ‑T细胞(gamma/delta‑T细胞)。在这样的方法中，向受试者施用淋巴耗竭处理或造血干细胞(HSC)移植物中的至少一种，然后是随后施用供体来源的同种异体γδ‑T细胞。该方法还包括在施用给受试者之前离体扩增供体来源的同种异体γδ‑T细胞。这样的方法包括将供体来源的同种异体γδ‑T细胞暴露于一种或多种γδ‑T细胞扩增化合物。这种疗法在受试者中诱导抗肿瘤应答。

说明书

发明领域

本发明涉及免疫学领域和治疗癌症的方法。

背景技术

与识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的特定肽抗原的经典(常规)αβ-T细胞不同，相比之下，γδ-T细胞(gamma/delta-T细胞)似乎可以识别被由于恶性转化或病毒感染而失调的细胞表达的通用决定簇(Kabelitz D.等人Cancer Res.2007；67(1)：5-8；Silva-Santos B等人，Eur J Immunol.2012；42(12)：3101-5；Vantourout P和HaydayA.Nature Reviews Immunology 2013；13(2)：88-100)。γδ-T细胞具有以无需存在真正的肿瘤特异性抗原的方式，识别和杀死广谱类型的肿瘤细胞的先天能力。因此，需要开发针对多种癌症的靶向γδ-T细胞的治疗策略。

发明概述

本文提供了用于治疗受试者的癌症的方法。此类方法包括向受试者施用供体来源的同种异体γδ-T细胞(gamma/delta-T细胞)。在这样的方法中，向受试者施用至少一种淋巴耗竭处理或造血干细胞(HSC)移植物，然后是后续施用供体来源的同种异体γδ-T细胞。该方法还包括在向受试者施用之前离体扩增供体来源的同种异体γδ-T细胞。这样的方法包括将供体来源的同种异体γδ-T细胞暴露于一种或多种γδ-T细胞扩增化合物。这种疗法在受试者中诱导抗肿瘤应答。还提供了供体来源的同种异体γδ-T细胞在治疗癌症的方法中的用途。

附图说明

图1提供了在各种nM浓度的合成磷酸抗原(phosphoantigen)C-HDMPP中培养21天的离体扩增的供体来源的同种异体γδ-T细胞的流式细胞术分析。

图2显示了用100nM C-HDMPP培养的供体来源的同种异体γδ-T细胞随时间的倍数扩增。

图3证明了离体扩增的人γδ-T细胞针对人肿瘤细胞系的体外抗肿瘤活性。数据显示为以E:T比为25:1的肿瘤细胞裂解。

图4描述了用唑来膦酸(ZOL)预处理肿瘤细胞24小时可以使相对抗性的MDA-MB-231肿瘤细胞对被离体扩增的γδ-T细胞的杀伤更加敏感。数据显示为在指定的E:T比的肿瘤细胞裂解。

图5证明了用唑来膦酸(ZOL)预处理各种不同的肿瘤细胞24小时可以使相对抗性的肿瘤细胞对被离体扩增的γδ-T细胞的杀伤更加敏感。数据显示为在指定的E:T比的肿瘤细胞裂解。

发明详述

在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定的实施方案，其当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限制。

本发明所属领域技术人员将想到本文阐述的本发明的许多修改和其他实施方案，具有前述描述中给出的教导的益处。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但是它们仅在一般性和描述性意义上使用，而不是出于限制的目的。

I.概述

本文提供了使用各种免疫学方法(治疗)来治疗癌症的方法，以使受试者易于接受从其他健康供体的血液中获得的同种异体γδ-T细胞(gamma/delta-T细胞)的后续临床输注。从健康供体获得的同种异体γδ-T细胞的引入旨在替代或增强已在受试者体内丧失功能的杀伤肿瘤或杀灭感染的γδ-T细胞。

如本文所用，“γδ-T细胞”或“gamma/delta-T细胞”是表达由一个γ链和一个δ链组成的T细胞受体的任何T细胞。

II.治疗癌症的方法

本文提供了治疗受试者中的癌症的方法。这样的方法包括首先向受试者施用淋巴耗竭处理或造血干细胞(HSC)移植物，然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞。

通过“治疗”患有癌症的受试者，旨在向患有癌症的受试者施用治疗有效量的至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞，其目的是治愈、愈合、缓和、缓解、改变、补救、改良、改善或影响癌症的状况或者一种或多种症状。

如本文所用，“受试者”是指期望治疗其中癌症的任何动物(即哺乳动物)，例如人、灵长类动物、啮齿动物、农业和家养动物，例如但不限于狗、猫、牛、马、猪、绵羊等。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在具体的实施方案中，受试者是人。

提供治疗有效量的至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞用于本文提供的方法。如本文所用，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”或“有效量”是指为给定的状况和施用方案提供治疗效果的量。因此，短语“治疗有效量”在本文中用来表示足以引起宿主临床上显著状况改善的量。在特定方面，“治疗有效量”是指当施用时供体来源的同种异体γδ-T细胞关于治疗受试者癌症产生积极的治疗应答的量。关于治疗癌症的积极治疗应答包括治愈或改良疾病的症状。在当前情况下，通过癌症的持续或扩散可证明受试者应答的缺陷。受试者中临床上显著状况的改善包括肿瘤尺寸的减小，肿瘤坏死的增加，肿瘤从宿主组织的清除，转移的减少或改良，或与癌症相关的任何症状的减少。

“抗肿瘤应答”是指关于治疗癌症的积极治疗应答，并且包括治愈或改良疾病的症状。受试者中的抗肿瘤应答包括肿瘤尺寸的减小，肿瘤坏死的增加，肿瘤从宿主组织的清除，受试者中抗肿瘤免疫细胞的存在，肿瘤内或附近免疫细胞的存在，转移的减少或改良，或与癌症相关的任何症状的减少。

如本发明所示，离体扩增的同种异体γδ-T细胞显示出广泛的抗肿瘤反应性，并因此可以靶向广泛的肿瘤。本文方法涵盖的癌症类型的非限制性实例包括癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、B细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、脑肿瘤、急性淋巴母细胞白血病和骨癌。在一个实施方案中，癌症包括乳腺癌。在另一个实施方案中，癌症是血液癌。在具体的实施方案中，癌症是B细胞癌。B细胞癌可包括，例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、边缘区淋巴瘤或淋巴浆细胞性淋巴瘤。

A.供体来源的同种异体γδ-T细胞及其扩增

本文提供的方法包括施用供体来源的同种异体γδ-T细胞。与在健康供体中发现的γδ-T细胞相比，在荷瘤宿主中发现的γδ-T细胞的数量似乎显著减少，和/或以多种重要方式受到功能损害。因此，在大多数荷瘤宿主中，γδ-T细胞区室可能被不可逆地破坏或耗尽，这以依赖肿瘤的方式发生。尽管解释这些数值或功能缺陷的机制仍然未知，但潜在的后果却很清楚：鉴于这些缺陷被发现存在于荷瘤宿主的γδ-T细胞区室中，任何依赖于利用自体(即受试者来源的)γδ-细胞的先天抗肿瘤特性的策略最终都将被证明是无效的。

