分子内动力学探针

摘要

本文提供涉及检测分析物的技术，并且特定地但非排他性地涉及用于检测、表征、鉴定和/或定量分析物的方法、组合物和系统。

说明书

本申请要求2018年7月24日提交的美国临时专利申请系列号62/702,670的优先权，所述临时专利申请通过引用整体并入本文中。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在美国陆军/陆军研究办公室授予的资助W911NF-12-1-0420以及国立卫生研究院授予的资助GM062357、CA204560和CA229023下在政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本文提供涉及检测分析物的技术，并且特定地但非排他性地涉及用于检测、表征、鉴定和/或定量分析物的方法、组合物和系统。

背景技术

低丰度分析物(例如，包括但不限于蛋白质、核酸、脂质和小分子(例如，药物、代谢物、辅因子等))的灵敏和特异性检测在体外诊断以及生物医学研究中起重要作用。这种检测通常使用对目标分析物具有高亲和性和特异性并且仅在存在靶分析物时产生可检测信号的分子试剂(例如，抗体、杂交探针)来进行。然而，亲和探针对靶分析物具有有限的特异性和亲和力(参见，例如Zhang等，(2012) “Optimizing the specificity of nucleicacid hybridization.

虽然可通过放大信号或产生分析物的许多拷贝来增加灵敏度，但探针试剂与伪分析物(如部分同源的氨基酸或肽序列)或与成像表面的结合通常在大约数千个分子拷贝或更多处施加有限的检测限制(参见，例如Cohen (2017) “Digital direct detection ofmicroRNAs using single molecule arrays”

发明内容

因此，本文提供涉及检测分析物的技术，并且特定地但非排他性地涉及用于检测、表征、鉴定和/或定量分析物的方法、组合物和系统。在一些实施方案中，所述技术检测、表征、鉴定和/或定量以低丰度和/或低浓度(例如，亚飞摩尔浓度)存在的分析物。在一些实施方案中，所述技术以单分子分辨率检测、表征、鉴定和/或定量分析物。

先前已经描述了使用动力学指纹以几乎任意高的特异性检测分析物的单分子的方法(参见，例如Johnson-Buck等(2015) “Kinetic fingerprinting to identify andcount single nucleic acids.

在一些实施方案中，这些现有方法包括反式使用查询探针，这削弱了一些分析物的快速探针缔合/解离动力学，且因此限制了一些实验中的数据采集速度。本公开涉及一种技术，其包括使用在存在特定分子分析物的情况下经历具有特征动力学的构象变化的动态纳米机器。因此，所述技术包括观察、记录和分析这些构象变化，从而以高置信度确定分析物的存在或不存在。一些实施方案还涉及表征、鉴定和/或定量分析物。

例如，在一些实施方案中，所述技术提供将若干组分并入离散的共价或非共价键合的纳米结构中的生物传感器，例如：

捕获探针部分(C)，其以高热力学稳定性结合靶分析物(T)的一个表位、部分或区域(例如，解链温度比测量温度高超过10℃，或与T缔合持续超过观察期的10倍的平均寿命)。

查询探针部分(Q)，其以中等至低的热力学稳定性结合T的不同表位、部分或区域(例如，解链温度在测量温度的10℃内，或与T缔合持续不超过观察期的1/5的平均寿命)。

分别与Q和C缔合的标记L1和L2，当Q和C两者都与T缔合时，它们的相互距离可测量地小于当T仅与C结合时的距离。例如，在一些实施方案中，L1和L2包含供体荧光团和受体荧光团的福斯特共振能量转移(Förster resonance energy transfer，FRET)对。在一些实施方案中，L1和L2包含荧光团和猝灭剂。

因此，在一些实施方案中，当靶T结合生物传感器时，T稳定地结合C (例如，在热力学稳定时间尺度上)，但仅瞬时地结合Q (例如，在动力学瞬时时间尺度上)，并且生物传感器将经历在Q和C两者都结合T的状态1和仅C结合T的第二状态2之间的可测量的转变(参见例如图1)。

在一些实施方案中，生物传感器合并以下任选组分中的一种或多种：

诱饵部分(D)，其与Q弱结合，因此与T竞争结合Q并相对于状态1延长状态2的寿命。在一些实施方案中，在测量期间的所有时间，D共价或非共价地连接到生物传感器(参见例如图1a)。在一些实施方案中，D以反式(例如，在溶液中)提供，使得当D与Q结合时，其仅与生物传感器结合(参见例如图2c)。

锚部分(A)，其用于固定到表面或其他相界以易于测量。例如，在一些实施方案中，A例如为生物素、链霉亲和素、地高辛(digoxigenin)、抗地高辛、用于点击化学介导的固定的叠氮化物或炔部分或能够与表面或相界共价或非共价相互作用的另一种亲和标签或官能团。

在本文所述技术的实施方案的开发期间，进行了实验，其中生物传感器包括一组设计的合成核酸序列且合并诱饵序列和生物素锚两者(参见例如图3a)。在这些实验期间使用单分子FRET显微学技术收集数据(图3b)。

所述技术提供相对于其他现有分析物检测技术的优势。例如，本发明技术以高置信度检测单分析物分子，这对于用其他技术检测的非核酸分析物通常是无法实现的。此外，所述技术不需要扩增靶分析物(例如，通过核酸扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)、NASBA、RPA、Invader等)。在一些实施方案中，所述技术提供交替的、改进的采集时间，并且比类似的技术更适合多重检测多种分析物(参见，例如，Johnson-Buck等，(2015) “Kineticfingerprinting to identify and count single nucleic acids.

在一些实施方案中，本文所述的技术提供一种生物传感器。在一些实施方案中，所述生物传感器包括捕获探针部分和查询探针部分。在一些实施方案中，所述捕获探针部分包含第一标记，并且所述查询探针部分包含第二标记。在一些实施方案中，捕获探针以高热力学稳定性结合靶分析物，并且查询探针部分瞬时结合靶分析物。在一些实施方案中，第一标记和第二标记是FRET对。在一些实施方案中，第一标记和第二标记是荧光-猝灭剂对。在一些实施方案中，捕获探针部分结合靶分析物以形成包含捕获探针部分和靶分析物的复合物。在一些实施方案中，所述复合物具有比测定的测量温度高超过10℃的解链温度。在一些实施方案中，捕获探针部分结合所述靶分析物以形成包含捕获探针部分和靶分析物的复合物。在一些实施方案中，所述复合物具有超过观察期的5倍的平均寿命。

在一些实施方案中，观察期是数十到数百到数千秒(例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒；例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟；例如，1、1.5、2、2.5或3小时)的时间间隔。在一些实施方案中，采集时间为大约1秒至10秒至1分钟至10分钟(例如，大约1秒至100秒，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒，例如，1分钟至100分钟，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟)。在一些实施方案中，采集时间为0.1-20.0秒(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0秒)。

在一些实施方案中，查询探针部分瞬时结合靶分析物以形成包含捕获查询探针部分和靶分析物的复合物。在一些实施方案中，所述复合物具有在测定的测量温度的10℃内的解链温度。在一些实施方案中，查询探针部分瞬时结合靶分析物以形成包含捕获查询探针部分和靶分析物的复合物。在一些实施方案中，所述复合物具有不超过观察期的1/5的平均寿命。在一些实施方案中，捕获探针部分和查询探针部分共价连接。在一些实施方案中，生物传感器包括共价连接的锚部分。在一些实施方案中，生物传感器还包含诱饵部分。在一些实施方案中，诱饵部分瞬时结合靶分析物以形成包含捕获查询探针部分和靶分析物的复合物。在一些实施方案中，所述复合物具有在测定的测量温度的10℃内的解链温度。在一些实施方案中，诱饵部分瞬时结合靶分析物以形成包含捕获查询探针部分和靶分析物的复合物。在一些实施方案中，所述复合物具有不超过观察期的1/5的平均寿命。

在一些实施方案中，诱饵部分包含标记或猝灭剂。在一些实施方案中，捕获探针部分包含抗体。在一些实施方案中，查询探针部分包含抗体。在一些实施方案中，捕获探针部分包含核酸。在一些实施方案中，查询探针部分包含核酸。

在一些实施方案中，所述技术提供方法。在一些实施方案中，方法包括使分析物与包含捕获探针部分和查询探针部分的生物传感器接触，其中所述捕获探针部分包含第一标记，并且所述查询探针部分包含第二标记；以及记录作为时间的函数的指示查询探针与分析物的缔合和解离的荧光信号，以产生荧光转变数据。在一些实施方案中，方法包括在所述捕获探针和所述分析物之间形成热力学稳定的复合物。在一些实施方案中，方法包括在所述查询探针和所述分析物之间重复形成瞬时复合物。在一些实施方案中，方法包括计数所述荧光转变数据中的荧光转变。在一些实施方案中，生物传感器包括锚部分，并且所述方法包括将所述生物传感器固定到表面上。在一些实施方案中，方法包括提供或获得样品。在一些实施方案中，方法包括提供诱饵部分。在一些实施方案中，方法包括使所述查询探针与诱饵部分接触。在一些实施方案中，方法包括提供激发波长。在一些实施方案中，方法包括检测发射波长。在一些实施方案中，方法包括记录作为时间的函数的发射波长。在一些实施方案中，方法包括记录发射波长的时间依赖性信号。在一些实施方案中，方法包括监测固体支持物上离散位置处的荧光。在一些实施方案中，方法还包括计数结合事件。在一些实施方案中，方法还包括计数荧光转变事件。在一些实施方案中，方法还包括测量结合事件的停留时间。在一些实施方案中，方法还包括从在采集时间期间包含至少5个转变的时间依赖性荧光信号中鉴定候选信号。在一些实施方案中，方法还包括计算动力学参数、计算转变次数的分布和/或计算表征分布的参数。在一些实施方案中，方法包括使用模式识别来处理所述荧光转变数据。在一些实施方案中，方法还包括统计分析所述荧光转变数据。在一些实施方案中，方法包括使用所述荧光转变数据检测分析物。

另外的实施方案涉及用于检测分析物的系统。在一些实施方案中，系统包括包含捕获探针部分和查询探针部分的生物传感器，其中所述捕获探针部分包含第一标记，并且所述查询探针部分包含第二标记；和构造成记录作为时间的函数的指示查询探针与分析物的缔合和解离的荧光信号的组件。在一些实施方案中，系统还包括固体支持物。在一些实施方案中，系统还包括诱饵部分。在一些实施方案中，系统还包括荧光显微镜。在一些实施方案中，系统还包括激发源。在一些实施方案中，系统还包括发射检测器。在一些实施方案中，系统还包括记录和/或分析荧光转变数据的计算机。在一些实施方案中，系统还包括分析物。

在一些实施方案中，捕获探针部分包含抗体。在一些实施方案中，捕获探针部分包含核酸。在一些实施方案中，查询探针部分包含抗体。在一些实施方案中，查询探针部分包含核酸。在一些实施方案中，诱饵部分包含抗体。在一些实施方案中，诱饵部分包含核酸。

所述技术提供生物传感器的用途以及相关的方法和系统。在一些实施方案中，所述技术提供如本文所述的生物传感器用于检测分析物的用途。在一些实施方案中，所述技术提供如本文所述的方法用于检测分析物的用途。在一些实施方案中，所述技术提供如本文所述的系统用于检测分析物的用途。

基于本文包含的教导，另外的实施方案对于相关领域的技术人员将是显而易见的。

附图说明

参考以下附图，将更好地理解本技术的这些和其他特征、方面和优点：

图1A是显示本文描述的动力学生物传感器的实施方案的示意图。所述生物传感器包括若干模块：捕获探针(C)，用于经由第一表位稳定结合靶分析物(T)；查询探针(Q)，用于可逆动力学探测(例如，瞬时结合) T的第二不同表位；标记L1和L2，其作为时间的函数的相对距离的变化报道分析物的存在和身份；任选的诱饵(D)部分，与T竞争结合Q；和任选的锚部分(A)，用于固定到表面或其他相界以易于检测。在T与C稳定结合时，复合物经历以下两种状态之间的一系列转变：状态1，其中Q和C两者都与T结合，因此它们的标记保持紧密靠近；和状态2，其中仅C与T结合，导致在标记L1和标记L2之间的可测量距离较大。在一些实施方案中，状态1和状态2的相对持续时间由模块之间的连接性、Q与T的结合的稳定性和/或诱饵模块D的存在和性质来控制。图1B是显示在使用图1a的生物传感器的实验中观察到的数据迹线的图。在不存在分析物的情况下，传感器主要处于状态2。一旦结合了靶分析物T，传感器就进入在状态1和状态2之间的独特动力学交替模式。一旦结合了伪分析物S (不同于T，但对Q和C具有一定的亲和力)，就观察到在状态1和状态2之间的不同交替模式，容许区分T和S。

图2A至图2C显示所述技术的示例性实施方案和变型。图2A显示使用募集靶核酸(例如，DNA或RNA)的核酸序列的复合物构建的生物传感器的一个实施方案的示意图。在这种情况下，查询探针和捕获探针是与靶T部分互补的低亲和性杂交探针和高亲和性杂交探针，并且诱饵是模拟结合Q的T的部分的核酸序列。图2B显示生物传感器的一个实施方案，其中查询探针和捕获探针分别是低亲和力抗体和高亲和力抗体。图2C显示生物传感器的一个实施方案，其中诱饵D不共价连接到生物传感器组分的其余部分，而是以反式引入。

图3A至图3C显示从生物传感器的一个实施方案的实验示范收集的数据。图3A显示生物传感器设计的一个实施方案，除了靶核酸(T)，微RNA hsa-miR-141之外，所述生物传感器设计还包含三条核酸链。捕获探针(C)和查询探针(Q)是结合T上的相邻互补区的长核酸序列和短核酸序列，导致当C和Q两者都结合T时标记Alexa Fluor 647 (AF647，L1)和Cy3(L2)并置。Cy3和AF647的并置容许这两种染料之间的福斯特共振能量转移(FRET)，并且结果，几乎100%的来自复合物的荧光信号自AF647发射。当Q不与T结合时，Q代之以与诱饵序列D结合，导致FRET效率低，并且几乎100%的来自复合物的荧光自Cy3发射。捕获(C)序列并入锁定核酸(LNA)修饰以通过C探针得到更大的靶结合稳定性。图3B显示具有结合的hsa-miR-141的单一生物传感器分子的FRET测量。数据以FRET比率显示在图上，其根据A/(A+D)计算，其中A是来自受体荧光团的荧光发射的表观强度，并且D是来自供体荧光团的荧光发射的表观强度。例如，在t＝14秒和t＝16秒时，见到高FRET状态(主要是Cy5发射)和低FRET状态(主要是Cy3发射)之间的重复转变，容许对与T的相互作用进行动力学表征，并且因此提供存在T的明显迹象。产生高FRET状态和低FRET状态的生物传感器的构型在右侧用连接信号与生物传感器构型的虚线示出。图3C显示在不存在T的情况下的FRET测量，仅显示低FRET状态，并且因此指示不存在T。

图4A和图4B显示从除了靶核酸miR-141之外还包含三条核酸链的生物传感器的一个实施方案的实验示范收集的数据。左侧的示意图表明生物传感器的组成(例如，包含诱饵的生物传感器(底部示意图)或不含诱饵的生物传感器的组成(例如，不包含诱饵的生物传感器)(顶部示意图))。中间的图显示来自个别生物传感器的代表性单分子FRET轨迹，而右侧的图是在36个生物传感器(来自每种条件)中观察到的FRET比率的直方图，其表现出非零FRET效率的至少一个数据点。如本文所用，术语“FRET比率”根据A/(A+D)计算，其中A是来自受体荧光团的荧光发射的表观强度，并且D是来自供体荧光团的荧光发射的表观强度。图4A描绘由不存在诱饵(D)的生物传感器的单分子FRET测量产生的数据，导致接近1的稳定FRET效率。图4B描绘来自存在7-核苷酸诱饵序列的生物传感器的单分子FRET测量的数据，导致FRET效率在大约1和0.1之间的动态转变。因此，诱饵的存在导致在没有诱饵的生物传感器中没有观察到的FRET转变。

图5是显示本文提供的用于检测如通过TIRF显微术可视化的癌症相关miRNA(miR-141)的动力学检测技术的实施方案的操作原理的示意图。如所述图中提供的数据所示，在存在靶miRNA的情况下，传感器经历高FRET状态和低FRET状态之间的快速转变。相反，数据表明在不存在靶的情况下仅观察到低FRET状态(例如，高供体荧光和低受体荧光)。

