共刺激通路联合阻断及同种反应性CD4记忆性T细胞对同种异体移植物存活影响及其机制研究

摘要

第一部分、小鼠腹部异位心脏移植模型的建立。 目的：探讨小鼠腹部异位心脏移植手术的技术方法及其改进，为进一步进行移植免疫学研究提供动物模型。 方法：采用供心主动脉与受体腹主动脉、供心肺动脉与受体下腔静脉端侧吻合方法对100例小鼠进行腹部异位心脏移植术，同时测量相关移植部位的重要结构。 结果：供心主动脉直径为（1.3±0.2）mm，供心肺动脉直径为（1.6±0.3）mm，受体下腔静脉直径为（2.4±0.4）mm，腹主动脉直径为（1.5±0.2）mm，腹腔大血管平均可利用长度为（6.0±1.0）mm。建模成功率为92％。供、受体手术时间分别为（8.0±1.0）min和（40.2±3.0）min；其中动脉吻合为（9.3±1.2）min，静脉吻合为（7.8±1.7）min。 结论：本组建立小鼠腹部异位心脏移植模型稳定可靠，适用于移植免疫学方面的研究。 第二部分、联合阻断CD28/B7和CD40/CD40L共刺激通路对同种异体移植物存活影响及其机制研究。 目的：借助小鼠腹部异位心脏移植模型，采用共刺激信号阻断策略去诱导同种异体移植物出现免疫耐受，并探讨其机制。 方法：采用连续联合应用CTLA-4 Ig和MR1，研究其对同种异体移植物存活、Th1和Th2细胞因子分泌等其他相关机制的影响。 结果：共刺激信号联合阻断能明显延长同种移植物的存活时间（平均存活时间为43d高于正常排斥对照组的8d，P<0.01），其具体机制包括能明显抑制Th1和Th2细胞因子的分泌、能减少浸润至移植物内的CD4+和CD8+淋巴细胞的数量、能抑制移植物内穿孔素、颗粒酶B和FasL的表达。 结论：联合阻断CD28/B7和CD40/CD40L共刺激信号能明显抑制CD4+初始T细胞的活化，阻止其向Th1和Th2极化，明显减少移植物内CD4+和CD8+淋巴细胞的浸润数量，通过抑制移植物内穿孔素、颗粒酶B以及FasL表达来抑制CTLs对移植物的细胞毒作用，从而使同种异基因移植物存活时间延长。 第三部分、同种反应性CD4+Tm对同种异体移植物存活影响的初步研究。 目的：研究同种反应性CD4+Tm对同种异体移植物存活的影响，并对其机制进行初步探讨。 方法：采用小鼠皮肤移植模型，通过免疫磁性分离技术分离出同种反应性CD4+Tm，并进行表型和功能鉴定。通过尾静脉过继性输入，研究此细胞对同种移植物存活的影响，并探讨其初步机制。 结果：分离所得CD4+Tm的活细胞百分率为（98.4±0.7）％，其中CD4+CD44+CD62L-CCR7-细胞比例约占95％，且其功能具有良好的供体特异性。在同种异基因抗原刺激下，CFSE标记的CD4+Tm荧光强度逐渐下降。与未输注Tm的阴性对照组相比，Tm组同种移植物平均存活时间明显缩短，移植物内有较多CD4+T淋巴细胞浸润，但分布局限于心肌的中环层。Tm组移植物内仅冠脉周围有少量颗粒酶B表达，其余地方未见明显表达，但有大量的FasL阳性细胞浸润，主要分布于心外膜及心内膜下，尤以血管周围较为明显。 结论：通过小鼠皮肤移植模型及免疫磁性分离技术，可制备高纯度无菌的CD4+Tm，其细胞活力不受影响，作用具有良好的供体特异性，这为深入研究Tm在移植物免疫方面的作用奠定了基础。同种反应性CD4+Tm能介导排斥反应，缩短同种异体移植物的存活时间，这其中以FasL-Fas为代表的非分泌性杀伤性途径可能在CD4+Tm介导的移植物排斥过程中起主要作用。