本文提供了使用过继转移的同种异体γδ-T细胞(从其他健康供体获得的细胞)用于恶性疾病的免疫疗法的新方法。如本文所用，“同种异体γδ-T细胞”是指从与打算对其输注的受试者不同的个体获得的γδ-T细胞。确实，该概念的关键在于，与荷瘤宿主中存在的γδ-T细胞相反，从健康供体获得的γδ-T细胞基本上未受损并且将更有效地针对癌细胞。而且，由于供体来源的肿瘤反应性γδ-T细胞可以容易地从几乎所有健康供体获得的外周血中进行离体扩增，因此理论上可以无限量供应高效的肿瘤反应性γδ-T细胞，以便随后(和重复)过继地转移到荷瘤宿主中。如本文所用，“供体来源的”是指从与要对其施用的受试者不同的个体获得的γδ-T细胞。

在一些实施方案中，与接受同种异体γδ-T细胞的受试者相比，同种异体γδ-T细胞的供体为完全的人白细胞抗原(HLA)错配。完全HLA错配是指受试者和供体不共有任何HLA抗原。在其他实施方案中，供体是部分HLA错配。部分HLA错配是指受试者和供体之间至少一种HLA抗原是不同的。在这样的方法中，将针对任何预先形成的抗HLA抗体筛选受试者。如果发现受试者具有针对供体非共有HLA的预先形成的抗HLA抗体，则供体细胞将不用于该受试者。在优选的实施方案中，γδ-T细胞的受试者和供体具有完全的HLA错配。

鉴于任何人(供体或受试者)血液中γδ-T细胞的稀缺性，上述供体来源的同种异体γδ-T细胞的过继转移仅在离体扩增足够大量的首先从健康供体获得的γδ-T细胞后才可行。这些γδ-T细胞一旦从供体中获得，将使用多种不同的方法进行扩增，这些方法包括但不限于我们和其他人先前描述的方法。参见，例如，Lopez RD等人Blood.2000；96(12):3827-37；Bennouna J等人Cancer Immunol Immunother.2008；57(11):1599-609；Bompas E等人ASCO Meeting Abstracts.2006；24(18):2550；Espinosa E等人Journal ofBiological Chemistry.2001；276(21):18337-44；Gertner-Dardenne J等人Blood.2009；Rojas RE,等人Infection&Immunity.2002；70(8):4019-27；Sicard H等人JImmunol.2005；175(8):5471-80；和Squiban PJ等人J Clin Oncol 2007；25(18suppl):3064，其每一个均通过引用整体并入本文。

该概念的关键在于，与荷瘤宿主(即患者)中的γδ-T细胞相反，从健康(同种异体)供体获得的γδ-T细胞实际上确实会扩增，而取自荷瘤患者的γδ-T细胞已经失去了扩增的能力，即使它们扩增，其杀死肿瘤细胞也远不那么有效。而且，由于供体来源的肿瘤反应性γδ-T细胞可以容易地从获自几乎所有健康供体的外周血进行离体扩增，因此理论上可以无限量供应高效的肿瘤反应性γδ-T细胞，以便随后(和重复)过继地转移到荷瘤宿主中。因此，在本文提供的方法中，可以向受试者施用供体来源的同种异体γδ-T细胞至少一次，至少两次，至少三次，至少5次，至少10次，至少20次，或诱导适当的抗肿瘤应答所需的次数。

在本文提供的方法中，通过在向受试者施用γδ-T细胞之前，将γδ-T细胞与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增同种异体的供体来源的γδ-T细胞。“γδ-T细胞扩增化合物”是指诱导或增强γδ-T细胞扩增的任何化合物。在一些情况下，也可以将γδ-T细胞与另外的激活化合物，如例如白介素-2(IL-2)培养。

已经描述了用于人γδ-T细胞的离体扩增的各种方法。这包括但不限于WO1999046365 A1(通过引用全部并入本文)中描述的R.Lopez最初报告的较旧方法，以及US20120107292 A1(通过引用全部并入本文)中最近描述的Nieda的较新方法。实施例1提供了离体γδ-T细胞扩增的示例性方法。

已经开发了各种γδ-T细胞扩增化合物。这包括合成磷酸抗原(BrHPP；Phosphostim，美国专利号7,109,183；美国专利号7,625,879；和美国专利号6,660,723；每个专利均通过引用整体并入本文)，其专门开发用于当将化合物作为药物施用给患者时体内激活内源γδ-T细胞，或作为方式(方法)以离体扩增首先从患者收集到的γδ-T细胞，如Salot所述(美国公开号2005196385A1，通过引用全部并入本文)。具有相同预期临床用途的其他γδ-T细胞扩增化合物的非限制性实例包括：美国专利号7,399,756和EP1408984中描述的合成磷酸抗原C-HDMAPP(“Picostim”)；C-HDMAPP的多晶型(WO2010029062)；和“Mayoly”(US8017596B2)，各自通过引用将其全部内容并入本文。另外，在本文提供的方法中，氨基双膦酸盐例如帕米膦酸盐(Aredia)或唑来膦酸盐(Zometa)，也称为唑来膦酸，也可以用于扩增γδ-T细胞。

氨基双膦酸盐间接作用于γδ-T细胞，其通过使PBMC培养物中的旁观者细胞释放异戊烯基焦磷酸(IPP)到培养物中，继而诱导γδ-T细胞的扩增。这可能导致高度可变、低效且不可预测的γδ-T细胞扩增。相反，合成的磷酸抗原，例如C-HDMAPP，直接作用于γδ-T细胞，从而实现精确的浓度优化和γδ-T细胞的可预测扩增。在一个实施方案中，γδ-T细胞扩增化合物包含合成的磷酸抗原。在具体的实施方案中，合成的磷酸抗原是C-HDMAPP。

在一些实施方案中，γδ-T细胞扩增化合物可以与其他化合物组合使用。当与一种或多种γδ-T细胞扩增化合物组合使用时，此类其他化合物可增强γδ-T细胞的扩增。其他化合物在其离体扩增过程中可以增强γδ-T细胞的存活。另外的其他化合物可以在引入人后，增强γδ-T细胞的体内存活。再另外的其他化合物可以促进γδ-T细胞的不同功能表型的优先生长，这些功能表型杀死肿瘤的能力更强，或者鉴于特定的归巢受体的优先上调更有能力归巢到组织内的肿瘤部位。

在一个实施方案中，通过将γδ-T细胞与至少一种磷酸抗原和抗CD277抗体培养来离体扩增供体来源的同种异体γδ-T细胞。抗CD277抗体可以是任何抗CD277抗体，包括但不限于美国申请公开号2015/0353643中描述的抗CD277抗体，例如20.1抗体，该申请通过引用整体并入本文。