图6是显示作为以核苷酸(nt)计的诱饵(“竞争者”)的间隔基的长度和查询探针的间隔基的长度(“环长度”)的函数的高FRET状态和低FRET状态的中值寿命的变化的条形图。观察到包含诱饵(“竞争者”)的6-nt间隔基和查询探针(“查询臂环”)的18-nt间隔基的传感器经历具有类似寿命的在高FRET状态和低FRET状态之间的快速转变。所有动力学均在存在靶RNA，miR-141的情况下报道。

图7A显示在不同浓度的甲酰胺中单个miR-141结合的传感器(6-nt诱饵间隔臂、18-nt查询间隔臂环)的供体荧光(蓝色)和受体荧光(红色)的单分子FRET迹线。

图7B显示作为甲酰胺浓度的函数的高FRET状态和低FRET状态的寿命。

图7C是N

应当理解，附图未必按比例绘制，附图中的对象也未必彼此关联地按比例绘制。附图是意图将清楚和理解带给本文公开的设备、系统和方法的各种实施方案的描绘。在可能的情况下，贯穿附图将使用相同的附图标记来指示相同或相似的部分。此外，应当理解，附图并非旨在以任何方式限制本发明教导的范围。

具体实施方式

本文提供涉及检测分析物的技术，并且特定地但非排他性地涉及用于检测、表征、鉴定和/或定量分析物的方法、组合物和系统。

在各种实施方案的这种详细描述中，出于解释的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解，可以在有或没有这些具体细节的情况下实践这些各种实施方案。在其他情况下，结构和装置以框图形式示出。此外，本领域技术人员可以容易地理解，呈现和执行方法的具体顺序是说明性的，并且预期这些顺序可以变化并且仍保留在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。

本申请中引用的所有文献和类似材料(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页)出于任意目的通过引用整体明确地并入。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本文所述的各种实施方案所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。当并入的参考文献中的术语的定义看起来不同于本发明教导中提供的定义时，应以本发明教导中提供的定义为准。本文所用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。

定义

为了便于理解本发明技术，下面定义了许多术语和短语。在整个具体实施方式中阐述了另外的定义。

在整个说明书和权利要求书中，以下术语采用与本文明确相关的含义，除非上下文另外明确规定。如本文所用的短语“在一个实施方案中”未必是指相同的实施方案，尽管可能如此。此外，如本文所用的短语“在另一实施方案中”未必是指不同的实施方案，尽管可能如此。因此，如下所述，在不背离本发明的范围或精神的情况下，可以容易地组合本发明的各种实施方案。

此外，如本文所用，术语“或”是包括性的“或”算符，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另外明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的另外因素，除非上下文另外清楚规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述”的含义包括复数指代物。“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。

如本文所用，术语“约”、“大约”、“基本上”和“显著地”是本领域普通技术人员所理解的，并且将在使用它们的上下文中在一定程度上变化。如果在使用这些术语的上下文中，本领域普通技术人员不清楚这些术语的使用，“约”和“大约”意指加或减小于或等于特定术语的10%，并且“基本上”和“显著地”意指加或减大于特定术语的10%。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指任何生物体，包括植物、微生物和动物(例如，哺乳动物，例如犬、猫、家畜和人)。

如本文所用，术语“分析物”是指待测试、测定、检测、成像、表征、描述和/或定量的物质。示例性分析物包括但不限于分子、原子、离子、生物分子(例如，如本文所述和定义的核酸(例如，DNA、RNA))、多肽(例如，肽、蛋白质、糖蛋白)、碳水化合物、脂质、氨基酸、小分子(药物、生物活性剂、毒素、辅因子、代谢物)等。

本说明书和权利要求书中的术语“样品”以其最广泛的含义使用。在一些实施方案中，样品是或包含动物细胞或组织。在一些实施方案中，样品包括从任何来源获得的样本或培养物(例如，微生物培养物)，以及生物和环境样品。生物样品可以从植物或动物(包括人)获得，并且涵盖流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料(如表面物质、土壤、水)和工业样品。这些实例不应被解释为限制可应用于本发明技术的样品类型。

如本文所用，“生物样品”是指生物组织或流体的样品。例如，生物样品可以是从动物(包括人)获得的样品；流体、固体或组织样品；以及液体和固体食品和饲料产品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品，及废物。生物样品可以从所有各种家养动物家族以及未驯化或野生的动物获得，所述动物包括但不限于，例如有蹄动物、熊、鱼、兔类动物、啮齿动物等的动物。生物样品的实例包括组织切片、血液、血液级分、血浆、血清、尿液或来自其他外周来源或细胞培养物、细胞集落、单细胞或单细胞的集合的样品。此外，生物样品包括上述样品的汇集或混合物。生物样品可以通过从受试者移出细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的样品来提供。例如，可以通过常规活检技术从疑似患有疾病的受试者中移出组织样品。在一些实施方案中，血液样品从受试者取出。来自患者的生物样品意指来自疑似受疾病影响的受试者的样品。

环境样品包括例如环境材料(如表面物质、土壤、水)和工业样品，以及从食品和乳制品加工仪器、设备、装备、器具、一次性和非一次性物品获得的样品。这些实施例不应被解释为限制可应用于本发明的样品类型。

如本文所用，术语“生物流体”是指生物学流体(例如，体液(body fluid)、体液(bodily fluid))。例如，在一些实施方案中，生物流体是排泄物(例如，尿液、汗液、渗出物(例如，包括植物渗出物))，并且在一些实施方案中，生物流体是分泌物(例如，母乳、胆汁)。在一些实施方案中，生物流体使用针获得(例如，血液、脑脊液、淋巴)。在一些实施方案中，生物流体作为病理过程的结果产生(例如，水疱、囊液)。在一些实施方案中，生物流体来源于另一种生物流体(例如，血浆、血清)。示例性生物流体包括但不限于羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血液、血浆、血清、母乳、脑脊液、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、渗出物、粪便、女性射出液、胃酸、胃液、淋巴、粘液(例如，鼻引流、痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、发炎性分泌物、唾液、皮脂(例如，皮肤油)、浆液、精液、阴垢、痰、滑膜液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物和呕吐物。

如本文所用，术语“标记”是指可用于提供可检测(例如，可定量)效果并且可连接到核酸或蛋白质的任何原子、分子、分子复合物(例如，金属螯合物)或胶体颗粒(例如，量子点、纳米颗粒、微粒等)。标记包括但不限于染料(例如，光学可检测标记、荧光染料或部分等)；放射性标记，例如

如本文所用，术语“荧光团”将被理解为是指荧光团和发光体两者以及猝灭荧光或发光发射的化学剂。此外，如本文所用，“荧光团”是指当被适当刺激时具有荧光性质的任何物质。引发荧光的刺激通常是照明；然而，本文还考虑其他类型的刺激(例如，碰撞)。术语“荧光团”、“荧光剂”、“荧光部分”、“荧光染料”和“荧光基团”可互换使用。

如本文所用，“FRET对”是指受体荧光团和供体荧光团，其中供体荧光团的发射波长与受体荧光团的激发波长重叠。

如本文所用，“支持物”或“固体支持物”是指分析物可在其上或其中聚集和/或固定的表面或基质，例如分析物可共价或非共价连接到其上或其中的表面，或者分析物可部分或完全包埋在其上以便在很大程度上或完全防止分析物自由扩散或相对于彼此移动的表面或基质。在一些实施方案中，所述支持物包含与锚部分相互作用的部分。

如本文所用，“核酸”或“核酸序列”是指嘧啶和/或嘌呤碱基的聚合物或寡聚物，优选分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤(参见Albert L. Lehninger,Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982))。本发明技术预期任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，及其任何化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。聚合物或寡聚物在组成上可以是异质的或同质的，并且可以从天然存在的来源分离，或者可以人工或合成产生。另外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以以单链或双链形式永久或暂时存在，包括同源双链、异源双链和杂交状态。在一些实施方案中，核酸或核酸序列包含其他种类的核酸结构，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)和/或核酶。因此，术语“核酸”或“核酸序列”还可以涵盖包含非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或可以表现出与天然核苷酸相同的功能的非核苷酸结构单元(例如，“核苷酸类似物”)的链；此外，如本文所用的术语“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表有义链或反义链。

如本文所用的术语“核苷酸类似物”是指修饰的或非天然存在的核苷酸，包括但不限于具有改变的堆叠相互作用的类似物，例如7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)；具有替代氢键结构型的碱基类似物(例如，颁予S. Benner且通过引用并入本文中的美国专利号6,001,983中描述的Iso-C和Iso-G和其他非标准碱基对)；非氢键结类似物(例如，非极性、芳族核苷类似物，例如2,4-二氟甲苯，由B. A. Schweitzer和E. T. Kool, J.Org.Chem., 1994, 59, 7238-7242；B. A. Schweitzer和E. T. Kool, J. Am. Chem.Soc., 1995, 117, 1863-1872描述；其各自通过引用并入本文中)；“通用”碱基，例如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；和通用嘌呤和嘧啶(例如，分别为“K”和“P”核苷酸；P. Kong等，Nucleic Acids Res., 1989, 17, 10373-10383；P. Kong等，Nucleic Acids Res., 1992,20, 5149-5152)。核苷酸类似物包括在糖部分上具有修饰的核苷酸，例如双脱氧核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。核苷酸类似物包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式。

“肽核酸”意指掺入肽样聚酰胺骨架的DNA模拟物。

如本文所用，术语“互补的”或“互补性”关于通过碱基配对规则相关的多核苷酸(例如，核苷酸序列，例如寡核苷酸捕获探针、查询探针或作为核酸的靶分析物)使用。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“总体”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。任一术语也可以关于个别核苷酸使用，尤其是在多核苷酸的背景下。例如，可以为在寡核苷酸内的特定核苷酸指出其与另一核酸链内的核苷酸的互补性或其缺乏，这与所述寡核苷酸的其余部分和所述核酸链之间的互补性形成对比或比较。

在一些背景下，术语“互补性”和相关术语(例如，“互补的”、“互补序列”)是指可以通过氢键结合另一核酸序列的核酸序列的核苷酸，例如，能够碱基配对(例如，通过沃森-克里克碱基配对或其他碱基配对)的核苷酸。可以形成碱基对(例如，彼此互补)的核苷酸是以下对：胞嘧啶和鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶以及鸟嘌呤和尿嘧啶。不需要在核酸序列的整个长度上计算互补性百分比。互补性百分比可以限于碱基配对的核酸序列的具体区域，例如，从第一个碱基配对的核苷酸开始并在最后一个碱基配对的核苷酸处结束。如本文所用的核酸序列的互补序列是指当与核酸序列比对使得一个序列的5'端与另一序列的3'端配对时处于“反平行缔合”的寡核苷酸。在天然核酸中通常不存在的某些碱基可以包括在本发明的核酸中，并且包括，例如，肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补性不需要是完美的；稳定的双链体可以含有错配的碱基对或未匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员凭经验考虑许多变量可以确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。

因此，在一些实施方案中，“互补”是指第一核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱基的区域上与第二核碱基序列的互补序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。“完全互补”意指第一核酸的每个核碱基能够在第二核酸中的对应位置处与每个核碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中每个核碱基与核酸具有互补性的寡核苷酸具有在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核碱基的区域上与核酸的互补序列相同的核碱基序列。

“错配”意指第一核酸的核碱基不能与在第二核酸的对应位置处的核碱基配对。

术语“结构域”当关于多肽使用时是指多肽的子部分，其具有独特的结构和/或功能特征；通常，这种特征在各种多肽之间是类似的。所述子部分通常包含连续的氨基酸，但是其也可以包含协同作用或由于折叠或其他构型而紧密靠近的氨基酸。蛋白质结构域的实例包括跨膜结构域、糖基化位点等。

术语“基因”是指包含对于产生RNA或多肽或其前体(例如，胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。功能性多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留多肽的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)。术语“部分”当关于基因使用时是指所述基因的片段。片段的大小范围可以是几个核苷酸至整个基因序列减去一个核苷酸。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可以包含所述基因的片段或整个基因。

术语“基因”还涵盖结构基因的编码区，并且包括在5’端和3’端两者上邻近编码区(在任一端相距约1 kb)的序列，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'并且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式两者。基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“间隔区”或“间隔序列”的非编码序列间断的编码区。内含子是转录为核RNA (hnRNA)的基因片段；内含子可以含有调节元件，例如增强子。内含子从核或初级转录物中去除或“剪除”；因此，内含子不存在于信使RNA (mRNA)转录物中。mRNA在翻译期间发挥功能以规定在新生多肽中氨基酸的序列或次序。

除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以包括位于RNA转录物上存在的序列的5'端和3'端两者的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼区可以含有调节序列，例如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3'侧翼区可以含有指导转录终止、转录后裂解和聚腺苷酸化的序列。

术语“野生型”是指如下基因或基因产物：当从天然存在的来源分离时，其具有所述基因或基因产物的特征。野生型基因是在群体中最常观察到且因而任意地命名为该基因的“正常”或“野生型”形式的基因。相反，术语“修饰的”、“突变体”、“变体”或“多态的”是指，当与野生型基因或基因产物相比时，展示出序列和或功能性质的改性(即，改变的特征)的基因或基因产物。应当指出，可以分离出天然存在的突变体；这些通过以下事实来鉴定：当与野生型基因或基因产物相比时，它们具有改变的特征。因此，术语“变体”和“突变体”当关于核苷酸序列使用时是指与另一个通常相关的核苷酸序列有一个或多个核苷酸不同的核酸序列。“变异”是两个不同核苷酸序列之间的差异；在一些实施方案中，一个序列是参考序列。

术语“等位基因”是指在基因中不同的变异；所述变异包括但不限于变体和突变体、多态性基因座和单核苷酸多态性基因座、移码和剪接突变。等位基因可天然存在于群体中，或者其可在群体的任何特定个体的寿命期间产生。

如本文所用，术语“杂交”关于互补核酸的配对使用。杂交和杂交的强度(例如，核酸之间的缔合的强度)受例如以下因素影响：核酸之间的互补程度、涉及的条件的严格性和形成的杂合物的T

如本文所用，术语“T

如本文所用，术语“采集时间”、“观察期”、“观察时间”和类似短语是指在使用所述技术的实施方案来观察样品和/或记录数据以检测样品中的分析物(如果存在的话)期间的时间量。特定地，在一些实施方案中，“采集时间”、“观察期”、“观察时间”和类似短语是指在检测、记录和/或计数查询探针结合事件期间的时间量。在一些实施方案中，“采集时间”、“观察期”、“观察时间”和类似短语是指数十至数百至数千秒(例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒；例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟；例如，1、1.5、2、2.5或3小时)的时间量。在一些实施方案中，“采集时间”、“观察期”、“观察时间”和类似短语是指大约1秒至10秒至1分钟至10分钟(例如，大约1至100秒，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒，例如，1至100分钟，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟)的时间量。在一些实施方案中，采集时间为0.1-20.0秒(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0秒)。

如本文所用，术语“测量温度”是指使用所述技术的实施方案来观察样品和/或记录数据以检测样品中的分析物(如果存在的话)的温度。在一些实施方案中，“测量温度”使用主动加热和冷却(例如，热泵、珀耳帖装置(Peltier device)、水浴或本领域已知的其他技术以维持样品的温度，例如，在设定温度的0.1℃至0.5℃至1.0℃内)来控制。在一些实施方案中，测量温度是10℃至110℃(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110℃)。

术语“蛋白质”和“多肽”是指包含经由肽键连接的氨基酸的化合物，并且可互换使用。由基因编码的“蛋白质”或“多肽”不限于由所述基因编码的氨基酸序列，而是包括蛋白质的翻译后修饰。在术语“氨基酸序列”在本文中叙述以指蛋白分子的氨基酸序列时，“氨基酸序列”和类似术语(如“多肽”或“蛋白质”)并非意图将氨基酸序列限制为与所述蛋白分子相关的完全天然氨基酸序列。此外，“氨基酸序列”可从编码蛋白质的核酸序列推断。常规的单字母和三字母氨基酸代码在本文中如下使用-丙氨酸：Ala，A；精氨酸：Arg，R；天冬酰胺：Asn，N；天冬氨酸：Asp，D；半胱氨酸：Cys，C；谷氨酸：Glu，E；谷氨酰胺：Gln，Q；甘氨酸：Gly，G；组氨酸：His，H；异亮氨酸：Ile，I；亮氨酸：Leu，L；赖氨酸：Lys，K；蛋氨酸：Met，M；苯丙氨酸：Phe，F；脯氨酸：Pro，P；丝氨酸：Ser，S；苏氨酸：Thr，T；色氨酸：Trp，W；酪氨酸：Tyr，Y；缬氨酸：Val，V。如本文所用，代码Xaa和X是指任何氨基酸。

术语“变体”和“突变体”当关于多肽使用时是指与另一个通常相关的多肽有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列。

如本文所用，术语“解链”当关于核酸使用时是指双链核酸或核酸区域解离成单链核酸或核酸区域。

如本文所用，“查询探针”或“读出探针”是识别分析物(例如，结合到分析物(例如，特异性结合到分析物))的任何实体(例如，分子、生物分子等)。在示例性实施方案中，查询探针是识别分析物的蛋白质。在一些其他示例性实施方案中，查询探针是识别分析物的核酸。例如，在一些实施方案中，查询探针包括例如DNA、RNA、包含DNA和RNA的核酸、包含修饰的碱基和/或碱基之间修饰的键的核酸，例如如上文所述的核酸。在一些实施方案中，核酸查询探针包含核酸适体。在一些实施方案中，查询探针例如用可检测标记(例如，如本文所述的荧光部分)标记。在一些实施方案中，查询探针包含多于一种类型的分子(例如，蛋白质、核酸、化学接头或化学部分中的多于一种)。在一些实施方案中，查询探针用FRET对的成员标记。在一些实施方案中，查询探针用猝灭剂标记。在一些实施方案中，查询探针以中等至低的热力学稳定性结合到分析物(例如，解链温度在测量温度的10℃内，或平均寿命不超过观察期的1/5)。在一些实施方案中，查询探针包含间隔臂，所述间隔臂包含10-30 nt (例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 nt)。在一些实施方案中，查询探针包含5-50 nt (例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 nt)。

所述技术的实施方案包括瞬时且重复地结合分析物的查询探针(例如，可检测标记的查询探针)，例如，每观察窗结合到靶分析物并自靶分析物解离若干次(例如，大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)的查询探针。在一些实施方案中，查询探针在测定条件下对分析物的解离常数(K

所述技术在查询探针方面不受限制。在一些实施方案中，查询探针是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，查询探针是低亲和力抗体或抗体片段。在一些实施方案中，查询探针是纳米抗体、DNA结合蛋白或蛋白结构域、甲基化结合结构域(MBD)、激酶、磷酸酶、乙酰酶、脱乙酰酶、酶或多肽。在一些实施方案中，查询探针是与靶分析物相互作用的寡核苷酸。例如，在一些实施方案中，查询探针是与靶分析物杂交以形成双链体的寡核苷酸，所述双链体的解链温度在进行观察的温度的大约10摄氏度内(例如，对于在室温下执行的观察，大约7-12个核苷酸)。在一些实施方案中，查询探针是单核苷酸。在一些实施方案中，查询探针是小有机分子(例如，分子量小于大约2000道尔顿，例如小于2100、2050、2000、1950、1900、1850、1800、1750、1700、1650、1600、1550、1500道尔顿或更小的分子)。在一些实施方案中，查询探针是药剂，例如药物或其他生物活性分子。在一些实施方案中，查询探针是金属离子络合物。在一些实施方案中，查询探针是甲基结合结构域(例如，MBD1)。在一些实施方案中，查询探针用如本文所述的可检测标记标记。在一些实施方案中，查询探针与可检测标记共价连接。在一些实施方案中，查询探针与可检测标记间接和/或非共价连接和/或缔合。在一些实施方案中，可检测标记是荧光的。

在一些实施方案中，查询探针是小鼠单克隆抗体。

在分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，查询探针包含碳水化合物结合蛋白，例如凝集素或碳水化合物结合抗体。

如本文所用，“事件”是指查询探针与分析物结合的情况或查询探针自分析物解离的情况，例如，如通过监测指示查询探针与分析物的结合和/或查询探针自分析物解离的可检测性质所测量。

如本文所用，术语“诱饵部分”是结合查询探针且不是分析物的任何实体(例如，分子、生物分子等)。在一些实施方案中，诱饵部分与查询探针竞争结合分析物并延长查询探针处于未结合分析物的状态的时间。因此，在一些实施方案中，诱饵部分允许控制查询探针与分析物的相互作用(例如，缔合和解离)，例如提供对查询探针在“状态1”与“状态2”之间转换的动力学的控制，其中在“状态1”下查询探针与分析物缔合，在“状态2”下查询探针不与分析物缔合。

在一些实施方案中，诱饵部分是分析物模拟物。在一些实施方案中，诱饵部分和查询探针直接连接(例如，共价(例如，通过键、接头等))。在一些实施方案中，诱饵部分和查询探针间接连接(例如，通过非共价相互作用)。在查询探针与诱饵部分直接或间接连接的实施方案中，诱饵部分相对于查询探针以“顺式”提供。在一些实施方案中，诱饵部分和查询探针不彼此连接(例如，诱饵部分相对于查询探针以“反式”存在)。在各种实施方案中，与分析物结合查询探针相比，诱饵部分结合查询探针的强度较小或结合查询探针的强度较大。在一些实施方案中，诱饵部分以与查询探针结合分析物大致相同的亲和力结合查询探针。在示例性实施方案中，诱饵部分是结合查询探针的蛋白质。在一些其他示例性实施方案中，诱饵部分是结合查询探针的核酸。例如，在一些实施方案中，诱饵部分包含例如DNA、RNA、包含DNA和RNA的核酸、包含修饰的碱基和/或碱基之间修饰的键的核酸，例如如上文所述的核酸。在一些实施方案中，诱饵部分包含核酸适体。在一些实施方案中，诱饵部分例如用可检测标记(例如，如本文所述的荧光部分)标记。在一些实施方案中，诱饵部分包含多于一种类型的分子(例如，蛋白质、核酸、化学接头或化学部分中的多于一种)。在一些实施方案中，诱饵部分用FRET对的成员标记。在一些实施方案中，诱饵部分用猝灭剂标记。在一些实施方案中，诱饵部分以中等至低的热力学稳定性结合查询探针(例如，解链温度在测量温度的10℃内，或平均寿命不超过观察期的1/5)。在一些实施方案中，诱饵部分是包含4-20 nt (例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 nt)的核酸。

如本文所用，“捕获探针”是识别分析物(例如，结合分析物，例如，特异性结合分析物)的任何实体(例如，分子、生物分子等)。在一些实施方案中，捕获探针将分析物连接到固体支持物。在示例性实施方案中，捕获探针是识别分析物的蛋白质。在一些其他示例性实施方案中，捕获探针是识别分析物的核酸。例如，在一些实施方案中，捕获探针包括例如DNA、RNA、包含DNA和RNA的核酸、包含修饰的碱基和/或碱基之间修饰的键的核酸，例如如上文所述的核酸。在一些实施方案中，核酸捕获探针包含核酸适体。在一些实施方案中，捕获探针例如用可检测标记(例如，如本文所述的荧光部分)标记。在一些实施方案中，捕获探针包含多于一种类型的分子(例如，蛋白质、核酸、化学接头或化学部分中的多于一种)。在一些实施方案中，捕获探针用FRET对的成员标记。在一些实施方案中，捕获探针用猝灭剂标记。在一些实施方案中，捕获探针以高热力学稳定性结合分析物(例如，解链温度比测量温度高超过10℃，或平均寿命超过观察期的10倍)。在一些实施方案中，捕获探针包含锚部分。在一些实施方案中，捕获探针直接(例如，共价)连接到锚部分。在一些实施方案中，捕获探针间接(例如，非共价)连接到锚部分。

所述技术的实施方案包括分析物的捕获。在一些实施方案中，分析物被捕获和固定。在一些实施方案中，分析物稳定地连接到固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物相对于接触固体支持物的主体液相是固定的。在一些实施方案中，固体支持物在接触固体支持物的主体液相内是可扩散的。

在一些实施方案中，靶分析物与表面或其他固体基质(substrate)的稳定连接通过高亲和性或不可逆的相互作用(例如，如本文所用，“不可逆的相互作用”是指具有比观察时间长的解离半衰期的相互作用，例如，在一些实施方案中，为1分钟至10分钟(例如，60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600秒或更长)的时间)提供。所述技术在用于捕获分析物的组分和/或方法方面不受限制。例如，稳定连接通过多种方法(包括但不限于以下方法中的一种或多种)提供。在一些实施方案中，相互作用中的不可逆相互作用具有高热力学稳定性(例如，解链温度比测量温度高超过10℃或平均寿命超过观察期的10倍)。

在一些实施方案中，分析物通过表面结合的捕获探针固定，所述捕获探针对于分析物的解离常数(K

在一些实施方案中，分析物通过直接非共价连接到表面(例如，通过分析物和表面(例如，玻璃表面或尼龙、硝化纤维或聚偏二氟乙烯膜)之间的相互作用)来固定。

在一些实施方案中，分析物通过分析物与固体支持物的化学连接(例如，通过共价键)来固定。在一些实施方案中，分析物通过例如碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、马来酰亚胺、卤代乙酰基、酰肼或烷氧基胺与固体支持物化学连接。在一些实施方案中，分析物通过靶分析物与表面和/或与连接到表面的捕获探针的辐射(例如，紫外光)诱导的交联来固定。在一些实施方案中，捕获探针是兔单克隆抗体。在分析物包含碳水化合物或多糖的一些实施方案中，捕获探针包含碳水化合物结合蛋白，例如凝集素或碳水化合物结合抗体。

或者，代替如上所述将靶分析物固定到相对于接触固体支持物的主体相而言相对静止的固体支持物上，一些实施方案提供与自由扩散颗粒缔合的靶分析物，所述自由扩散颗粒在接触所述自由扩散颗粒的主体流体相内扩散。因此，在一些实施方案中，靶分析物共价或非共价结合到自由扩散的基质。在一些实施方案中，自由扩散的基质是例如胶体颗粒(例如，具有大约10-1000 nm (例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000nm)的直径的颗粒)。在一些实施方案中，自由扩散的基质包含和/或由例如聚苯乙烯、二氧化硅、葡聚糖、金或DNA折纸(origami)制成。在一些实施方案中，靶分析物与自由扩散颗粒缔合，所述自由扩散颗粒相对于查询探针的扩散缓慢地扩散，例如，靶分析物的扩散系数小于查询探针的扩散系数的大约10% (例如，小于15%、14%、13%、12%、11%、10.5%、10.4%、10.3%、10.2%、10.1%、10.0%、9.9%、9.8%、9.7%、9.6%、9.5%或9.0%或更小)。

此外，在一些实施方案中，靶分析物与自由扩散的颗粒缔合，并且靶分析物的位置是可观察的和/或可记录的，而与观察和/或记录查询探针结合无关。例如，在一些实施方案中，可检测标记(例如，荧光团、荧光蛋白、量子点)共价或非共价地连接到靶分析物，例如，用于靶分析物的检测和定位。因此，在一些实施方案中，同时且独立地测量靶分析物的位置和查询探针结合事件的位置。

如本文所用，术语“灵敏度”是指当样品包含分析物时，测定给出分析物阳性结果的概率。灵敏度计算为真阳性结果的数目除以真阳性和假阴性的总和。灵敏度是测定检测分析物的程度的量度。

如本文所用，术语“特异性”是指当样品不包含分析物时测定给出阴性结果的概率。特异性计算为真阴性结果的数目除以真阴性和假阳性的总和。特异性是本发明方法从包含分析物的样品中排除不包含分析物的样品的程度的量度。

如本文所用，“平衡常数”(K

其中A和B是彼此缔合的两个实体(例如，捕获探针和分析物、查询探针和分析物、诱饵部分和查询探针)，并且K

如本文所用，彼此缔合的两个实体的产物(例如根据上述方程式由A和B形成AB)的“显著量”是指AB的浓度，其等于或大于A或B的游离浓度(取较小值)。

如本文所用，“纳摩尔亲和力范围”是指具有纳摩尔范围内的平衡解离常数K

如本文所用，“弱亲和力”或“弱结合”或“弱缔合”是指缔合具有大约100纳摩尔(例如，大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500纳摩尔)和/或，在一些实施方案中，在1纳摩尔至10微摩尔范围内的K

术语“特异性结合”或“特异性地结合”当关于彼此缔合的两种组分A和B的相互作用使用时是指A和B的缔合的K

如本文所用，词语“存在”或“不存在”(或，供选地，“存在的”或“不存在的”)以相对意义使用，以描述特定实体(例如，分析物)的量或水平。例如，当分析物被称为“存在”于样品中时，其意指这种分析物的水平或量高于预定阈值；相反，当分析物被称为“不存在”于样品中时，其意指这种分析物的水平或量低于预定阈值。预定阈值可以是与用于检测分析物的特定测试相关联的可检测性的阈值或任何其他阈值。当在样品中“检测到”分析物时，则它“存在”于样品中；当“未检测到”分析物时，则其“不存在”于样品中。此外，其中“检测到”分析物或其中“存在”分析物的样品是对于分析物“阳性”的样品。其中“未被检测”分析物或其中“不存在”分析物的样品是对于分析物“阴性”的样品。

如本文所用，“增加”或“减少”是指相对于先前测量的变量值、相对于预建立的值和/或相对于标准对照的值，变量值的可检测的(例如，测量的)正或负变化。增加是相对于先前测量的变量值、预建立的值和/或标准对照的值，优选至少10%、更优选50%、还更优选2倍、甚至更优选至少5倍且最优选至少10倍的正变化。类似地，降低是先前测量的变量值、预建立的值和/或标准对照的值的优选至少10%、更优选50%、还更优选至少80%且最优选至少90%的负变化。指示数量变化或差异的其他术语(如“更多”或“更少”)在本文中以与如上所述相同的方式使用。

术语“检测测定”是指用于检测分析物的存在或不存在或分析物的活性或效应或用于检测分析物的变体的存在或不存在的测定。

“系统”表示一组组件(真实或抽象的)，其包含其中每个组件与整体内的至少一个其他组件相互作用或与其相关的整体。

在一些实施方案中，所述技术包含抗体组分或部分，例如抗体或其片段或衍生物。如本文所用，“抗体”(也称为“免疫球蛋白”(例如，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE))包含彼此通过二硫键连接的两条重链和各自通过二硫键与重链连接的两条轻链。抗体的特异性在于抗体的抗原结合位点(或互补位)和抗原决定簇(或表位)之间的结构互补性。抗原结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区的残基影响总体结构域结构且因此影响结合位点。一些实施方案包含抗体的片段，例如，包含免疫球蛋白分子的至少一部分的任何含有蛋白质或多肽的分子，例如以容许所述分子和抗原之间的特异性相互作用。免疫球蛋白分子的部分可包括但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分。这样的片段可通过酶裂解、合成或重组技术产生，如本领域已知和/或如本文所述。抗体也可以使用其中一个或多个终止密码子已被引入天然终止位点上游的抗体基因以各种截短形式产生。抗体的各种部分可以通过常规技术化学连接在一起，或者可以使用基因工程改造技术作为连续蛋白制备。

抗体片段包括但不限于Fab片段(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、F(ab')

Fab片段可以通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理抗体来获得。此外，Fab可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入用于原核表达系统或用于真核表达系统的载体中，并将载体引入原核生物或真核生物以表达Fab来产生。F(ab')

通常，使用本领域目前众所周知的许多常规技术，通常可以针对任何抗原产生抗体。

如本文所用，术语“缀合的”是指当一个分子或试剂物理或化学地偶联或粘附到另一分子或试剂上时。缀合的实例包括共价键连和静电复合。术语“复合”、“与……复合”和“缀合”在本文中可互换使用。