在其他实施方案中，通过将γδ-T细胞与至少一种磷酸抗原和以下一种或多种培养来离体扩增供体来源的同种异体γδ-T细胞：细胞因子，包括但不限于白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15、IL-17、IL-33及其合成激动剂；免疫检查点抑制剂，包括例如检查点抑制剂抗体，包括但不限于美国申请公开号2015/0353643中所述的抗CD277 20.1抗体，抗PD-1抗体，抗PDL1抗体，抗CTLA4抗体，针对LAG3的抗体，针对TIM-3的抗体，抗半乳糖凝集素9抗体，抗IDO抗体和抗VISTA抗体；“表观遗传修饰剂”包括但不限于地西他滨(低甲基化剂)和氮杂胞苷(低甲基化剂)和维生素C；mTOR抑制剂包括但不限于雷帕霉素(又名西罗莫司)和依维莫司；以及其他各种添加剂，包括但不限于对TGF-β的抗体；前列腺素E

在一个实施方案中，将供体来源的同种异体γδ-T细胞与白介素2(IL-2)培养。在另一个实施方案中，在向受试者施用γδ-T细胞之前，将供体来源的同种异体γδ-T细胞与一种或多种检查点抑制剂培养。在具体的实施方案中，一种或多种检查点抑制剂包括抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、和抗半乳凝素9抗体、抗-IDO抗体和/或抗VISTA抗体。

在另一个实施方案中，在向受试者施用γδ-T细胞之前，将供体来源的同种异体T细胞与IL-15、抗CD277抗体、抗TGF-β抗体、前列腺素E

上述化合物或方法的开发未曾用于从健康供体获得的同种异体γδ-T细胞的离体扩增并以随后将这些细胞转移至受试者中为目的，如本文提供的治疗方法中所提供的那样。

肿瘤微环境(TME)能够抑制包括γδ-T细胞在内的肿瘤浸润淋巴细胞的功能，从而可以导致抗肿瘤免疫应答的丧失或减弱。特别是对于基于细胞的免疫疗法，克服这一TME介导的免疫抑制作用仍然是一个主要挑战。可以在扩增后修饰γδ-T细胞以直接或间接破坏或抑制TME内的特定免疫抑制途径。多种方法，例如但不限于基因编辑例如使用CRISPR技术进行，以使γδ-T细胞对TME介导的免疫抑制产生抗性；破坏响应TME内可溶性免疫抑制因子的γδ-T细胞上的受体；或通过破坏与TME内各种细胞上存在的接触依赖因子结合的γδ-T细胞上的受体/配体。非限制性实例包括破坏TGF-β或PD-1的受体。B.扩增的同种异体的供体来源的γδ-T细胞的过继转移

本文提供的治疗癌症的方法需要通过进行初始的免疫学操作或治疗使受试者易于接受同种异体的供体来源的γδ-T细胞。使受试者易于接受供体来源的同种异体T细胞的手段包括但不限于，使用首先从合适的骨髓供体获得的HSC进行同种异体造血干细胞(HSC)移植或通过淋巴耗竭处理的淋巴耗竭。没有这些最初的免疫学操作(治疗)，供体来源的γδ-T细胞将立即被受试者排斥。

本文提供了两种截然不同但又相关的免疫学策略/平台，以特定地允许肿瘤反应性γδ-T细胞从健康供体过继转移到荷瘤宿主(受试者)中。

1.造血干细胞(HSC)移植平台

用于通过过继转移供体来源的同种异体γδ-T细胞以用于本文提供的方法来进行癌症后续治疗的第一个平台包括在施用供体来源的同种异体γδ-T细胞之前向受试者施用造血干细胞(HSC)移植物。如本文所用，“造血干细胞(HSC)移植”是指多能造血干细胞的移植。造血干细胞可以源自例如骨髓、外周血或脐带血。

在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括首先向受试者施用造血干细胞(HSC)移植物。在这种方法中，然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞。在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过与至少一种γδ--T细胞扩增化合物一起培养来离体扩增在这类方法中使用的γδ-T细胞。这样，治疗诱导在受试者中的抗肿瘤应答。

本文还提供了供体来源的同种异体γδ-T细胞在治疗癌症的方法中的用途。所述用途包括首先向受试者施用造血干细胞(HSC)移植物；并且，然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞，其中，在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过将γδ-T细胞与至少一种γδ-T细胞扩增化合物一起培养来离体扩增γδ-T细胞。在这样的用途中，治疗导致受试者中的抗肿瘤应答。

在另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括首先向受试者施用造血干细胞(HSC)移植物。在这种方法中，然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞和至少一个剂量的治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法的组合疗法。在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过与至少一种γδ-T细胞扩增化合物一起培养来离体扩增在这类方法中使用的γδ-T细胞。

在另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括首先向受试者施用造血干细胞(HSC)移植物。在这种方法中，然后向受试者施用至少一个剂量供体来源的同种异体γδ-T细胞。在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过与至少一种磷酸抗原和抗CD277抗体培养来离体扩增这类方法中使用的γδ-T细胞。

在常规的HSC移植中，通过作为移植条件化的一部分递送的高剂量化疗和/或放射来提供抗肿瘤作用。但是，还明显的是继发性非特异性免疫介导的移植物抗肿瘤作用也有助于疾病控制。尽管对此发生的机理尚不十分了解，但很明显，在所选疾病的同种异体HSC移植的背景下，有能力的供体来源的(同种异体)免疫效应细胞在移植物抗肿瘤作用中起着关键作用。

实际上，考虑到供体来源的免疫的强大抗肿瘤作用，在某些疾病中，同种异体HSC移植后为了诱导(促进)或维持移植后的缓解而递送供体淋巴细胞输注(DLI)并不少见。然而，这通常是通过引入主要包含αβ-T细胞的供体来源的外周血淋巴细胞的粗制的、未分级的制备物来进行的。因此，并非意外地，这种操作通常导致接受者中有时威胁生命的移植物抗宿主病(GVHD)的形成(15)。

鉴于γδ-T细胞具有强大的先天抗肿瘤特性并且其不能引起GVHD，因此在同种异体HSC移植后，以高度纯化的γδ-T细胞供体淋巴细胞输注(γδ-T细胞DLI)施用的供体来源的同种异体γδ-T细胞是在这种情况下要引入的理想细胞。

从本质上讲，同种异体HSC移植程序本身将转变为支持性角色，充当随后过继转移肿瘤反应性、供体来源的同种异体γδ-T细胞(γδ-T细胞DLI)的治疗平台。

2.淋巴耗竭平台

用于通过供体来源的同种异体γδ-T细胞的过继转移以用于本文提供的方法来进行随后的癌症治疗的第二平台包括在施用供体来源的同种异体γδ-T细胞之前，对受试者施用淋巴耗竭处理。

通过使用包括但不限于施用化疗或其他化学化合物以及暴露于放射在内的多种治疗，对受试者进行有意的免疫抑制，可以使受试者短暂地易于接受保留有效抗肿瘤特性的供体来源的异体γδ-T细胞。