如本文所用，“稳定相互作用”或提及“稳定结合的”相互作用是指在相互作用的热力学平衡条件下相对持久的缔合。在一些实施方案中，“稳定相互作用”是K

在一些实施方案中，“稳定相互作用”和“瞬时相互作用”之间的区别由K

如本文所用，术语“稳定相互作用”、“稳定结合”和“稳定缔合”可互换使用。如本文所用，术语“瞬时相互作用”、“瞬时结合”和“瞬时缔合”可互换使用。

如本文所用，“部分(moiety)”是指某物可分成的两个或更多个部件中的一个，例如寡核苷酸、分子、化学基团、结构域、探针、“R”基团、多肽等的各个部件。

如本文所用，在一些实施方案中，“信号”是与所测定样品的一种或多种性质(例如查询探针与分析物的结合和/或查询探针与分析物的解离)相关的时变量(例如，可观察、可检测和/或可测量的量)。信号在时域中可以是连续的或者在时域中可以是离散的。作为数学抽象，连续时间信号的域是实数集(或其区间)，并且离散时间信号的域是整数集(或其区间)。离散信号通常经由连续信号的“数字采样”而产生。例如，音频信号由线路上的连续波动的电压组成，所述连续波动的电压可以通过以有规律的间隔(例如，每50微秒)读取线路上的电压电平来数字化。将所得数字流作为离散时间数字信号储存。在一些实施方案中，所述信号被记录为空间位置(例如，x,y坐标；例如，x,y,z坐标)的函数。在一些实施方案中，信号被记录为时间的函数。在一些实施方案中，信号被记录为时间和位置的函数。

如本文所用，术语“基本上”是广义术语并且以其普通含义使用，包括但不限于在很大程度上但未必完全是所指定的情况。

如本文所使用的术语“算法”是广义的术语，并且以其普通意义使用，包括但不限于在例如使用计算机处理将信息从一种状态变换到另一状态时所涉及的计算过程(例如，程序)。

具体实施方式

尽管本文的公开内容涉及某些说明性实施方案，但应理解，这些实施方案是以举例的方式而不是以限制的方式呈现的。

SiMREPS

如本文所用，术语“通过平衡泊松取样进行单分子识别”及其缩写“SiMREPS”是指通过动力学指纹鉴定和计数样品中的个别分析物的无扩增单分子检测方法。这种技术描述于例如美国专利申请系列号14/589,467；国际专利申请号PCT/US2015/044650；国际专利申请号PCT/US2017/016977；国际专利申请号PCT/US2018/021356；美国临时申请系列号62/468,578；美国临时申请系列号62/692,001；和美国临时申请系列号62/598,802，其各自通过引用整体并入本文中。还参见Johnson-Buck等，(2015) “Kinetic fingerprinting toidentify and count single nucleic acids”

简短地讲，SiMREPS技术包括直接观察荧光探针与表面捕获的分析物(例如，核酸、蛋白质等)的重复结合，其产生特异性(例如，对于核酸、序列特异性)动力学指纹。所述动力学指纹以单分子分辨率以高置信度鉴定分析物。动力学指纹克服了受热力学特异性障碍限制的先前技术，从而最小化和/或消除了假阳性。因此，SiMREPS技术提供超高的特异性，其可用于检测例如稀有分析物，如稀有或低丰度突变DNA等位基因。现有工作已经表明SiMREPS能够区分单核苷酸(参见例如Johnson-Buck等，(2015) “Kinetic fingerprintingto identify and count single nucleic acids”

所述技术提供例如在存在类似分析物和在一些实施方案中背景噪声的情况下靶分析物的检测。在一些实施方案中，源自查询探针与靶分析物的瞬时结合的信号可与由未结合的查询探针产生的信号区别(例如，通过观察、监测和/或记录结合事件期间信号强度的局部变化)。在一些实施方案中，观察查询探针(例如，荧光标记的查询探针)与靶分析物的瞬时结合通过技术实现，所述技术例如为全内反射荧光(TIRF)或近TIRF显微术、零模式波导(ZMW)、光片显微术、受激发射损耗(STED)显微术或共焦显微术。在一些实施方案中，本文提供的技术使用具有当未结合靶分析物时猝灭的荧光发射和/或当结合靶分析物时去猝灭的荧光发射的查询探针。

所述技术包括在例如在平面或体积中的特定空间坐标处观察到的区域的离散区和/或体积的离散区内定位和/或观察查询探针与分析物的瞬时结合。在一些实施方案中，相对于固定的(例如，表面结合的)靶分析物之间的平均间距，确定结合或解离事件的空间坐标的误差(例如，归因于检测器中的有限信号、检测器噪声或空间分箱)较小(例如，最小化、消除)。在包括使用宽视场荧光显微术的一些实施方案中，测量误差通过在样本平面中使用有效检测器像素尺寸来最小化和/或消除，所述有效检测器像素尺寸不大于固定(例如，表面结合)的靶分析物之间的平均距离，并且在每个检测时间点收集许多荧光光子(在一些实施方案中，超过100个，例如，超过80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130个或更多个)。

在一些实施方案中，当可检测(例如，荧光)查询探针靠近固体支持物的表面(例如，在固体支持物表面的约100 nm内)时，其产生荧光发射信号。当未结合时，查询探针快速扩散，因此不能被单独地检测到；因此，当处于未结合状态时，查询探针产生低水平的漫射背景荧光。因此，在一些实施方案中，结合的查询探针的检测包括使用全内反射荧光显微术(TIRF)、HiLo显微术(参见例如US20090084980、EP2300983 B1、WO2014018584 A1、WO2014018584 A1，通过引用并入本文中)、共焦扫描显微术或包括仅照射(例如，激发)固体支持物表面附近或所述表面上的那些查询探针分子的照射方案的其他技术。因此，在一些实施方案中，仅结合到表面附近或表面上的固定靶标的查询探针产生点样发射信号(例如，“斑点”)，其可被确认为源自单个分子。

在一些实施方案中，查询探针包含具有发射波长的荧光标记。在荧光标记的发射波长下检测到荧光发射指示查询探针与固定的靶分析物结合。查询探针与靶分析物的结合是“结合事件”。在所述技术的一些实施方案中，结合事件具有测量强度大于限定阈值的荧光发射。例如，在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如，在不存在靶分析物的情况下观察到的荧光强度)的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有比背景荧光强度(例如，在不存在靶分析物的情况下观察到的荧光强度)高至少1、2、3、4个或更多个标准偏差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有比背景荧光强度(例如，在不存在靶分析物的情况下观察到的荧光强度)高至少2个标准偏差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件的荧光强度是背景荧光强度(例如，在不存在靶分析物的情况下观察到的平均荧光强度)的至少1.5、2、3、4或5倍。

因此，在一些实施方案中，在查询探针的发射波长下检测到具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光指示结合事件已经发生(例如，在固定有靶分析物的固体支持物上的离散位置处)。此外，在一些实施方案中，在查询探针的发射波长下检测到具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光指示结合事件已经开始。因此，在一些实施方案中，在查询探针的发射波长下检测到不存在具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光指示结合事件已经结束(例如，查询探针已经自靶分析物解离)。结合事件开始时和结合事件结束时之间的时间长度(例如，在荧光探针的发射波长下检测到具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光的时间长度)是结合事件的停留时间。“转变”是指查询探针与靶分析物的结合和解离(例如，on/off事件)，例如，查询探针从结合状态解离或查询探针从未结合状态与靶分析物缔合。

根据所述技术的方法包括计数在限定的时间间隔期间在固体支持物上每个离散位置(例如，在由x,y坐标鉴定的位置)发生的查询探针结合事件的数目，所述限定的时间间隔是“采集时间”或“观察期”(例如，数十至数百至数千秒的时间间隔，例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒；例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟；例如，1、1.5、2、2.5或3小时)。在一些实施方案中，采集时间为大约1秒至10秒至1分钟至10分钟(例如，大约1至100秒，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒，例如，1分钟至100分钟，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟)。在一些实施方案中，采集时间为0.1-20.0秒(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0秒)。

此外，查询探针在结合事件期间保持与靶分析物结合的时间长度是结合事件的“停留时间”。在采集时间期间检测到的结合事件的数目和/或针对结合事件记录的停留时间的长度是查询探针结合靶分析物的特征，并且因此提供靶分析物固定在所述离散位置处并且因此靶分析物存在于样品中的指示。

在限定的时间间隔期间(例如，在采集时间期间)监测(例如，使用光源激发荧光探针并检测来自结合的查询探针的荧光发射，例如，使用荧光显微镜)和/或记录查询探针与固定的靶分析物的结合和/或查询探针自固定的靶分析物的解离。例如通过使用计算机和软件(例如，使用隐马尔可夫模型(hidden Markov model)和泊松统计分析数据)确定在采集时间期间查询探针与核酸结合的次数和/或在每个结合事件期间查询探针保持与核酸结合的时间长度以及在每个结合事件之间查询探针保持不与核酸结合的时间长度(例如，分别为结合状态的“停留时间”和未结合状态的“停留时间”)。

在一些实施方案中，测量阳性和/或阴性对照样品(例如，已知包含或不包含靶标的对照样品)。在阴性对照样品中检测到的荧光是“背景荧光”或“背景(荧光)强度”或“基线”。

在一些实施方案中，包含在查询探针的发射波长下的荧光强度的测量结果的数据被记录为时间的函数。在一些实施方案中，结合事件的数目和结合事件的停留时间(例如，对于每个固定的分析物)由数据确定(例如，通过确定荧光强度高于阈值背景荧光强度的次数和时间长度)。在一些实施方案中，对固定有靶分析物的固体支持物上的每个离散位置计数转变(例如，一个或多个查询探针的结合和解离)。在一些实施方案中，转变的阈值数目用于将在固体支持物上的离散位置处存在靶分析物与背景信号、非靶分析物和/或查询探针的伪结合区分开。

在一些实施方案中，确定每个固定的靶标的转变数目的分布-例如，对于观察到的每个固定的分析物计数转变数目。在一些实施方案中，产生直方图。在一些实施方案中，确定分布的特征参数，例如，确定分布的平均值、中值、峰值、形状等。在一些实施方案中，数据和/或参数(例如，荧光数据(例如，时域中的荧光数据)、动力学数据、分布的特征参数等)通过例如使用人工智能、模式识别、机器学习、统计推断、神经网络等识别数据中的模式和规律性的算法来分析。在一些实施方案中，所述分析包括使用频率论分析(frequentistanalysis)，并且在一些实施方案中，分析包括使用贝叶斯分析(Bayesian analysis)。在一些实施方案中，使用已知的“训练”数据(例如，使用监督式学习)来训练模式识别系统，并且在一些实施方案中，使用算法来发现先前未知的模式(例如，无监督式学习)。参见例如Duda等，(2001)

模式识别(例如，使用训练集、监督式学习、无监督式学习和未知样品分析)将所鉴定的模式与分析物相关联，使得特定模式提供特定分析物的“指纹”，其可用于分析物的检测、定量和鉴定。

在一些实施方案中，由靶分析物产生的分布显著不同于由非靶分析物产生的分布或在不存在靶分析物的情况下产生的分布。在一些实施方案中，确定多个固定的靶分析物的平均转变数目。在一些实施方案中，对于包含靶分析物的样品观察到的平均转变数目作为时间的函数近似线性相关，并且具有正斜率(例如，平均转变数目作为时间的函数近似线性增加)。

在一些实施方案中，使用统计学(例如，泊松统计学)处理数据以确定在固体支持物上的每个离散位置处作为时间的函数发生的转变的概率。在一些特定实施方案中，在固体支持物上的离散位置处作为时间的函数发生的转变事件的相对恒定概率指示在固体支持物上的所述离散位置处存在靶分析物。在一些实施方案中，与事件数目和经过时间相关的相关系数由在固体支持物上的离散位置处作为时间的函数发生的转变事件的概率计算。在一些实施方案中，当由在固体支持物上的离散位置处作为时间的函数发生的转变事件的概率计算时，大于0.95的与事件数目和经过时间相关的相关系数指示在固体支持物上的所述离散位置处存在靶分析物。

在一些实施方案中，结合的查询探针的停留时间(τ

如本文所述，所述技术通过动力学检测技术检测分析物。因此，所述技术的特定实施方案涉及通过分析查询探针与待检测分析物的相互作用的动力学来检测分析物。对于查询探针Q (例如，与靶分析物T处于平衡浓度[Q]) (例如，处于平衡浓度[T])的相互作用，动力学速率常数

同样，动力学速率常数

此外，在一些实施方案中，探针(例如，可检测标记的查询探针(例如，荧光探针))与靶分析物的重复随机结合被建模为每单位时间以恒定概率发生的泊松过程，并且其中每单位时间结合事件和解离事件的数目(N

此外，在一些实施方案中，控制测定条件以调谐动力学行为，从而改进查询探针与靶分析物的结合事件与背景结合的区分。例如，在一些实施方案中，所述技术包括例如使用设计成与靶分析物弱相互作用(例如，在纳摩尔亲和力范围内)的查询探针控制测定条件；控制温度使得查询探针与靶分析物弱相互作用；控制溶液条件，例如离子强度、离子组成、离液剂的添加和竞争探针的添加。

一些实施方案提供一种通过重复查询探针结合来鉴定分析物的方法。在一些实施方案中，方法包括将分析物固定到固体支持物。在一些实施方案中，所述固体支持物是表面(例如，基本上平面的表面、圆形表面)，例如与主体溶液(例如，包含分析物的主体溶液)接触的表面。在一些实施方案中，固体支持物是可自由扩散的固体支持物(例如，珠粒、胶体颗粒，例如，具有大约10-1000 nm (例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000nm)的直径的胶体颗粒)，例如，其在主体溶液(例如，包含分析物的主体溶液)内自由扩散。在一些实施方案中，将分析物固定到固体支持物上包括固体支持物和分析物之间的共价相互作用。在一些实施方案中，将分析物固定到固体支持物上包括固体支持物和分析物之间的非共价相互作用。在一些实施方案中，将分析物(例如，分子，例如，例如蛋白质、肽、核酸、小分子、脂质、代谢物、药物等的分子)稳定地固定到表面，并且方法包括查询探针与靶分析物的重复(例如，瞬时、低亲和力)结合。在一些实施方案中，方法包括检测查询探针与靶分析物的重复(例如，瞬时、低亲和力)结合。在一些实施方案中，方法包括产生数据集，所述数据集包含由与分析物结合的查询探针产生的信号(例如，作为时间的函数的查询探针信号的数据集)和描述与分析物结合的查询探针的表面上的空间位置的信息(例如，坐标，例如，x,y坐标)。在一些实施方案中，处理(例如，操纵、变换、可视化等)数据集，例如，以改进查询探针结合事件的空间分辨率。例如，在特定实施方案中，对数据集(例如，包含作为时间的函数的查询探针信号和描述与分析物结合的查询探针的表面上的空间位置的信息(例如，坐标，例如x,y坐标))进行处理。在一些实施方案中，所述处理包括逐帧扣除过程，以产生显示在时间序列数据的每个帧内的查询探针结合或解离事件的差异强度分布。在本文所述技术的开发期间收集的数据指示，相对于位置图，差异强度分布具有比查询探针结合信号高的分辨率。在一些实施方案中，在确定每个查询探针结合和/或解离事件的空间位置(例如，x,y坐标)之后，根据空间位置将多个事件聚类，并且对每个聚类内的事件的动力学进行统计分析，以确定事件聚类是否源自给定的靶分析物。

例如，用于定量一种或多种表面固定的或扩散的靶分析物的方法的一些实施方案包括一个或多个步骤，所述步骤包括例如以单分子灵敏度测量一种或多种查询探针与一种或多种固定的靶分析物瞬时结合的信号。在一些实施方案中，方法包括独立于查询探针结合来跟踪靶分析物(例如，检测和/或记录靶分析物的位置)。在一些实施方案中，方法还包括计算作为位置(例如，x,y位置)的函数的表面处的时间依赖性探针结合信号强度变化。在一些实施方案中，计算作为位置(例如，x,y位置)的函数的表面处的时间依赖性查询探针结合信号强度变化产生查询探针与分析物结合的“差异强度分布”。在一些实施方案中，方法包括自差异强度分布以亚像素准确度确定每个查询探针结合和解离事件(“事件”)的位置(例如，x,y位置)。在一些实施方案中，方法包括通过在表面上的位置(例如，x,y位置)将事件分组为局部聚类，例如，以关联单个固定的靶分析物的事件。在一些实施方案中，方法包括由事件的每个局部聚类计算动力学参数以确定所述聚类是否源自特定分析物，例如源自与特定分析物的瞬时探针结合。

方法的实施方案在被检测的分析物方面不受限制。例如，在一些实施方案中，分析物是多肽，例如蛋白质或肽。在一些实施方案中，靶分析物是核酸。在一些实施方案中，靶分析物是小分子。