如本文所用，“淋巴细胞耗竭”是指受试者中淋巴细胞的耗竭。淋巴耗竭可以是受试者中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的淋巴细胞的耗竭。“淋巴细胞”是指属于免疫系统的部分的一种白细胞类型。淋巴细胞可以包括例如各种类型的B细胞、T细胞或自然杀伤(NK)细胞。淋巴耗竭可以通过施用至少一种淋巴耗竭处理来完成。如本文所用，“淋巴耗竭处理”是导致受试者中淋巴耗竭的任何处理。淋巴耗竭处理包括但不限于例如甲基强的松龙、放射、低剂量全身照射、依托泊苷、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、长春新碱、硼替佐米、奥沙利铂或任何淋巴耗竭性的化疗剂，包括环磷酰胺、氟达拉滨或美法仑。在一个实施方案中，淋巴耗竭处理包括施用一种或多种化疗剂。在特定的实施方案中，化疗剂包括环磷酰胺、氟达拉滨或美法仑。在另一个实施方案中，淋巴耗竭处理包括低剂量全身照射。

尽管上面描述的HSC移植平台显然是合乎逻辑的，但从临床角度来看，这种要求进行同种异体HSC移植的方法可能不适用于许多受试者。因此，开发了具有潜在地大得多的临床应用性的第二个平台，即淋巴耗竭。

淋巴耗竭平台在递送同种异体γδ-T细胞之前建立短暂的而非永久的供体-宿主免疫耐受，因此无需进行异体HSC移植。

淋巴耗竭平台设计为容纳过继转移的供体来源的同种异体γδ-T细胞的最终排斥。在(短暂的)经淋巴耗竭的宿主中，过继转移的同种异体γδ-T细胞仍将能够介导抗肿瘤作用，特别是当以周期性和重复的方式递送时。

在动物模型的前期研究中，我们已经确定可以建立机会的功能性窗口，其中过继转移的同种异体γδ-T细胞可以介导在淋巴耗竭的荷瘤宿主中可测量到的抗肿瘤作用。以临床相关的方式，可以使用例如环磷酰胺来创造这种机会的功能性窗口，环磷酰胺是既具有免疫抑制性(即淋巴耗竭)又在某些情况下对多种癌症有效的药物。

在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括首先向受试者施用淋巴耗竭处理。在这种方法中，随后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞。在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增在这类方法中使用的γδ-T细胞。

本文还提供了供体来源的同种异体γδ-T细胞在治疗癌症的方法中的用途。所述用途包括向所述受试者施用至少一种淋巴耗竭处理；并且然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞，其中在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过将γδ-T细胞与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增γδ-T细胞。在这样的用途中，治疗导致受试者中的抗肿瘤应答。

在另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括首先向受试者施用淋巴耗竭处理。在这样的方法中，受试者随后施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞和至少一个剂量的治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法的组合疗法。在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增在这样的方法中使用的γδ-T细胞。这样，组合疗法在受试者中诱导抗肿瘤应答。

在另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括首先向受试者施用淋巴耗竭处理。在这样的方法中，然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞中。在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过与至少一种磷酸抗原和抗CD277抗体培养来离体扩增在这样的方法中使用的γδ-T细胞。

在所有上述实施方案中，用于选择适合于在给定的患者中使用的供体细胞产物的特定策略可涉及针对人类白细胞抗原(HLA)类型(包括I和II类)筛选供体和患者，其中从每个供体生成的细胞产物(其可以大量生产并然后以单剂量单位冷冻保存)根据HLA充分表征；和/或针对抗HLA抗体筛选患者，其使用例如标准的基于Luminex的测定法。用于选择在给定患者中使用的相容的供体来源的γδ-T细胞产物的一个策略包括如果供体来源的细胞产物与患者没有共有HLA和/或如果患者没有针对供体(细胞产物)非共有HLA的抗HLA抗体，将用于给定患者的来源于供体的细胞产物鉴定为“合适的”或“相容的”，以避免对供体细胞的抗体介导的(体液)立即排斥。

淋巴耗竭处理将允许来自HLA错配供体的γδ-T细胞被暂时接受。这将通过对宿主的细胞免疫应答的阻遏而发生，否则其将识别并立即排斥HLA错配的γδ-T细胞。因为筛选的受试者不存在针对所选择供体的抗HLA抗体，不会发生对供体γδ-T细胞的体液(抗体介导的)排斥。因此，淋巴耗竭状态只会是暂时的，而受试者将最终恢复免疫功能并排斥给定的HLA错配供体的γδ-T细胞。然而，本发明的方法仅要求HLA错配γδ-T细胞存在足够长的时间，使其能够在排斥前杀死肿瘤细胞。

排斥供体来源的同种异体γδ-T细胞后，可以重复进行淋巴耗竭处理，然后施用同种异体的供体来源的γδ-T细胞。在这样的方法中，将再次向受试者施用淋巴耗竭处理，但是所施用的γδ-T细胞将来自不同的HLA错配供体。在一些实施方案中，受试者和第二γδ-T细胞供体将具有完全或部分HLA错配。淋巴耗竭和供体来源的同种异体γδ-T细胞的施用的循环可重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或更多次。在这种方法中，每个后续供体也不会与任何先前的供体共有HLA。

在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用至少一种淋巴耗竭处理；以及，然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞，其中在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过将γδ-T细胞与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增γδ-T细胞，其中该方法重复一次或多次并且其中用于每次后续施用的供体来源的γδ-T细胞来自与受试者和之前的一个或多个供体相比具有完全HLA错配的不同供体。

可以通过创建源自HLA类型不常见的个体的γδ-T细胞集合来生成γδ-T细胞库，该库使患者具有可用的相容细胞产物的几率最大化，这增加了任何给定患者不与任何给定的供体共有HLA的几率。γδ-T细胞库还可以包含已经针对其对一组人类肿瘤细胞系的体外抗肿瘤活性进行过预筛选的γδ-T细胞。尽管γδ-T细胞将显示出对大多数肿瘤细胞系的杀伤力，但来自某些供体的细胞可能对某些类别的癌症甚至特定类型的癌症更为有效。在一个实施方案中，提供了一种从γδ-T细胞库中选择γδ-T细胞以用于治疗受试者中的癌症的方法。该选择方法包括从具有与受试者的HLA完全错配的特定HLA类型的供体中选择γδ-T细胞。在一些实施方案中，与用于同一受试者的任何先前供体的HLA相比，所选择的γδ-T细胞的HLA类型是完全HLA错配。该选择方法还可以包括选择对正在治疗的癌症类型高度有效的γδ-T细胞。

C.单克隆抗体疗法

在一些实施方案中，供体来源的同种异体γδ-T细胞作为组合疗法施用，所述组合疗法包括治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法。各种抗体可用于本文提供的治疗癌症的方法中。可以使用本领域技术人员已知的任何抗体产生方法来产生本文公开的和用于本文提供的方法的各种抗体。

术语“抗体”以最广义使用并且涵盖完全组装的抗体、可以结合抗原的抗体片段(例如Fab、F(ab')

“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人(1995)ProteinEng.10：1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点，具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，例如由B细胞的克隆群体产生的抗体，并且不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。

例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法或其变型来制备。通常，用含有抗原的溶液免疫小鼠。可以通过将含抗原的溶液在盐水(优选地在佐剂例如弗氏完全佐剂中)中混合或乳化，并经肠胃外注射混合物或乳剂来进行免疫。本领域已知的任何免疫方法均可用于获得单克隆抗体。免疫动物后，将脾脏(以及可选的几个大淋巴结)移除并解离为单个细胞。可以通过将细胞悬浮液施加到用目标抗原包被的平板或孔上来筛选脾细胞。表达对抗原具有特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合并不会被冲洗掉。然后诱导所得的B细胞或所有解离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并在选择性培养基中培养。通过连续稀释将得到的细胞铺板，并测定特异性结合目标抗原(并且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或在体内(如小鼠中腹水)培养所选的分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。

可替代地，可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体(参见，例如，美国专利号4,816,567)。单克隆抗体也可以使用例如Clackson等人，(1991)Nature 352:624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597；和美国专利号5,514,548中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

“表位”是指抗原分子的部分，针对其产生抗体并且抗体与之结合。表位可包含线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式一个接一个地序贯排列)，非线性氨基酸残基(在本文中称为“非线性表位”-这些表位未序贯排列)，或线性和非线性氨基酸残基两者。

另外，本文所用的术语“抗体”涵盖嵌合的和人源化的单克隆抗体。“嵌合的”抗体意指最优选地使用重组脱氧核糖核酸技术衍生的抗体，并且其包含人(包括免疫学上“相关”的物种，例如黑猩猩)和非人组分。因此，嵌合抗体的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同；嵌合抗体的可变区最优选地源自非人来源并具有所需的抗原特异性。非人类来源可以是可用于生成针对肿瘤抗原或包含肿瘤抗原多肽的材料的抗体的任何脊椎动物来源。这样的非人类来源包括但不限于啮齿动物(例如，兔、大鼠、小鼠等；参见，例如，美国专利号4,816,567)和非人类的灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等；参见，例如，美国专利号5,750,105和5,756,096)。

在一些实施方案中，单克隆抗体疗法包含人源化抗体。“人源化”是指含有源自非人类免疫球蛋白序列的最小序列的抗体形式。因此，此类“人源化”抗体可包括其中实质上少于完整人可变结构域已被来自非人类物种的相应序列取代的抗体。

根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几个可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。不同的同种型具有不同的效应器功能。例如，IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。

在本文提供的方法中使用的单克隆抗体可以是各种抗体类别中的任何一种。在一个实施方案中，单克隆抗体是IgG类抗体。在其它实施方案中，单克隆抗体可以是IgM、IgE、IgD或IgA类。在特定实施方案中，抗体是IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

用于本文所提供方法中的单克隆抗体可识别任何抗原。在一些实施方案中，单克隆抗体识别肿瘤抗原。任何已知的治疗性单克隆抗体均可用于本文提供的组合疗法。

例如，本领域已知针对CD20的治疗性抗体用于治疗各种类型的B细胞恶性肿瘤，并且包括例如利妥昔单抗(Rituxan)(参见例如Weiner，GJ.(2010)Semin Hematol.47(2):115-123)。在一个实施方案中，单克隆抗体包括CD20抗体。在特定实施方案中，单克隆抗体疗法包括利妥昔单抗。

在另一非限制性实例中，针对HER-2的治疗性抗体(例如赫赛汀(曲妥珠单抗))是本领域已知的并且用于治疗乳腺癌(参见例如Capietto AH等人(2011)J Immunol.187(2):1031-8)。在一个实施方案中，单克隆抗体包括HER-2抗体。在具体实施方案中，单克隆抗体疗法是赫赛汀(曲妥珠单抗)。

另一个非限制性实例包括检查点抑制剂抗体，包括但不限于纳武单抗(nivolumab，Opdivo)、派姆单抗(pembrolizuma，Keytruda)或伊匹单抗(ipilimumab，Yervoy)。

在一些实施方案中，可以施用多于一种单克隆抗体疗法。在特定实施方案中，可以向受试者施用两种或更多种单克隆抗体疗法。

在另一实施方案中，治疗抗体可以是三抗体。三抗体是指多功能抗体衍生物。三抗体可以包括抗原结合结构域和/或效应结构域，包括但不限于免疫毒素、免疫细胞因子、酶功能或任何功能结构域。在一个实施方案中，三抗体包括一个或多个效应结构域，它们增强γδ-T细胞的抗肿瘤活性。在另一实施方案中，三抗体包括对一个或多个肿瘤抗原具有特异性的一个或多个抗原结合结构域。在具体实施方案中，三抗体包括结合HER2的一个或多个抗原结合结构域和CD16结合结构域，包括但不限于Oberg等人(2018)Front.Immunol.9:814中描述的[(HER2)2xCD16]三抗体，通过引用将其全部并入本文。

D.组合疗法

本文提供的方法可包括供体来源的同种异体的γδ-T细胞和一种或多种治疗剂的组合疗法。术语“组合”或“组合疗法”以其最广泛的含义使用并且表示用至少接受两种治疗方案治疗受试者。只要这些治疗方案的组合的有益效果得到实现，不同治疗方案的施用时机可以有所变化。用供体来源的同种异体的γδ-T细胞与一种或多种治疗剂组合的治疗可以是同时的(并发)、连续的(序贯)或其组合。因此，经历组合疗法的受试者可以在相同时间(即，同时)或在不同时间(即序贯地，在同一天或不同天以任一顺序)接受供体来源的同种异体的γδ-T细胞和一种或多种治疗剂两者，只要在经历疗法的受试者中引起两者组合的治疗效果。如果同时施用供体来源的同种异体的γδ-T细胞或一种或多种治疗剂，则它们可以作为分别的药物组合物进行施用，每个药物组合物包括供体来源的同种异体γδ-T细胞或治疗剂，或可作为包括这些药剂两者的单一药物组合物进行施用。在一些实施方案中，在施用供体来源的同种异体的γδ-T细胞之前，作为预处理施用一种或多种治疗剂。可以在施用供体来源的同种异体的γδ-T细胞之前至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或更多，向受试者施用一种或多种治疗剂。

本文提供的组合疗法也可以间歇地实现。“间歇组合疗法”是指用供体来源的同种异体的γδ-T细胞和一种或多种治疗剂进行一段时间的组合疗法，然后是一段时间的停药，然后是用供体来源的同种异体γδ-T细胞和一种或多种治疗剂进行另一段时间的组合疗法，等等。

在本文提供的方法中，供体来源的同种异体γδ-T细胞可与一种或多种治疗剂组合以增强γδ-T细胞的体内杀伤活性和/或归巢能力。因此，肿瘤，包括对治疗具有相对抗性的肿瘤，可对被γδ-T细胞的杀伤敏感。γδ-T细胞增敏剂包括但不限于化疗剂，包括依托泊苷、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、长春新碱、硼替佐米和奥沙利铂；小分子，包括依鲁替尼(ibrutinib)；治疗性抗体，包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、纳武单抗、派姆单抗和伊匹单抗；或氨基双膦酸盐，包括唑来膦酸。在一个实施方案中，本文提供的方法还包括向受试者施用依托泊苷、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、长春新碱、硼替佐米、奥沙利铂或依鲁替尼中的一种或多种。