在一些实施方案中，靶分析物与查询探针之间的相互作用可区别地受靶分析物的共价修饰影响。例如，在一些实施方案中，分析物是包含翻译后修饰的多肽，例如包含翻译后修饰的蛋白质或肽。在一些实施方案中，多肽的翻译后修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如，查询探针信号是多肽上翻译后修饰的存在或不存在的函数。例如，在一些实施方案中，分析物是包含表观遗传修饰的核酸，例如包含甲基化碱基的核酸。在一些实施方案中，分析物是包含对靶分析物的核碱基、核糖或脱氧核糖部分的共价修饰的核酸。

在一些实施方案中，核酸的修饰影响查询探针与分析物的瞬时结合，例如，查询探针信号是核酸上修饰的存在或不存在的函数。

在一些实施方案中，翻译后修饰与查询探针之间的瞬时相互作用由化学亲和标签(例如包含核酸的化学亲和标签)介导。

在一些实施方案中，查询探针是核酸或适体。

在一些实施方案中，查询探针是低亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。

在一些实施方案中，查询探针是DNA结合蛋白、RNA结合蛋白或DNA结合核糖核蛋白复合物。

在一些实施方案中，通过对差异强度分布进行质心确定、高斯函数(Gaussianfunction)的最小二乘拟合、艾里斑函数(airy disk function)的最小二乘拟合、多项式函数(例如，抛物线)的最小二乘拟合或最大似然估计来确定每个结合或解离事件的位置，例如(x,y)位置。

在一些实施方案中，捕获探针是高亲和力抗体、抗体片段或纳米抗体。在一些实施方案中，捕获探针是核酸。在一些实施方案中，捕获通过将靶分析物交联至表面的共价键介导。在一些实施方案中，在表面固定之前，在存在载体的情况下使靶分析物经受热变性。在一些实施方案中，在表面固定之前，在存在载体的情况下使分析物经受化学变性，例如，用变性剂(如尿素、甲酰胺、盐酸胍、高离子强度、低离子强度、高pH、低pH或十二烷基硫酸钠(SDS))使分析物变性。

组合物

所述技术的实施方案涉及用于检测、表征、鉴定和/或定量分析物的组合物。所述技术的实施方案包括查询探针部分和捕获探针部分。在一些实施方案中，所述捕获探针部分包含标记。在一些实施方案中，所述查询探针部分包含标记。在一些实施方案中，捕获探针部分包含第一标记，并且查询探针部分包含第二标记。在一些实施方案中，第一标记和第二标记是FRET对。在一些实施方案中，第一标记包含荧光部分，并且第二标记包含猝灭剂部分。捕获探针部分和查询探针部分能够与分析物缔合。在一些实施方案中，捕获探针部分和查询探针部分能够同时与分析物缔合(例如，在一些实施方案中，捕获探针部分和查询探针部分同时与分析物缔合)。

特定地，在一些实施方案中，捕获探针部分以高热力学稳定性与分析物(例如，分析物的第一区域)缔合(例如，结合) (例如，形成捕获探针部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度比测量温度高超过10℃或平均寿命超过观察期的10倍)。在一些实施方案中，捕获探针部分与分析物(例如，分析物的第一区域)缔合(例如，结合)，以形成捕获探针部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度比测量温度高超过5℃(例如，超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃)或平均寿命超过观察期的5倍(例如，超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500或1000倍)。

此外，在一些实施方案中，查询探针部分以中等至低的热力学稳定性与分析物(例如，分析物的第二区域)缔合(例如，形成查询探针部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内或平均寿命不超过观察期的1/5)。在一些实施方案中，查询探针部分与分析物(例如，分析物的第二区域)缔合，以形成查询探针部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内(例如，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0℃内)或平均寿命不超过观察期的1/5 (例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20倍)。

一些实施方案任选地包含诱饵部分。在一些实施方案中，诱饵部分以中等至低的热力学稳定性与分析物缔合(例如，形成诱饵部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内或平均寿命不超过观察期的1/5)。在一些实施方案中，诱饵部分与分析物缔合以形成查询探针部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内(例如，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0℃内)或平均寿命不超过观察期的1/5 (例如，不超过0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20倍)。在一些实施方案中，诱饵部分包含标记。在一些实施方案中，诱饵部分包含猝灭剂部分。

在一些实施方案中，当捕获探针和查询探针两者都与分析物缔合时，组合物或系统处于“状态1”。在一些实施方案中，状态1包含非常靠近的捕获探针的标记和查询探针的标记(例如，捕获探针的标记和查询探针的标记之间的距离小于15 nm (例如，小于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 nm))。在一些实施方案中，当查询探针不与分析物缔合时，组合物或系统处于“状态2”。在一些实施方案中，状态2包含相距甚远的捕获探针的标记和查询探针的标记(例如，捕获探针的标记和查询探针的标记之间的距离大于5 nm至10 nm(例如，相距大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 nm或更远))。

一些实施方案任选地包含锚部分。在一些实施方案中，锚部分固定捕获探针部分(例如，至固体支持物、表面、相界)。在一些实施方案中，当捕获探针部分结合分析物时，锚部分固定捕获探针部分和分析物(例如，至固体支持物、表面、相界)。在一些实施方案中，锚部分连接到固体支持物(例如，表面、珠粒、颗粒、相界等)。在一些实施方案中，锚部分包含能够与表面或相界(例如，包含亲和标签或官能团)共价或非共价相互作用的亲和标签或官能团。在一些实施方案中，表面或相界包含能够与锚基团的部分(例如，包含亲和标签或官能团)结合的亲和标签或官能团。例如，在一些实施方案中，锚部分包含生物素(例如，用于结合抗生物素蛋白和/或链霉亲和素)、链霉亲和素(例如，用于结合生物素)、地高辛(例如，用于结合抗地高辛)或抗地高辛(例如，用于结合地高辛)。在一些实施方案中，锚部分包含用于点击化学介导的固定的点击化学部分(例如，用于与炔反应的叠氮化物、用于与叠氮化物反应的炔)。在一些实施方案中，表面或相界包含生物素(例如，用于结合抗生物素蛋白和/或链霉亲和素)、链霉亲和素(例如，用于结合生物素)、地高辛(例如，用于结合抗地高辛)或抗地高辛(例如，用于结合地高辛)。在一些实施方案中，表面或相界包含用于锚部分与表面、相界、固体支持物、珠粒等的点击化学介导固定的点击化学部分(例如，用于与炔反应的叠氮化物、用于与叠氮化物反应的炔)。在一些实施方案中，锚部分包含抗体或抗体的表位结合片段。在一些实施方案中，锚部分包含被抗体或表位结合抗体片段特异性识别和/或能够被抗体或表位结合抗体片段特异性结合的表位。在一些实施方案中，表面或相界包含抗体或抗体的表位结合片段。在一些实施方案中，表面或相界包含被抗体或表位结合抗体片段特异性识别和/或能够被抗体或表位结合抗体片段特异性结合的表位。

所述技术涵盖各种实施方案，其中查询探针部分、捕获探针部分和/或诱饵部分中的一种或多种彼此连接(例如，通过接头或间隔基)和/或连接到锚部分(例如，通过接头或间隔基)。

在一些实施方案中，示例性共价连接包含核酸、多肽和/或有机部分。在一些实施方案中，如本领域所理解的“接头”连接所述技术的一种或多种组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分和/或任选的锚部分)。在一些实施方案中，“接头”或“间隔基”(例如下述的)连接所述技术的一种或多种组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分和/或任选的锚部分)，例如，含有连接所述技术的一种或多种组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分和/或任选的锚部分)的原子(例如，碳、氮、氧等)的链的任何分子。在一些实施方案中，接头或间隔基具有例如1-250 nm(例如，大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245或250 nm)的长度。在一些实施方案中，接头或间隔基包含烷烃链，例如包含大约5至2000个C-C键或类似键(例如，C-N、C-O等)。在一些实施方案中，间隔基包括聚醛、聚(甲基丙烯酸烷基酯)、聚(环氧乙烷)、聚烯烃、聚(ω-链烯酸酯)等。在一些实施方案中，接头或间隔基是包含5-50 nt (例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 nt)的核酸。

在一些实施方案中，捕获探针部分和查询探针部分直接或间接地彼此连接。例如，在一些实施方案中，捕获探针部分共价连接(例如，通过一个或多个共价键)到查询探针部分。在一些实施方案中，捕获探针部分非共价连接(例如，通过一种或多种非共价结合相互作用)到查询探针部分。在一些实施方案中，捕获探针部分通过共价键和非共价相互作用的混合连接到查询探针部分。

在一些实施方案中，捕获探针部分和查询探针部分不(例如，不直接和不间接)彼此连接。因此，在一些实施方案中，捕获探针部分和查询探针部分在溶液中本质上、基本上、实际上彼此独立地移动。

在一些实施方案中，任选的诱饵部分直接连接到查询探针部分(例如，通过如本文所述的接头或间隔基)。在一些实施方案中，查询探针部分、捕获探针部分和/或任选的诱饵部分中的一种或多种直接连接到锚部分(例如，通过如本文所述的间隔基或接头)。

在一些实施方案中，任选的诱饵不(例如，不直接地且不间接地)连接到查询探针。因此，在一些实施方案中，诱饵部分和查询探针部分在溶液中本质上、基本上、实际上彼此独立地移动。

所述技术涵盖各种实施方案，其中查询探针部分、捕获探针部分和/或诱饵部分中的一种或多种彼此连接(例如，通过接头或间隔基)和/或连接到锚部分(例如，通过接头或间隔基)。因此，在一些实施方案中，捕获探针部分连接到锚部分，并且查询探针部分在溶液中。在一些实施方案中，捕获探针部分连接到锚部分，查询探针在溶液中，并且诱饵部分在溶液中。在一些实施方案中，捕获探针部分连接到锚部分，查询探针在溶液中，并且诱饵部分连接到捕获探针部分。在一些实施方案中，捕获探针部分连接到锚探针部分，查询探针连接到捕获探针部分，并且诱饵部分在溶液中。在一些实施方案中，捕获探针部分连接到锚探针部分，查询探针连接到捕获探针部分，并且诱饵部分连接到捕获探针部分。

在一些实施方案中，捕获探针部分连接到锚部分并且查询探针部分连接到诱饵部分，但查询探针部分和诱饵部分均不连接到捕获探针部分，并且查询探针部分和诱饵部分均不连接到锚部分。

在一些实施方案中，捕获探针部分连接到查询探针部分。在一些实施方案中，捕获探针部分连接到诱饵部分。在一些实施方案中，诱饵部分连接到查询探针部分。在一些实施方案中，捕获探针部分、查询探针部分和诱饵部分都彼此连接。

在这些各种实施方案中，各种连接可以是直接的、间接的或直接和间接的组合。也就是说，在各种实施方案中，各种连接的组分直接或间接地彼此连接。例如，在一些实施方案中，第一组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分、任选的锚部分)共价连接(例如，通过一个或多个共价键)到第二组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分、任选的锚部分)。在一些实施方案中，第一组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分、任选的锚部分)非共价连接(例如，通过一种或多种非共价结合相互作用)到第二组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分、任选的锚部分)。在一些实施方案中，第一组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分、任选的锚部分)通过共价键和非共价结合相互作用的混合连接到第二组分(例如，捕获探针部分、查询探针部分、任选的诱饵部分、任选的锚部分)。

在一些实施方案中，组合物包含成像缓冲液。在一些实施方案中，成像缓冲液包含pH缓冲液、一种或多种盐和水。在一些实施方案中，成像缓冲液包含离子离液剂。在一些实施方案中，成像缓冲液包含非离子离液剂。在一些实施方案中，成像缓冲液包含盐酸胍、甲酰胺或尿素。在一些实施方案中，成像缓冲液包含大约10%甲酰胺(例如，大约7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、11.1%、11.2%、11.3%、11.4%、11.5%、11.6%、11.7%、11.8%、11.9%、12.0%、12.1%、12.2%、12.3%、12.4%、12.5%、12.6%、12.7%、12.8%、12.9%、13.0%、13.1%、13.2%、13.3%、13.4%、13.5%、13.6%、13.7%、13.8%、13.9%、14.0%、14.1%、14.2%、14.3%、14.4%、14.5%、14.6%、14.7%、14.8%、14.9%、15.0%、15.1%、15.2%、15.3%、15.4%、15.5%、15.6%、15.7%、15.8%、15.9%、16.0%、16.1%、16.2%、16.3%、16.4%、16.5%、16.6%、16.7%、16.8%、16.9%、17.0%、17.1%、17.2%、17.3%、17.4%、17.5%、17.6%、17.7%、17.8%、17.9%、18.0%、18.1%、18.2%、18.3%、18.4%、18.5%、18.6%、18.7%、18.8%、18.9%、19.0%、19.1%、19.2%、19.3%、19.4%、19.5%、19.6%、19.7%、19.8%、19.9%或20.0%甲酰胺)。

FRET对和荧光团-猝灭剂对

福斯特或荧光共振能量转移(FRET)是一种物理现象，其中处于激发态的供体荧光团非辐射地将其激发能量转移到相邻的受体荧光团，从而引起受体发射其特征性荧光。

如本文所用，“FET”是指“荧光能量转移”。如本文所用，“FRET”是指“荧光共振能量转移”。这些术语在本文中用于指辐射能量转移过程和非辐射能量转移过程两者。例如，发射光子的过程和涉及长程电子转移的过程包括在这些术语内。在一些实施方案中，这两种现象都包含在通用术语“供体-受体能量转移”下。

如本文所用，“FRET对”是指一对荧光标记，其中当第一标记在其激发波长下被激发时，其在第二标记的激发波长下发射，从而如果这两个标记紧密靠近，则引起第二标记在其发射波长下发射。因此，在第一标记的激发波长下被激发时，FRET对在第二标记的发射波长下发射。FRET是本领域技术人员众所周知的。参见例如Ishikawa-Ankershold等(2012)“Advanced fluorescence microscopy techniques - FRAP, FLIP, FLAP, FRET andFLIM” Molecules 17(4):4047-132；Shrestha等，(2015) “Understanding FRET as aresearch tool for cellular studies” Int J Mol Sci 16(4):6718-56；Bajar等，(2016) “A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs” Sensors (Basel)16(9)；以及Bunt和Wouters (2017) “FRET from single to multiplexed signaling events”Biophys Rev 9(2): 119-129，其各自通过引用整体并入本文中。

一些实施方案涉及FRET对的用途。例如，在一些实施方案中，捕获探针部分包含FRET对的第一成员(例如，第一荧光染料)，并且查询探针部分包含FRET对的第二成员(例如，第二荧光染料)。

在一些实施方案中，荧光团是有机荧光团。在一些实施方案中，有机荧光团包含例如带电(例如，离子)分子(例如，磺酸根或铵基)、不带电(例如，中性)分子、饱和分子、不饱和分子、环状分子、双环分子、三环分子、多环分子、无环分子、芳族分子和/或杂环分子(例如，被一个或多个选自例如氮、氧和硫的杂原子环取代)。在不饱和荧光团的特定情况下，荧光团含有一个、两个、三个或更多个碳-碳和/或碳-氮双键和/或三键。在一个特定实施方案中，除了可能在荧光团中的任何芳族基团之外，荧光团含有至少两个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)共轭双键。在其他实施方案中，荧光团是含有至少两个、三个、四个、五个或六个环(例如，萘、芘、蒽、䓛、三亚苯、并四苯、薁和菲)的稠合多环芳族烃(PAH)，其中PAH可以任选地被一个、两个、三个或更多个杂原子或含杂原子的基团环取代或衍生化。

本文考虑的荧光团可以吸收和发射任何波长的光。然而，在不同的实施方案中，可能需要选择具有特定吸收和发射特性的荧光团。例如，在不同的实施方案中，荧光团优选在200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800 nm的纳米(nm)波长下或在由前述值中的任意两个界定的范围内吸收。在不同的实施方案中，荧光团优选在前述波长中的任一个下或在由前述值中的任意两个界定的范围内发射，其中应理解，荧光团通常在比吸收波长高的波长下发射。入射电磁辐射(例如，其被荧光团吸收)可以是分散形式，或者可替代地，聚焦形式，例如激光。此外，吸收或发射的辐射可以是例如远红外、红外、远红光、可见、近紫外或紫外的形式。当使用两种或更多种荧光团(例如，连接到生物分子，如在FRET和smFRET方法中)时，荧光团中的一种起供体荧光团的作用，并且另一种起受体荧光团的作用。