本文提供的方法包括在施用供体来源的同种异体γδ-T细胞之前用氨基双膦酸盐对受试者进行预处理。如本文别处所述，氨基双膦酸盐(例如唑来膦酸)可通过引起旁观者细胞释放异戊烯焦磷酸(IPP)间接作用于γδ-T细胞。这是因为在旁观者细胞中，唑来膦酸抑制法尼基焦磷酸合酶(FPPS)，该酶是甲羟戊酸生物合成途径中的一种关键酶。该途径的破坏导致IPP的积累，最终从细胞释放，然后进而刺激γδ-T细胞。肿瘤细胞暴露于氨基双膦酸盐(如唑来膦酸)也可以释放IPP和相关的磷酸抗原。由于肿瘤细胞在其失调状态下已经优先地产生IPP，因此氨基双膦酸盐的作用甚至更大。正是这种首先暴露于氨基双膦酸盐的肿瘤细胞对IPP的增强释放使这些细胞对被γδ-T细胞的杀伤更敏感。此外，这种IPP可以作为γδ-T细胞的化学引诱剂，使它们在体内更有效。在一个实施方案中，治疗癌症的方法还包括在施用供体来源的同种异体γδ-T细胞之前向受试者施用氨基双膦酸盐。在具体实施方案中，氨基双膦酸盐为唑来膦酸。

供体来源的同种异体γδ-T细胞也可作为与其他细胞疗法的组合疗法施用，以增强抗肿瘤活性。供体来源的同种异体γδ-T细胞可与任何数量的其他细胞类型同时或序贯地施用，其他细胞类型包括但不限于Vδ1种类的γδ-T细胞，或非Vδ2的任何γδ-T细胞亚群；NK细胞；或CAR-T细胞(αβ-T细胞或γδ-T细胞衍生的)。在一个实施方案中，本文提供的方法还包括施用一种或多种另外的细胞疗法。在一些方法中，一种或多种另外的细胞疗法来自与γδ-T细胞相同的同种异体供体。

如本文其他地方所述，本文提供的方法可包括供体来源的同种异体γδ-T细胞与单克隆抗体疗法的组合疗法，该疗法允许在癌症受试者中靶向杀死肿瘤细胞。在这种方法中，针对表面肿瘤抗原的单克隆抗体可以将供体来源的同种异体γδ-T细胞重新定向至肿瘤。尽管γδ-T细胞具有独立于ADCC的先天性抗肿瘤活性，但用至少一种γδ-T细胞扩增化合物(即本文提供的各种γδ-T细胞扩增化合物中的任何一种)活化γδ-T细胞可以上调Fc受体的表达，从而使γδ-T细胞更有可能与抗体的Fc部分结合。这样，组合疗法可以通过将γδ-T细胞特异性地引导至肿瘤靶标来增强由治疗性抗体介导的ADCC。参见，例如，Gertner-Dardenne J等人(2009)Blood.113:4875-4884；和Capietto AH等人(2011)J.Immunol.187(2):1031-8；它们的每一个都通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，本文提供的方法进一步包括向受试者施用至少一个剂量的治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法。在特定的实施方案中，单克隆抗体识别肿瘤抗原。

在一个实施方案中，提供了一种用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用至少一种淋巴耗竭处理；并然后，向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞和至少一个剂量的治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法的组合疗法，其中在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过将γδ-T细胞与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增γδ-T细胞；其中组合疗法在受试者中导致抗肿瘤应答。在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用造血干细胞(HSC)移植；并然后向受试者施用至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞和至少一个剂量的治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法的组合疗法，其中在向受试者施用γδ-T细胞之前，通过将γδ-T细胞与至少一种γδ-T细胞扩增化合物培养来离体扩增γδ-T细胞；其中组合疗法在受试者中导致抗肿瘤应答。

在一些实施方案中，供体来源的同种异体γδ-T细胞和单克隆抗体疗法的组合疗法产生的抗肿瘤应答大于单独用供体来源的同种异体γδ-T疗法或单克隆抗体疗法所观察到的抗肿瘤应答。“大于”是指与单独的γδ-T细胞疗法或单克隆抗体疗法相比，组合疗法导致抗肿瘤应答的统计学显著增加。组合疗法的抗肿瘤应答可以是与单独的γδ-T细胞疗法或单克隆抗体疗法的抗肿瘤应答相比，至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高的任何统计学上显著的增加。

在其他实施方案中，至少一个剂量的供体来源的同种异体γδ-T细胞和至少一个剂量的治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法的组合疗法诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一个具体的实施方案中，同时向受试者施用供体来源的同种异体γδ-T细胞和治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法。在另一个具体的实施方案中，在不同的时间向受试者施用供体来源的同种异体γδ-T细胞和治疗有效量的至少一种单克隆抗体疗法。

在进一步的实施方案中，受试者是哺乳动物。在另外的实施方案中，受试者是人。

也可以在向受试者施用γδ-T细胞之前用单克隆抗体预先包被本文提供的离体扩增的供体来源的同种异体γδ-T细胞。在这种方法中，将γδ-T细胞与抗体一起培养以使γδ-T细胞上的Fc受体与抗体的Fc部分结合，以随后施用给受试者。可以将γδ-T细胞和抗体培养至少1hr、至少2hr、至少4hr、至少6hr、至少8hr、至少10hr、至少12hr、至少18hr、至少24hr、至少48hr或更长时间，只要γδ-T细胞已结合抗体即可。用于测量抗体与γδ-T细胞上的Fc受体的结合的测定法是本领域已知的并且包括例如流式细胞术、放射性配体结合测定法、荧光测量结合测定法或比色结合测定法。

在一些实施方案中，可以在癌症的治疗过程中向受试者多次施用抗体包被的γδ-T细胞。在其他实施方案中，接受抗体包被的γδ-T细胞的受试者也可以接受如本文提供的供体来源的同种异体γδ-T细胞、单克隆抗体疗法和/或供体来源的同种异体γδ-T细胞和单克隆抗体疗法的组合的施用。

III.施用方法

本文提供的治疗癌症的方法可包括通过任何肠胃外途径施用治疗，包括但不限于肌内、腹膜内、静脉内等。

此外，如本文所用，“药学上可接受的载体”是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于0.01-0.1M或0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。另外，这样的药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂(collating agent)、惰性气体等。

控释或缓释组合物包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本文还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包被的颗粒组合物以及与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体偶联或与组织特异性受体的配体偶联的化合物。本文提出的组合物的其他实施方案包含颗粒形式的保护性涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂，用于各种施用途径，包括肠胃外、经肺、经鼻和经口。

施用时，化合物通常会被从粘膜表面或循环中迅速清除并因此可能引起相对较短的药理活性。因此，可能需要频繁施用相对大剂量的生物活性化合物以维持治疗功效。已知通过共价附着水溶性聚合物(例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸)的修饰的化合物在静脉内注射后在血液中的半衰期要显著长于相应的未修饰的化合物(Abuchowski等人，1981；Newmark等人，1982；和Katre等人，1987)。此类修饰还可增加化合物在水溶液中的溶解度，消除聚集，增强化合物的物理和化学稳定性，并大大降低化合物的免疫原性和反应性。结果，可以通过比未经修饰的化合物更低频次地或以更低的剂量施用这种聚合物-化合物外展物来实现期望的体内生物活性。

抗体疗法的剂量。足够的量可以包括但不限于约1μg/kg至约100μg/kg，约100μg/kg至约1mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约10mg/kg至约100mg/kg，约100mg/kg至约500mg/kg或约500mg/kg至约1000mg/kg。该量可以是10mg/kg。组合物的药学上可接受的形式包括药学上可接受的载体。

包含活性组分的治疗性组合物的制备在本领域中是众所周知的。通常，将这样的组合物制备为递送至鼻咽的多肽的气雾剂或作为可注射剂，以液体溶液或悬浮液，但是，也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。该制备物也可以被乳化。活性治疗成分通常与药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，组合物可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，它们可以提高活性成分的有效性。

可以将活性成分以中和的药学上可接受的盐形式配制成治疗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)，其与无机酸形成，例如盐酸或磷酸，或与有机酸形成例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，如例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。

本文提供的治疗组合物的一种或多种组分可以肠胃外，经粘膜地例如经口、经鼻、经肺、或经直肠，或经皮地引入。优选地，施用是肠胃外的，例如经由静脉内注射，并且还包括但不限于微动脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。当用于本文中提供的治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为人的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的计算为产生所需的治疗效果的活性物质以及联合的所需的稀释剂；即载体或媒介物。

在另一个实施方案中，活性化合物可以在囊泡，特别是脂质体中递送(参见Langer(1990)Science 249:1527-1533；Treat等人,于Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同上,pp.317-327；一般参见同上)。

在又一个实施方案中，治疗化合物可以在控释系统中递送。例如，可以使用静脉内输注、可植入的渗透泵、经皮贴剂、脂质体或其他施用方式来施用治疗组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，见上文；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等人(1980)Surgery 88:507；Saudek等人(1989)N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也参见Levy等人(1985)Science 228:190；During等人(1989)Ann.Neurol.25:351；Howard等人(1989)J.Neurosurg.71:105)。在又一个实施方案中，可将控释系统放置在治疗靶标即肿瘤附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,于Medical Applications ofControlled Release,见上文,vol.2,pp.115-138(1984))。Langer(1990)Science 249：1527-1533在综述中讨论了其他控释系统。

施用上述活性成分是对癌症有效的治疗方案的受试者优选是人，但是可以是任何动物。因此，如本领域普通技术人员容易理解的，本文提供的方法和药物组合物特别适合于施用给任何动物，特别是哺乳动物，并且包括但绝不限于家养动物，例如猫类或犬类受试者，农场动物，例如但不限于牛类、马类、山羊类、绵羊类和猪类，野生动物(无论在野外还是在动物园中)，研究动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、犬、猫等，即用于兽医医学用途。

在本文提供的治疗方法和组合物中，提供了治疗有效剂量的活性成分。如本领域所公知的，治疗有效剂量可以由普通技术人员根据患者特征(年龄、体重、性别、状况、并发症、其他疾病等)确定。此外，随着进行进一步的常规研究，将出现关于用于治疗各种患者的各种病况的合适剂量水平的更具体的信息，并且普通技术人员在考虑治疗背景、接受者的年龄和总体健康状况的情况下能够确定适当的给药。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以低于腹膜内、肌内或其他施用途径的剂量。给药时间表可能会有所不同，具体取决于循环半衰期和所使用的制剂。以治疗有效量以与剂量制剂相容的方式施用组合物。施用所需的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且是每个人所特有的。然而，合适的剂量可以为每天每千克个体体重约0.1至20，优选地约0.5至约10，更优选1至几毫克活性成分，并且依赖于施用途径。初次施用和加强注射的合适方案也是可变的，但典型的是初次施用，随后以一个或多个小时的间隔通过随后注射或其他施用施用重复剂量。替代地，考虑了足以维持血液中十纳摩尔至十微摩尔浓度的连续静脉内输注。

与其他化合物一起的施用。为了治疗癌症，可以将本发明的活性组分与一种或多种用于治疗癌症的药物组合物联合施用，所述药物组合物包括但不限于化疗剂。施用可以是同时的(例如，本发明活性成分和化疗剂的混合物的施用)，或者可以是连续的。

本领域技术人员将认识到，本文公开的治疗方法可以在其他形式的肿瘤疗法之前、之后或同时使用。这样的肿瘤疗法可以包括化疗方案或放射治疗。

还涵盖了包含至少一种本文提供的蛋白质和另一种治疗有效药物，例如化疗剂的干粉制剂。

涵盖用于本文的是口服固体剂型，其在Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，1990(Mack Publishing Co.Easton PA 18042)第89章中有一般性描述，其通过引用并入本文。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、含片或锭剂、扁囊剂或球丸。而且，脂质体或类蛋白包囊可用于配制本发明的组合物(例如，如美国专利号4,925,673中报道的类蛋白微球)。可以使用脂质体包囊，并且脂质体可以用各种聚合物进行衍生化(例如，美国专利号5,013,556)。用于治疗剂的可能的固体剂型的描述由Marshall,K.于：ModernPharmaceutics，G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑，第10章，1979年提供，以引用方式并入本文。通常，制剂将包括一种或多种组分(或其化学修饰形式)和惰性成分，该惰性成分允许保护免受胃环境的侵害，并在肠中释放生物活性物质。

还特别涵盖一种或多种上述衍生组分的口服剂型。可以对一种或多种组分进行化学修饰，使得衍生物的口服递送是有效的。通常，所考虑的化学修饰是至少一个部分与组分分子本身的附接，其中该部分允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠到血流中的摄取。还期望增加一种或多种组分的整体稳定性并增加体内的循环时间。这种部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis(1981)“Soluble Polymer-Enzyme Abducts”于:Enzymes asDrugs,Hocenberg和Roberts编,Wiley-Interscience,New York,NY,pp.367-383；Newmark等人(1982)J.Appl.Biochem.4:185-189。可以使用的其他聚合物是聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧戊烷(tioxocane)。如上所述，优选用于药物使用的是聚乙二醇部分。

对于组分(或衍生物)，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域的技术人员可获得不溶于胃，但在十二指肠或在肠中的其他部位释放的物质的制剂。优选地，释放将通过保护蛋白质(或衍生物)或通过将生物活性物质释放到胃环境之外，例如在肠中而避免胃环境的有害作用。

为了确保完全的胃抗性，对至少pH 5.0不可渗透的涂层是必要的。用作肠涂层的更常见惰性成分的例子有偏苯三酸醋酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和Shellac。这些涂层可以用作混合膜。

也可以在片剂上使用涂层或涂层混合物，其并非旨在针对胃部来保护。这可以包括糖涂层或使片剂更容易吞咽的涂层。胶囊可以包含硬壳(例如明胶)，用于递送干的治疗剂，即粉末；对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊的外壳材料可以是浓淀粉或其他可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或研制片剂，可以使用湿法聚集技术。