所述技术在荧光部分的类型、结构或组成方面不受限制。荧光部分的非限制性实例包括可以合成或商业获得(例如，Operon Biotechnologies, Huntsville, Alabama)的染料。大量染料(大于50种)可用于荧光激发应用。这些染料包括来自荧光素、罗丹明、AlexaFluor、Bodipy、香豆素和花青染料家族的那些。荧光团的具体实例包括但不限于FAM、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、VIC (例如，来自Life Technologies)、德克萨斯红(Texas red)、LC红640、Cy5和LC红705。在一些实施方案中，具有410 nm (例如，Cascade Blue)至775 nm(例如，Alexa Fluor 750)的发射最大值的染料是可用的并且可以被使用。当然，本领域普通技术人员将认识到，也可以使用具有在这些范围之外的发射最大值的染料。在一些情况下，在500 nm至700 nm范围内的染料具有在可见光谱内的优点，并且可以使用现有光电倍增管检测。在一些实施方案中，宽范围的可用染料允许选择具有遍布检测范围的发射波长的染料组。能够区别许多染料的检测系统是本领域已知的。

因此，在一些实施方案中，有机荧光团是氧杂蒽衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、曙红和德克萨斯红)、花青或其衍生物或亚类(例如，链花青、半花青、闭链花青、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青、部花青和酞菁)、萘衍生物(例如，丹酰和prodan衍生物)、香豆素及其衍生物、噁二唑及其衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)、芘及其衍生物、噁嗪及其衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝和甲酚紫)、吖啶衍生物(例如，原黄素、吖啶橙和吖啶黄)、芳基甲川衍生物(例如，金胺、结晶紫和孔雀绿)和四吡咯衍生物(例如，卟啉和胆红素)。本文考虑的染料的一些特定家族为CY染料家族(例如，Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)、ALEXA染料家族(例如，ALEXA Fluor 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700、750和790)、ATTO染料家族(例如，ATTO 390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、601、615、619、629、635、645、663、680、700、729和740)和DY染料家族(例如，DY530、547、548、549、550、554、556、560、590、610、615、630、631、631、632、633、634、635、636、647、648、649、650、651、652、675、676、677、680、681、682、700、701、730、731、732、734、750、751、752、776、780、781、782和831)。特定地，ATTO染料可以具有几种结构基序，包括香豆素基、若丹明基、卡巴隆基(carbopyronin-based)和噁嗪基结构基序。

在一些实施方案中，荧光染料包括但不限于染料，例如d-罗丹明受体染料，包括Cy5、二氯[R110]、二氯[R6G]、二氯[TAMRA]、二氯[ROX]等，荧光素供体染料，包括荧光素、6-FAM等；吖啶，包括吖啶橙、吖啶黄、原黄素、pH 7等；芳族烃，包括2-甲基苯并噁唑、对二甲氨基苯甲酸乙酯、苯酚、吡咯、苯、甲苯等；芳基甲川染料，包括金胺O、结晶紫, H

在另一实施方案中，荧光团具有无机组成。例如，荧光团可以包括荧光过渡金属或稀土(例如，镧系元素)金属物类或颗粒(例如，纳米颗粒或微粒)。过渡金属或稀土金属物类可以是例如金属-配体络合物。配体可以是任何合适的配体，例如乙酰丙酮化物、希夫碱(Schiff base)(例如，salen)、胺、膦、硫醇、菲咯啉、联吡啶或酚盐基配体。“过渡金属”意指周期表的第IB至VIIIB族的金属中的任一种。“稀土金属”意指原子序数分别为57-71和90-103的镧系元素和锕系元素中的任一种。本文考虑的一些特定稀土金属包括镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥和铪及其组合。

在一个实施方案中，荧光纳米颗粒含有非荧光基质(例如，聚合物、陶瓷或金属)，在所述基质中包括有机或无机荧光物类(例如，在纳米颗粒的表面内或纳米颗粒的表面上)。在特定实施方案中，颗粒包括有机聚合物(例如，聚苯乙烯)或无机聚合物(例如，二氧化硅或硅氧烷基)。在另一个实施方案中，颗粒包括金属，例如基于铜、银、金、钯或铂或其组合的纳米颗粒。在另一个实施方案中，荧光颗粒具有半导体(例如，量子点)组成。量子点颗粒通常包括第IB族元素(例如，Cu或Ag)、第II族元素(例如，Zn或Cd)或第III族元素(例如，B、Al、Ga或In)或这些元素的组合的硫化物、硒化物、碲化物、氮化物、磷化物、砷化物和/或锑化物。此外，量子点在结构上可以是本质上均匀的，或者替代地，分层的(例如，核-壳量子点)。这种量子点的核和壳可以独立地由上述半导体组合物中的任一种(例如，ZnS:CdSe、ZnSe:CdSe、ZnS:CdS、ZnSe:CdS、CdS:ZnSe、CdSe:ZnSe、CdS:ZnS或CdSe:ZnS类型的“核:壳”组合物)构成。在一些实施方案中，通过并入量子点的核或壳中或通过吸附或连接到量子点的表面或钝化壳，量子点还包括掺杂剂荧光物类，例如上述稀土金属或有机荧光物类中的任一种。

在不同实施方案中，颗粒(特定地，量子点)具有例如1、2、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120 nm的尺寸(例如，直径)，或在由前述值中的任意两个界定的范围内的尺寸。不是量子点的金属颗粒可以是前述尺寸中的任一种，以及显著更大的尺寸，例如约、至少或不超过150、200、250、300、350、400或500 nm，或在由前述值中的任意两个界定的范围内的尺寸。聚合物颗粒可以是前述尺寸中的任一种，以及显著更大的尺寸，例如约、至少或不超过600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000 nm，或在由前述值中的任意两个界定的范围内的尺寸。

一些实施方案涉及荧光染料和猝灭剂部分的用途。例如，在一些实施方案中，捕获探针部分包含荧光染料，并且查询探针部分包含猝灭剂部分；在一些实施方案中，捕获探针部分包含猝灭剂部分，并且查询探针部分包含荧光染料。如本文所用，“猝灭基团”或“猝灭部分”和类似术语是指可以至少部分地衰减由荧光染料发射的能量(例如，光)的任何荧光-修饰基团。这种衰减在本文中称为“猝灭”。因此，在存在猝灭基团的情况下，荧光染料的照射导致来自荧光染料的发射信号，所述发射信号的强度低于预期，或甚至完全不存在。猝灭通常通过在荧光染料和猝灭基团之间的能量转移发生。

此外，所述技术在猝灭部分的类型、结构或组成方面不受限制。示例性猝灭部分包括黑洞猝灭剂(Black Hole Quencher)、爱荷华黑猝灭剂(Iowa Black Quencher)及其衍生物、修饰和相关部分。示例性猝灭部分包括BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。

在一些实施方案中,荧光染料-猝灭剂对包括例如DLO-FB1 (5′-FAM/3′-BHQ-1)、DLO-TEB1 (5′-TET/3′-BHQ-1)、DLO-JB1 (5′-JOE/3′-BHQ-1)、DLO-1-HB1 (5′-HEX/3′-BHQ-1)、DLO-C3B2 (5′-Cy3/3′-BHQ-2)、DLO-TAB2 (5′-TAMRA/3′-BHQ-2)、DLO-RB2 (5′-ROX/3′-BHQ-2)、DLO-C5B3 (5′-Cy5/3′-BHQ-3)、DLO-C55B3 (5′-Cy5.5/3′-BHQ-3)、MBO-FB1 (5′-FAM/3′-BHQ-1)、MBO-TEB1 (5′-TET/3′-BHQ-1)、MBO-JB1 (5-JOE/3′-BHQ-1)、MBO-HB1 (5′-HEX/3′-BHQ-1)、MBO-C3B2 (5′-Cy3/3′-BHQ-2)、MBO-TAB2 (5′-TAMRA/3′-BHQ-2)、MBO-RB2 (5′-ROX/3′-BHQ-2)、MBO-C5B3 (5′-Cy5/3′-BHQ-3)、MBO-C55B3 (5′-Cy5.5/3′-BHQ-3)或可从Novato, Calif.的Biosearch Technologies, Inc.购得的类似FRET对。参见例如美国专利申请公开案号US20100317005，其通过引用并入本文中。

诱饵

一些实施方案包含任选的诱饵部分。所述诱饵部分与查询探针部分弱结合，因此与分析物竞争结合查询探针部分。因此，在存在诱饵部分的情况下查询探针部分与分析物的相互作用的动力学与在不存在诱饵部分的情况下查询探针部分与分析物的相互作用的动力学不同。特定地，相对于状态1 (查询探针与分析物缔合)，诱饵部分延长了状态2 (查询探针与分析物解离)的寿命。如本文所述，在一些实施方案中，诱饵部分共价或非共价地连接到查询探针和/或所述技术的其他组分(如图1a中所描绘)。在一些实施方案中，诱饵部分以“反式”引入(例如，在溶液中)(如图2c中所描绘)。在一些实施方案中，诱饵部分与分析物类似，例如，具有与分析物类似的结构、一级序列、表位、对查询探针的亲和性等的蛋白质；具有与分析物类似的结构、一级序列、表位、对查询探针的亲和性等的核酸；具有与分析物类似的结构、一级序列、表位、对查询探针的亲和性等的小分子。例如，在一些实施方案中，诱饵是具有一级氨基酸序列的多肽，所述一级氨基酸序列与分析物的一级氨基酸序列具有90%或更高同一性(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%同一性)。在一些实施方案中，诱饵是具有一级核苷酸序列的核酸，所述一级核苷酸序列与分析物的一级核苷酸序列具有90%或更高同一性(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%同一性)。在一些实施方案中，诱饵是具有一级氨基酸序列的多肽，所述一级氨基酸序列相对于分析物的一级氨基酸序列包含一个或多个取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代)。在一些实施方案中，诱饵是具有一级核苷酸序列的核酸，所述一级核苷酸序列相对于分析物的一级核苷酸序列包含一个或多个突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变)。在一些实施方案中，诱饵是具有一级核苷酸和/或氨基酸序列的核酸和/或多肽，所述一级核苷酸和/或氨基酸序列相对于分析物的一级核苷酸和/或氨基酸序列包含一个或多个修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰)。在一些实施方案中，诱饵是具有如下结构的分子：包含一个或多个与分析物的结构的取代基(例如，“R”基团)不同的取代基(例如，“R”基团)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代基(例如，“R”基团))。

方法

方法的实施方案根据所述技术提供。例如，在一些实施方案中，所述技术包括提供捕获探针部分(例如，包含荧光部分和/或猝灭剂部分)和查询探针部分(例如，包含荧光部分和/或猝灭剂部分)。在一些实施方案中，所述技术包括提供捕获探针部分(例如，包含第一荧光部分)和查询探针部分(例如，包含第二荧光部分)。在一些实施方案中，第一荧光部分和第二荧光部分是FRET对。在一些实施方案中，荧光部分和猝灭剂部分是荧光-猝灭剂对。一些实施方案还提供如本文所述的任选的诱饵部分和/或如本文所述的任选的锚部分。

一些实施方案包括提供表面、基质(substrate)和/或相界，其直接(例如，通过一个或多个共价键)与锚部分相互作用或非共价(例如，通过一个或多个非共价结合相互作用)与锚部分相互作用。因此，一些实施方案包括将锚部分固定到例如表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界。例如，在一些实施方案中，所述技术包括提供表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界，和使锚部分接触所述表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界。在一些实施方案中，所述技术包括使锚部分与表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界反应以通过共价键(例如，通过在锚部分的反应基团与表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界的反应基团之间产生共价键的化学反应(例如，通过点击化学反应))将锚部分连接到表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界。在一些实施方案中，所述技术包括使锚部分接触表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界，以在锚部分与表面、基质、珠粒、固体支持物和/或相界之间形成热力学稳定的非共价结合相互作用。

在一些实施方案中，锚部分连接到捕获探针。在一些实施方案中，锚部分连接到捕获探针、查询探针和/或任选的诱饵中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述技术还包括使捕获探针与样品接触。在一些实施方案中，所述样品疑似包含分析物。在一些实施方案中，样品包含分析物。

在一些实施方案中，所述技术包括提供成像缓冲液。在一些实施方案中，成像缓冲液包含pH缓冲液、一种或多种盐和水。在一些实施方案中，成像缓冲液包含离子离液剂。在一些实施方案中，成像缓冲液包含非离子离液剂。在一些实施方案中，成像缓冲液包含盐酸胍、甲酰胺或尿素。在一些实施方案中，成像缓冲液包含大约10%甲酰胺(例如，大约7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、11.1%、11.2%、11.3%、11.4%、11.5%、11.6%、11.7%、11.8%、11.9%、12.0%、12.1%、12.2%、12.3%、12.4%、12.5%、12.6%、12.7%、12.8%、12.9%、13.0%、13.1%、13.2%、13.3%、13.4%、13.5%、13.6%、13.7%、13.8%、13.9%、14.0%、14.1%、14.2%、14.3%、14.4%、14.5%、14.6%、14.7%、14.8%、14.9%、15.0%、15.1%、15.2%、15.3%、15.4%、15.5%、15.6%、15.7%、15.8%、15.9%、16.0%、16.1%、16.2%、16.3%、16.4%、16.5%、16.6%、16.7%、16.8%、16.9%、17.0%、17.1%、17.2%、17.3%、17.4%、17.5%、17.6%、17.7%、17.8%、17.9%、18.0%、18.1%、18.2%、18.3%、18.4%、18.5%、18.6%、18.7%、18.8%、18.9%、19.0%、19.1%、19.2%、19.3%、19.4%、19.5%、19.6%、19.7%、19.8%、19.9%或20.0%甲酰胺)。在一些实施方案中，方法包括检测查询探针与成像缓冲液中的靶标的结合。

在一些实施方案中，所述技术包括使分析物与捕获探针接触。特定地，在一些实施方案中，捕获探针部分以高热力学稳定性与分析物(例如，分析物的第一区域)缔合(例如，结合)。例如，一些实施方案包括形成包含捕获探针和分析物的复合物，所述复合物的解链温度比测量温度高超过10℃或平均寿命超过观察期的10倍。在一些实施方案中，所述技术包括形成包含捕获探针和分析物的复合物，所述复合物的解链温度比测量温度高超过5℃(例如，超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃)或平均寿命超过观察期的5倍(例如，超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500或1000倍)。

然后，一些实施方案包括提供分析物和查询探针和/或使分析物与查询探针接触。在一些实施方案中，所述技术包括使分析物与查询探针接触，所述查询探针以中等至低的热力学稳定性与分析物(例如，分析物的第二区域)缔合。一些实施方案包括形成包含查询探针和分析物的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内或平均寿命不超过观察期的1/5。一些方案包括形成包含查询探针部分和分析物的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内(例如，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0℃内)或平均寿命不超过观察期的1/5 (例如，不超过0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20倍)。

此外，一些实施方案包括提供诱饵部分。一些实施方案包括使诱饵部分与查询探针接触。在一些实施方案中，所述技术包括使诱饵部分与查询探针接触，所述查询探针以中等至低的热力学稳定性与诱饵部分缔合。一些实施方案包括形成包含查询探针和诱饵部分的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内或平均寿命不超过观察期的1/5。一些方案包括形成包含查询探针和诱饵部分的复合物，所述复合物的解链温度在测量温度的10℃内(例如，在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0℃内)或平均寿命不超过观察期的1/5 (例如，不超过0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20倍)。

所述技术的实施方案包括形成包含分析物和捕获部分的热力学稳定的复合物，和使所述分析物与查询探针部分接触，所述查询探针部分以中等至低的热力学稳定性与分析物(例如，分析物的第二区域)缔合。因此，所述技术包括形成包含分析物、捕获探针部分和查询探针部分的瞬时复合物。换句话说，所述技术包括形成包含与查询探针部分瞬时缔合的分析物和捕获探针部分的复合物。

在一些实施方案中，在形成瞬时复合物(包含分析物、捕获探针部分和查询探针部分)时，使捕获探针部分的第一荧光部分和查询探针部分的第二荧光部分紧密靠近，以在第一荧光部分和第二荧光部分之间实现FRET。在一些实施方案中，在形成瞬时复合物(包含分析物、捕获探针部分和查询探针部分)时，使捕获探针部分的荧光部分和查询探针部分的猝灭剂部分紧密靠近以猝灭荧光部分的荧光。在一些实施方案中，在形成瞬时复合物(包含分析物、捕获探针部分和查询探针部分)时，使捕获探针部分的猝灭剂部分和查询探针部分的荧光部分紧密靠近以猝灭荧光部分的荧光。荧光的变化(例如，发射最大值的增加、减小和/或变化(例如，在发射波长或在发射波长范围内的增加和/或减小))指示第一荧光部分和第二荧光部分或荧光部分和猝灭剂部分的空间相对位置的变化。检测FRET或猝灭指示查询探针与分析物的瞬时缔合。

因此，在一些实施方案中，所述技术包括提供激发波长，例如，使捕获探针或查询探针的荧光部分(例如，第一荧光部分)与具有激发荧光部分(例如，第一荧光部分)的波长的光子接触。一些实施方案包括激发捕获探针的荧光部分，并且一些实施方案包括激发查询探针的荧光部分。实施方案包括检测捕获探针或查询探针的荧光部分(例如，第二荧光部分)的发射，例如检测具有发射荧光部分(例如，第二荧光部分)的波长特征的光子。在一些实施方案中，查询探针的荧光部分被光子激发，并且捕获探针的荧光部分发射被检测的光子。在一些实施方案中，捕获探针的荧光部分被光子激发，并且查询探针的荧光部分发射被检测的光子。因此，一些实施方案包括提供激发波长(第一波长)和检测发射波长(第二波长)。一些实施方案包括记录作为时间的函数的发射波长，例如，以提供发射波长的时间依赖性信号(例如，以提供发射波长的强度的时间依赖性信号)。

在一些实施方案中，当查询探针的荧光部分靠近捕获探针的荧光部分(例如，捕获探针的荧光部分与查询探针的荧光部分之间的距离小于15 nm (例如，小于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 nm))时，产生荧光发射信号。当查询探针未与分析物缔合时(例如，当捕获探针的荧光部分与查询探针的荧光部分之间的距离大于5 nm至10 nm (例如，相距大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 nm或更远)时)，未观察到FRET信号。

在一些实施方案中，所述技术是类似的，不同之处在于使用荧光部分和猝灭剂，使得当荧光部分和猝灭部分远离时，荧光部分在其发射波长下具有高荧光强度，并且当荧光部分和猝灭部分靠近时，荧光部分在其发射波长下具有低荧光强度。

因此，在一些实施方案中，所述技术包括监测在许多离散位置(例如，在固定分析物的固体支持物上)(例如，在例如可以处于“开”状态和“关”状态的闪烁的许多荧光“斑点”处)的荧光发射。记录在每个离散位置(例如，在固体支持物上的每个“斑点”)的荧光发射的存在(斑点“开”)和荧光发射的不存在(斑点“关”)。每个斑点“闪烁”-例如，当查询探针在斑点处结合固定的靶分析物时和当查询探针在所述斑点处从固定的靶分析物解离时(在FRET方法的情况下)，所述斑点分别在“开”状态和“关”状态之间交替，并且当查询探针在斑点处结合固定的靶分析物时和当查询探针在所述斑点处从固定的靶分析物解离时(在猝灭方法的情况下)，所述斑点分别在“关”状态和“开”状态之间交替。

因此，在荧光标记的发射波长下检测到荧光发射指示在猝灭方法中查询探针未与固定的分析物结合。或者，在FRET对的荧光标记的发射波长下检测到荧光发射指示在FRET方法中查询探针与分析物结合。查询探针与靶分析物的结合是“结合事件”。在所述技术的一些实施方案中，结合事件具有测量强度大于或小于限定阈值的荧光发射。

例如，在一些实施方案中，结合事件具有高于背景荧光强度(例如，在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有比背景荧光强度(例如，在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)高至少1、2、3、4个或更多个标准偏差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件具有比背景荧光强度(例如，在不存在分析物的情况下观察到的荧光强度)高至少2个标准偏差的荧光强度。在一些实施方案中，结合事件的荧光强度是背景荧光强度(例如，在不存在分析物的情况下观察到的平均荧光强度)的至少1.5、2、3、4或5倍。

因此，在一些实施方案中，在发射波长下检测到具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光指示结合事件已经发生。此外，在一些实施方案中，在发射波长下检测到具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光指示结合事件已经开始。因此，在一些实施方案中，在荧光探针的发射波长下检测到不存在具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光指示结合事件已经结束。结合事件开始时和结合事件结束时之间的时间长度(例如，在荧光探针的发射波长下检测到具有高于限定阈值的强度(例如，比背景强度大至少2个标准偏差)的荧光的时间长度)是结合事件的停留时间。“转变”是指查询探针与靶分析物的缔合和解离(例如，缔合/解离事件)。

根据所述技术的方法包括计数在限定的时间间隔期间查询探针结合事件的数目，所述限定的时间间隔是“采集时间”或“观察期”(例如，数十至数百至数千秒的时间间隔，例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒；例如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟；例如，1、1.5、2、2.5或3小时)。在一些实施方案中，采集时间为大约1秒至10秒至1分钟至10分钟(例如，大约1秒至100秒，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100秒，例如，1分钟至100分钟，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90或100分钟)。在一些实施方案中，采集时间为0.1-20.0秒(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0秒)。

此外，查询探针在结合事件期间保持与分析物结合的时间长度是结合事件的“停留时间”。在采集时间期间检测到的结合事件的数目和/或针对结合事件记录的停留时间的长度是查询探针结合分析物的特征，并且因此提供分析物存在于样品中的指示。

在限定的时间间隔期间(例如，在采集时间期间)监测(例如，使用光源激发第一荧光部分并检测来自第二荧光部分的荧光发射)和/或记录查询探针与固定的分析物的结合和/或查询探针自固定的分析物的解离。例如通过使用计算机和软件(例如，使用隐马尔可夫模型和泊松统计分析数据)确定在采集时间期间查询探针与分析物结合的次数和/或在每个结合事件期间查询探针保持与分析物结合的时间长度以及在每个结合事件之间查询探针保持不与分析物结合的时间长度(例如，分别为结合状态的“停留时间”和未结合状态的“停留时间”)。

在一些实施方案中，测量对照样品(例如，在不存在分析物的情况下)。在对照样品中检测到的荧光是“背景荧光”或“背景(荧光)强度”或“基线”。

在一些实施方案中，包含在发射波长下的荧光强度的测量结果的数据被记录为时间的函数。在一些实施方案中，结合事件的数目和结合事件的停留时间由数据确定(例如，通过确定荧光强度高于阈值背景荧光强度的次数和时间长度)。在一些实施方案中，对转变(例如，查询探针的结合和解离)进行计数。在一些实施方案中，转变的阈值数目用以将样品中分析物的存在与背景信号、非靶分析物和/或查询探针的伪结合区分开。在一些实施方案中，在采集时间期间记录到大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次的转变数目指示样本中分析物的存在。在一些实施方案中，在采集时间期间记录到大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次的转变数目指示描述作为时间的函数的荧光发射的数据是指示与样品中的分析物相关的候选信号。

在一些实施方案中，确定动力学参数。在一些实施方案中，计算动力学参数。例如，在一些实施方案中，动力学参数由描述作为时间的函数的荧光发射的数据确定和/或计算。

在一些实施方案中，确定分析物的转变数目的分布-例如，对于观察到的每个分析物计数转变数目。在一些实施方案中，产生直方图。在一些实施方案中，确定分布(例如，直方图)的特征参数，例如确定分布的平均值、中值、峰值、形状等。在一些实施方案中，数据和/或参数(例如，荧光数据(例如，时域中的荧光数据)、动力学数据、分布的特征参数等)通过例如使用人工智能、模式识别、机器学习、统计推断、神经网络等识别数据中的模式和规律性的算法来分析。在一些实施方案中，所述分析包括使用频率论分析，并且在一些实施方案中，分析包括使用贝叶斯分析。在一些实施方案中，使用已知的“训练”数据(例如，使用监督式学习)来训练模式识别系统，并且在一些实施方案中，使用算法来发现先前未知的模式(例如，无监督式学习)。参见例如Duda等，(2001)

模式识别(例如，使用训练集、监督式学习、无监督式学习和未知样品分析)将所鉴定的模式与分析物相关联，使得特定模式提供特定分析物的“指纹”，其可用于分析物的检测、定量和鉴定。

在一些实施方案中，由分析物产生的分布显著不同于由非分析物产生的分布或在不存在分析物的情况下产生的分布。在一些实施方案中，确定多种分析物(例如，样品中相同分析物的多个个别实例)的平均转变数。在一些实施方案中，对于包含分析物的样品观察到的平均转变数目作为时间的函数近似线性相关，并且具有正斜率(例如，平均转变数目作为时间的函数近似线性增加)。

在一些实施方案中，使用统计学(例如，泊松统计学)处理数据以确定作为时间的函数发生的转变的概率。在一些特定实施方案中，作为时间的函数发生的转变事件的相对恒定概率指示分析物的存在。在一些实施方案中，与事件数目和经过时间有关的相关系数由作为时间的函数发生的转变事件的概率计算。在一些实施方案中，当由作为时间的函数发生的转变事件的概率计算时，大于0.95的与事件数目和经过时间有关的相关系数指示分析物的存在。

在一些实施方案中，结合的查询探针的停留时间(τ

系统

所述技术的一些实施方案提供用于检测和定量分析物的系统。在一些实施方案中，根据所述技术的系统包括例如固体支持物(例如，显微镜载玻片、盖玻片、抗生物素蛋白(例如，链霉亲和素)缀合的显微镜载玻片或盖玻片、包含零模式波导阵列的固体支持物等)和本文所述的组合物的一个或多个实施方案(例如，包含查询探针部分和捕获探针部分，并且任选地包含诱饵部分和/或锚部分)。组合物可以包含如本文的各种实施方案中所述的连接在一起和/或游离于溶液中的这些各种组分。系统的一些实施方案包含成像缓冲液。在一些实施方案中，成像缓冲液包含pH缓冲液、一种或多种盐和水。在一些实施方案中，成像缓冲液包含离子离液剂。在一些实施方案中，成像缓冲液包含非离子离液剂。在一些实施方案中，成像缓冲液包含盐酸胍、甲酰胺或尿素。在一些实施方案中，成像缓冲液包含大约10%甲酰胺(例如，大约7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、11.1%、11.2%、11.3%、11.4%、11.5%、11.6%、11.7%、11.8%、11.9%、12.0%、12.1%、12.2%、12.3%、12.4%、12.5%、12.6%、12.7%、12.8%、12.9%、13.0%、13.1%、13.2%、13.3%、13.4%、13.5%、13.6%、13.7%、13.8%、13.9%、14.0%、14.1%、14.2%、14.3%、14.4%、14.5%、14.6%、14.7%、14.8%、14.9%、15.0%、15.1%、15.2%、15.3%、15.4%、15.5%、15.6%、15.7%、15.8%、15.9%、16.0%、16.1%、16.2%、16.3%、16.4%、16.5%、16.6%、16.7%、16.8%、16.9%、17.0%、17.1%、17.2%、17.3%、17.4%、17.5%、17.6%、17.7%、17.8%、17.9%、18.0%、18.1%、18.2%、18.3%、18.4%、18.5%、18.6%、18.7%、18.8%、18.9%、19.0%、19.1%、19.2%、19.3%、19.4%、19.5%、19.6%、19.7%、19.8%、19.9%或20.0%甲酰胺)。

一些实施方案还包括荧光显微镜，其包括激发结合的查询探针的照明配置(例如，棱镜型全内反射荧光(TIRF)显微镜、物镜型TIRF显微镜、近TIRF或HiLo显微镜、共焦激光扫描显微镜、零模式波导，和/或能够并行监测载玻片或盖玻片的大区域(＞100 μm

一些实施方案包括光学器件，例如透镜、反射镜、分色镜、滤光器等，例如以选择性地检测在特定波长范围或多个波长范围内的荧光。

实施方案包括用于激发荧光部分的光子源(例如，激光或其他电磁辐射源)。

在一些实施方案中，使用基于计算机的分析软件将由检测测定产生的原始数据(例如，一种或多种分析物的存在、不存在或量)转化成临床医生的预测值的数据。临床医生可以使用任何合适的手段来访问预测数据。

例如，一些实施方案包括计算机系统，所述技术的实施方案可以在所述计算机系统上实施。在各种实施方案中，计算机系统包括用于传送信息的总线或其他通信机制以及与总线耦合的用于处理信息的处理器。在各种实施方案中，计算机系统包括耦合到总线的存储器和将由处理器执行的指令，所述存储器可以是随机存取存储器(RAM)或其他动态存储装置。存储器还可以用于在执行将由处理器执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。在各种实施方案中，计算机系统还可以包括只读存储器(ROM)或其他静态存储裝置，其耦合到总线以用于存储静态信息和用于处理器的指令。可以提供存储装置(例如，磁盘或光盘)，并且将其耦合到总线以用于存储信息和指令。

在各种实施方案中，计算机系统经由总线耦合到显示器，例如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，用于向计算机用户展示信息。包括字母数字键和其他键的输入装置可以耦合到总线，用于向处理器传送信息和命令选择。另一种类型的用户输入装置是光标控制，例如鼠标、轨迹球或光标方向键，用于向处理器传送方向信息和命令选择，并用于控制显示器上的光标移动。这种输入装置通常在两个轴(第一轴(例如，x)和第二轴(例如，y))上具有两个自由度，这允许装置指定平面中的位置。

计算机系统可以执行所述技术的实施方案。根据所述技术的某些实施，结果可以由计算机系统响应于处理器执行包含在存储器中的一个或多个指令的一个或多个序列而提供。这样的指令可以从另一种计算机可读介质(例如，存储装置)读入存储器。执行包含在存储器中的指令序列可以使处理器执行本文所述的方法。替代地，可以使用硬接线电路来代替软件指令或与软件指令组合来实施本发明的教导。因此，所述技术的实施不限于硬件电路和软件的任何具体组合。

如本文所用的术语“计算机可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。这样的介质可以采取许多形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质的实例可以包括但不限于光盘或磁盘，例如存储装置。易失性介质的实例可以包括但不限于动态存储器。传输介质的实例可以包括但不限于同轴电缆、铜线和光纤，包括包含总线的导线。

计算机可读介质的常见形式包括例如软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其他磁性介质、CD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡、纸带、任何其他具有孔图案的物理介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式磁带、或计算机可以从其中读取的任何其他有形介质。

各种形式的计算机可读介质可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。例如，指令最初可以在远程计算机的磁盘上携带。远程计算机可以将指令加载到其动态存储器中，并且通过网络连接(例如，LAN、WAN、因特网、电话线)发送指令。本地计算机系统可以接收数据并将其传输到总线。总线可以将数据传送到存储器，处理器从存储器检索并执行指令。由存储器接收的指令可以任选地在由处理器执行之前或之后存储在存储装置上。

根据各种实施方案，构造成由处理器执行以执行方法的指令存储在计算机可读介质上。计算机可读介质可以是存储数字信息的装置。例如，计算机可读介质包括如本领域已知的用于存储软件的紧凑光盘只读式存储器(CD-ROM)。计算机可读介质由适于执行构造成要执行的指令的处理器访问。

根据这样的计算机系统，本文提供的技术的一些实施方案还包括用于收集、存储和/或分析数据(例如，核酸的存在、不存在、浓度)的功能。例如，一些实施方案预期一种系统，其包括处理器、存储器和/或数据库，用于例如存储和执行指令、分析荧光、图像数据、使用数据执行计算、变换数据以及存储数据。在一些实施方案中，算法将统计模型(例如，泊松模型或隐马尔可夫模型)应用于数据。

许多诊断涉及确定一种或多种分析物的存在或核苷酸序列。因此，在一些实施方案中，包含代表多种分析物的存在、不存在、浓度、量或序列性质的变量的方程产生可用于诊断或评估核酸的存在或品质的值。这样，在一些实施方案中，这个值由装置(例如，由与结果有关的指示器(例如，LED、显示器上的图标、声音等))来呈现。在一些实施方案中，装置存储所述值、传送所述值、或使用所述值用于另外计算。在一些实施方案中，方程包含代表一种或多种分析物的存在、不存在、浓度、量或序列性质的变量。