肽治疗剂可以以细的多颗粒包含在制剂中，细的多颗粒以颗粒大小为约1mm的颗粒或球丸的形式。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉末，轻压塞状(plug)或甚至是片剂。可以通过压缩来制备治疗剂。

着色剂和调味剂都可以包括在内。例如，可以配制蛋白质(或衍生物)(例如通过脂质体或微球包囊)，并然后进一步包含在可食用产品例如含有着色剂和调味剂的冷藏饮料中。

可以用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可以包括碳水化合物，尤其是甘露醇、a-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。

崩解剂可以包括在治疗剂的制剂中以固体剂型形式。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂Explotab。可以使用羟乙酸淀粉钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土。崩解剂的另一种形式是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶可以用作崩解剂和粘合剂，并且这些可以包括粉状树胶例如琼脂、Karaya或黄芪胶。海藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。粘合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬的片剂，并且包括来自天然产物如阿拉伯树胶、黄芪胶、淀粉和明胶的材料。其他包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可在醇溶液中用于制粒治疗剂。

抗摩擦剂可以包含在治疗剂的制剂中，以防止在制剂过程中粘连。润滑剂可以用作治疗剂和模具壁之间的层，并且这些可以包括但不限于；硬脂酸包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用可溶性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。

可以添加在配制过程中可以改善药物流动特性并在压缩过程中帮助重排的助流剂。助流剂可以包括淀粉、滑石、热解二氧化硅和水合硅铝酸盐。

为了帮助将治疗剂溶解到水性环境中，可以添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去污剂，例如十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。可以使用阳离子去污剂，并且可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵(benzethomium chloride)。可以包含在制剂中作为表面活性剂的潜在非离子型去污剂列表包括聚桂醇400(lauromacrogol400)，聚乙二醇40(polyoxyl 40)硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，单硬脂酸甘油酯，聚山梨酸酯40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或以不同比例的混合物存在于蛋白质或衍生物的制剂中。

潜在地增强蛋白质(或衍生物)摄取的添加剂是例如脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。

供体来源的γδ-T细胞的施用。通常，以适合于其施用途径的形式制备γδ-T细胞的组合物，例如以注射、输注或类似液体或溶液的形式。液体或溶液形式，包括注射剂，可以以与如上所述制备各种常规药物制备物相同的方式制备。所使用的载体可以是本领域众所周知的各种药学上可接受的载体(稀释剂)中的任何一种。其非限制性实例是PBS和RPMI1640。在制备上述液体或溶液形式时，可以使用目前通常用于制备各种输注液的各种技术。可以刚好在使用前才制备γδ-T细胞组合物。根据本文描述的方法，经由预定的施用途径(一种或多种)以相应的预定剂量施用γδ-T细胞组合物。例如，用于输注给受试者的细胞数可以在每次输液约1×10

公认的是治疗方法可以包括单次施用治疗有效剂量的疗法或多次施用治疗有效剂量的疗法。而且，可以用不同的剂量和剂量方案来完成治疗。

如本文所使用的，单数术语“一”、“一个/一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。类似地，除非上下文另外明确指出，否则词语“或”旨在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值均为近似值，并提供用于描述。

通过以下非限制性实施例进一步说明本公开的主题。

实施例

从通过静脉穿刺从健康个体获得的外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用标准无菌技术收集新鲜血液。使用标准密度梯度离心法分离PBMC。PBMC在PBS中洗涤，然后重悬于补充有10％表征的胎牛血清和PCN+链霉素的完全RPMI-1640中。

通过将PBMC接种到其中添加了重组人IL-2的组织培养瓶中来启动细胞培养。通过添加C-HDMPP来启动γδ-T细胞扩增。将培养物在BSL2密闭环境的培养箱中在37℃，5％CO2下维持。根据需要添加新鲜培养基，以使细胞浓度保持在约1x10

21天后，温和地破坏培养物中的细胞簇，将其转移至50ml锥形管中并通过离心沉淀。丢弃上清液并将细胞沉淀用完全RPMI重悬，然后于20℃以300x g再次离心15分钟。将细胞沉淀重悬在含有10％DMSO的细胞培养基中。将细胞以1ml或2ml的等分试样转移到无菌冷冻小瓶中。将冷冻小瓶放置在速率受控的冷冻设备(-1℃/分钟的冷冻容器)中，将其转移到-80℃冷冻机中并然后转移到液氮存储系统中，以在-135℃的液氮汽相中存储。

在使用前一天，将含有γδ-T细胞的冷冻小瓶从液氮储存中取出，并在干冰上运输到BSL2实验室。细胞在37℃水浴中部分解冻。将部分解冻的小瓶充满逐滴添加的冷却培养基。将每个小瓶的内容物逐滴转移至含有培养基的50mL管中。离心后，将细胞沉淀以1x10

使用实施例1中所述的方法扩增人γδ-T细胞。培养21天后，将细胞用作效应细胞(杀伤细胞)，用于针对所选肿瘤靶细胞的体外细胞毒性测定法。使用标准方法，首先分别用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记所示的每种人类肿瘤细胞系。将效应细胞和CFSE标记的肿瘤细胞以各种效应子与靶标(E:T)比率共培养4小时。共培养完成后，将碘化丙啶添加到细胞混合物中，然后通过多色FACS进行分析。通过仅对CFSE阳性事件(肿瘤细胞)进行门控，确定PI阳性(死亡)的肿瘤细胞的比例，从而可以计算特定的肿瘤细胞死亡。图3中的结果显示为E:T比为25:1的肿瘤细胞裂解。图3表明扩增的γδ-T细胞对各种肿瘤细胞具有抗肿瘤活性，所述肿瘤细胞包括血液恶性病和实体瘤细胞。

使用实施例1中描述的方法扩增人γδ-T细胞。将扩增的γδ-T细胞用作效应细胞(杀伤细胞)，用于针对所选肿瘤靶细胞的体外细胞毒性测定法。杀伤测定法前二十四小时，将人类肿瘤细胞系各自在各种浓度(0μM；10μM或50μM)的唑来膦酸(ZOL)存在下进行培养。在用于杀伤测定法之前，将细胞仔细洗涤。然后将效应细胞和肿瘤细胞以各种效应子与靶标(E:T)的比率共培养4小时。使用基于FACS的方法(在实施例3中描述)或可商购的LDH释放测定法(Promega LDH-Glo)，计算特定的肿瘤细胞死亡。图4和图5中的结果显示为在所示的E:T比率的肿瘤细胞裂解。这些结果表明，暴露于低浓度的唑来膦酸使各种肿瘤细胞对被γδ-T细胞杀伤更敏感。这包括对γδ-T细胞有相对抗性的肿瘤细胞。

说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，程度就如同每个单独的出版物或专利申请均被明确地和单独地指示通过引用并入一样。

尽管为了清楚理解起见，已经通过图示和示例的方式对上述发明进行了一定的详细描述，但是显然可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。