因此，在一些实施方案中，所述技术提供临床医生不需要理解原始数据的另外益处，所述临床医生不太可能在遗传学或分子生物学方面得到训练。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医生。然后，临床医生能够利用所述信息来优化对受试者的护理。本发明预期能够接收、处理信息和传输信息往返于进行测定的实验室、信息提供者、医疗人员和/或受试者的任何方法。例如，在所述技术的一些实施方案中，从受试者获得样品并将其提交到位于世界的任何地方(例如，在与受试者居住的国家或信息最终被使用的国家不同的国家)的概况分析服务(例如，在医疗设施的临床实验室、基因组概况分析业务等)以产生原始数据。在样品包括组织或其他生物样品的情况下，受试者可以访问医疗中心以获得样品并将其送到概况分析中心，或者受试者可以自己收集样品并将其直接送到概况分析中心。在样品包含先前确定的生物信息的情况下，信息可以由受试者直接发送给概况分析服务(例如，包含信息的信息卡可以由计算机扫描，并且数据使用电子通信系统传输到概况分析中心的计算机)。一旦被概况分析服务接收，则处理样品并产生对受试者所需的诊断或预后信息具有特异性的概况。然后以适于由治疗临床医生解释的格式准备概况数据。例如，不是提供原始表达数据，而是准备好的格式可以表示针对受试者的诊断或风险评估，连同针对特定治疗选项的推荐。可以通过任何合适的方法向临床医生展示数据。例如，在一些实施方案中，概况分析服务产生报告，可以将所述报告打印给临床医生(例如，在护理点处)或在计算机监视器上将所述报告展示给临床医生。在一些实施方案中，首先在护理点或在区域设施上分析信息。然后将原始数据发送到中央处理设施，用于进一步分析和/或将原始数据转换成对临床医生或患者可用的信息。中央处理设施提供隐私(所有数据都存储在具有统一安全协议的中央设施中)、速度和数据分析的一致性的优点。然后，中央处理设施可以控制受试者治疗后数据的命运。例如，使用电子通信系统，中央设施可以向临床医生、受试者或研究人员提供数据。在一些实施方案中，受试者能够使用电子通信系统访问数据。受试者可以基于结果选择另外的干预或咨询。在一些实施方案中，数据用于研究用途。例如，数据可以用于进一步优化标志物的包括或消除，作为与疾病相关的特定状况的可用指示。

样品

在一些实施方案中，分析物从生物样品中分离。分析物可以从任何材料(例如，细胞材料(活或死)、细胞外材料、病毒材料、环境样品(例如，宏基因组样品)、合成材料(例如，扩增子，如通过PCR或其他扩增技术提供的扩增子))获得，所述材料从动物、植物、细菌、古细菌、真菌或任何其他生物体获得。用于所述技术的生物样品包括病毒颗粒或其制剂。分析物可以直接从生物体或从自生物体获得的生物样品(例如，血液、尿液、脑脊液、精液、唾液、痰、粪便、毛发、汗液、泪液、皮肤和组织)获得。示例性样品包括但不限于全血、淋巴液、血清、血浆、口腔细胞、汗液、泪液、唾液、痰液、毛发、皮肤、活检组织、脑脊液(CSF)、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、渗出液、溢泌物、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品和拭子、抽吸物(例如，骨髓、细针等)、洗液(例如，口、鼻咽、支气管、支气管肺泡、眼、直肠、肠、阴道、表皮等)、呼吸冷凝液和/或其他样本。

任何组织或体液样本都可以用作用于所述技术的分析物的来源，包括法医样本、存档样本、保存样本和/或长期储存的样本，例如新鲜冷冻的、甲醇/乙酸固定的或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的样本和样品。分析物也可以从培养的细胞(如原代细胞培养物或细胞系)中分离。从中获得分析物的细胞或组织可以被病毒或其他细胞内病原体感染。样品也可以是从生物样品、cDNA文库、病毒或基因组DNA中提取的总RNA。样品也可以是自非细胞来源分离的DNA，例如已经储存在冰箱中的扩增/分离的DNA。

分析物(例如，核酸分子、多肽、脂质、代谢物、糖等)可以例如通过多种技术(例如，Maniatis等，(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,N.Y. (参见例如，第280-281页)描述的那些技术)从生物样品中提取而获得。

在一些实施方案中，所述技术提供分析物的大小选择，例如，以提供包括靶分析物的分子的限定大小范围。

在一些实施方案中，分离(例如，在分开的孔、微孔、微流体通道、样品室、试管、微量离心管或其他容器或隔室中，或在同一隔室的分开的区域中)单细胞(例如，人、哺乳动物、脊椎动物、真核或原核细胞)、单一细胞器(例如，线粒体、细胞核、高尔基体)、亚细胞囊泡(例如，外来体)和/或亚细胞粘性颗粒(例如，无膜细胞器(例如，细胞内外来体、蛋白质聚集体))。在一些实施方案中，通过物理提取(例如，使用抽吸、流体力或光学捕获)从活的或化学固定的细胞、组织、集落或生物流体分离单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒。在一些实施方案中，从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织分离单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒。在一些实施方案中，通过流体(例如，通过荧光激活的细胞分选，FACS)或微流体操作，或通过分离到培养皿、显微镜载玻片或盖玻片的分开的孔或区域中，或在3D细胞培养基或基质的不同区域中，从悬浮液中分离单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒。在一些实施方案中，使用电场和/或磁场来实现单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒与其他生物组分的分离。也就是说，在一些实施方案中，使用电场和/或磁场来分离单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒。

在一些实施方案中，处理(例如，用细胞裂解缓冲液；去污剂(如SDS、Triton X-100或脱氧胆酸盐)；和/或酶(如蛋白酶、脂肪酶或核酸酶))单细胞(例如，人、哺乳动物、脊椎动物、真核或原核细胞)、单细胞器官(例如，线粒体、细胞核、高尔基体)、亚细胞囊泡(例如，外来体)和/或亚细胞粘性颗粒(例如，无膜细胞器(例如，细胞内外来体、蛋白质聚集体))，以从每个单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒释放分析物。在一些实施方案中，在固体支持物上或其附近原位处理单细胞、细胞器、亚细胞囊泡和/或亚细胞粘性颗粒，以释放分析物以便将其捕获在固体支持物的附近区域上。

在一些实施方案中，分析物通过单分子检测方法(例如，SiMREPS)检测。

用途

各种实施方案涉及宽范围分析物的检测。例如，在一些实施方案中，所述技术可用于检测核酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，所述技术可用于检测包含特定靶序列的核酸。在一些实施方案中，所述技术可用于检测包含特定突变(例如，单核苷酸多态性、插入、缺失、错义突变、无义突变、遗传重排、基因融合等)的核酸。在一些实施方案中，所述技术可用于检测多肽(例如，蛋白质、肽)。在一些实施方案中，所述技术可用于检测由包含突变的核酸编码的多肽(例如，包含取代的多肽、截短的多肽、突变体或变体多肽)。

在一些实施方案中，所述技术可用于检测多肽的翻译后修饰(例如，磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化(例如，O-连接的糖基化、N-连接的糖基化、泛素化、官能团的连接(例如，豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、异戊二烯化、法尼基化、香叶基化(geranylation)、香叶酰香叶酰化(geranylgeranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚形成)、羟基化、生物素化、聚乙二醇化、氧化、SUMO化(SUMOylation)、二硫键形成、二硫键裂解、蛋白水解裂解、酰胺化、硫酸化、吡咯烷酮羧酸形成。在一些实施方案中，所述技术可用于检测这些特征的丧失，例如脱磷酸化、脱甲基化、脱乙酰化、脱糖基化、脱酰胺化、脱羟基化、去泛素化等。在一些实施方案中，所述技术可用于检测DNA或RNA的表观遗传修饰(例如，甲基化(例如，CpG位点的甲基化)、羟甲基化)。在一些实施方案中，所述技术可用于检测这些特征的丧失，例如DNA或RNA的脱甲基化等。在一些实施方案中，所述技术可用于检测染色质结构、核小体结构、组蛋白修饰等的改变，以及用于检测对核酸的损伤。

在一些实施方案中，所述技术用作分子诊断测定，例如测定具有小样本体积的样品(例如，血滴，例如用于邮寄服务)。在一些实施方案中，所述技术使用极低丰度分析物生物标志物的灵敏检测提供癌症或传染病的早期检测。在一些实施方案中，所述技术可用于分子诊断学中以测定蛋白质生物标志物的表观遗传修饰(例如，翻译后修饰)。

在一些实施方案中，所述技术可用于表征多分子复合物(例如，表征多分子复合物的一种或多种组分)，例如，多蛋白复合物、核酸/蛋白复合物、分子机器、细胞器(例如，无细胞线粒体，例如，在血浆中)、细胞、病毒颗粒、生物体、组织、或可以被捕获并适合于通过本文所述的技术分析的任何大分子结构或实体。例如，在一些实施方案中，多分子复合物被分离，并且所述技术可用于表征、鉴定、定量和/或检测与多分子复合物相关的一种或多种分子(分析物)。在一些实施方案中，分离胞外囊泡，并且所述技术可用于表征、鉴定、定量和/或检测与囊泡相关的一种或多种分子(分析物)。在一些实施方案中，所述技术可用于表征、鉴定、定量和/或检测存在于囊泡内部的蛋白质(例如，表面蛋白)和/或分析物，例如，蛋白质、核酸或本文所述的其他分析物。在一些实施方案中，在分析之前固定并透化所述囊泡。

尽管本文的公开内容涉及某些说明性实施方案，但应理解，这些实施方案是以举例的方式而不是以限制的方式呈现的。

实施例

实施例1

在本文所述技术的实施方案的开发期间，进行实验以测试除了靶核酸(例如，miR-141)之外还包含三条核酸链的生物传感器的实施方案。

图3a显示生物传感器设计的一个实施方案，除了靶核酸(T)，微RNA hsa-miR-141之外，所述生物传感器设计还包含三条核酸链。捕获探针(C)和查询探针(Q)是长和短的核酸序列，其结合T上的相邻互补区，当C和Q两者都结合T时，导致标记Alexa Fluor 647(AF647, L1)和Cy3 (L2)的并置。

图3b和图3c显示从生物传感器的一个实施方案的实验示范收集的数据。Cy3和AF647的并置容许在这两种染料之间的福斯特共振能量转移(FRET)，并且结果，几乎100%的来自复合物的荧光信号自AF647发射。当Q不与T结合时，Q代之以与诱饵序列D结合，导致FRET效率低，并且几乎100%的来自复合物的荧光自Cy3发射。捕获(C)序列并入锁定核酸(LNA)修饰以得到C探针导致的更大的靶结合稳定性。图3b显示具有结合的hsa-miR-141的单个生物传感器分子的FRET测量。在t＝19秒和t＝47秒时见到高FRET状态(主要是Cy5发射，红色)和低FRET状态(主要是Cy3发射，蓝色)之间的重复转变，容许对与T的相互作用进行动力学表征，并因此提供存在T的明显迹象。图3c显示在不存在T的情况下的FRET测量，仅显示低FRET状态，并因此指示不存在T。

图4a和图4b显示在进行实验以测试诱饵对上述分子内传感器产生的信号的影响期间收集的另外数据。特定地，进行实验以在存在和不存在诱饵(D)的情况下测试如上所述的生物传感器的实施方案(例如，除了靶核酸miR-141之外还包含三条核酸链)。

图4a和图4b的左侧图显示来自个别生物传感器的代表性单分子FRET轨迹；图4a和图4b的右侧图是在36个生物传感器(来自每种条件)中观察到的FRET比率的直方图，其表现出非零FRET效率的至少一个数据点。

图4a描绘由不存在诱饵(D)的生物传感器的单分子FRET测量产生的数据，导致接近1的稳定FRET效率。图4b描绘来自存在7-核苷酸诱饵序列的生物传感器的单分子FRET测量的数据，导致FRET效率在大约1和0.1之间的动态转变。因此，诱饵的存在产生可观察到的FRET转变，这对于没有诱饵的生物传感器是观察不到的。

实施例2

在本文所述技术的实施方案的开发期间，进行实验以将所述技术的成像时间改进到大约10秒/靶核酸分子。特定地，进行实验以收集表征包含不同长度的间隔基的诱饵(D)和/或包含不同长度的间隔基(查询臂环)的查询探针在检测miRNA靶中的FRET状态的数据。在这些实验中，靶分析物(T)、查询探针(Q)和诱饵(D，“竞争者”)是核酸。参见例如图5。收集数据以表征可由高FRET信号(“高FRET状态”)检测的查询-靶复合物(QT)的时间依赖性寿命和可由低FRET信号(“低FRET状态”)检测的查询-诱饵(QD)或游离查询探针状态的时间依赖性寿命，以及系统在高FRET状态和低FRET状态之间的切换。参见例如图5。不受理论束缚，预期构成诱饵的接头的长度将调节在低FRET状态中的停留时间，且查询臂环的长度将调节查询臂的柔性并将相应地影响在高FRET状态和低FRET状态之间切换的动力学和热力学两者。

在这些实验期间收集的数据指示包含6个核苷酸的较短间隔基的诱饵产生更快的转换动力学和朝向高FRET状态的增加的偏倚(见图6)。然而，数据令人惊讶地指示，包含较长间隔基的查询探针导致朝向高FRET状态的更强的偏倚(图6)。不受理论束缚，预期改变查询臂的平衡长度增加查询探针结合靶miRNA的热力学稳定性。数据指示，在所测试的变型设计之中的最佳设计提供快速转换动力学和高FRET状态和低FRET状态的同等采样-最佳设计使用包含6 nt的诱饵和包含18 nt查询臂环的查询探针。这个系统每分钟表现出大约14次转变，这提供仅用1-2分钟(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或130秒)的采集时间检测未扩增的miRNA靶的技术的实施方案。

实施例3

基于上述实验中收集的数据，预期通过减少在查询探针和靶miRNA之间形成的碱基对的数目，将提供成像时间的进一步减少。然而，这也会降低查询探针对靶miRNA的特异性的风险，并且查询探针可能结合其他非靶核酸。因此，在本文提供的技术的实施方案的开发期间，进行实验以使用不同的成像缓冲液条件测试，以加速转换动力学而不减少在查询探针和靶miRNA之间的互补碱基对的数目。数据指示，将离子强度从大约600 mM降低到150mM没有提供显著的转换动力学加速。然而，数据指示向成像缓冲液中添加1-10%甲酰胺提供检测靶miRNA的高FRET状态和低FRET状态之间的增加的转换动力学(图7A和图7B)。重要的是，数据指示所述技术对于包含10%甲酰胺的实施方案提供1秒的中值停留时间(图7A和图7B)。使用包含10%甲酰胺(例如，大约7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0%甲酰胺)的成像缓冲液收集的仅前10秒的数据的分析揭示大多数分子在这个时间间隔内表现出大约10-25个FRET转变(图7C)。因此，在一些实施方案中，所述技术提供对于每种靶分析物(例如，miRNA靶)在仅大约10秒(例如，大约1.00、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、2.10、2.20、2.30、2.40、2.50、2.60、2.70、2.80、2.90、3.00、3.10、3.20、3.30、3.40、3.50、3.60、3.70、3.80、3.90、4.00、4.10、4.20、4.30、4.40、4.50、4.60、4.70、4.80、4.90、5.00、5.10、5.20、5.30、5.40、5.50、5.60、5.70、5.80、5.90、6.00、6.10、6.20、6.30、6.40、6.50、6.60、6.70、6.80、6.90、7.00、7.10、7.20、7.30、7.40、7.50、7.60、7.70、7.80、7.90、8.00、8.10、8.20、8.30、8.40、8.50、8.60、8.70、8.80、8.90、9.00、9.10、9.20、9.30、9.40、9.50、9.60、9.70、9.80、9.90、10.00、10.10、10.20、10.30、10.40、10.50、10.60、10.70、10.80、10.90、11.00、11.10、11.20、11.30、11.40、11.50、11.60、11.70、11.80、11.90、12.00、12.10、12.20、12.30、12.40、12.50、12.60、12.70、12.80、12.90、13.00、13.10、13.20、13.30、13.40、13.50、13.60、13.70、13.80、13.90、14.00、14.10、14.20、14.30、14.40、14.50、14.60、14.70、14.80、14.90、15.00、15.10、15.20、15.30、15.40、15.50、15.60、15.70、15.80、15.90、16.00、16.10、16.20、16.30、16.40、16.50、16.60、16.70、16.80、16.90、17.00、17.10、17.20、17.30、17.40、17.50、17.60、17.70、17.80、17.90、18.00、18.10、18.20、18.30、18.40、18.50、18.60、18.70、18.80、18.90、19.00、19.10、19.20、19.30、19.40、19.50、19.60、19.70、19.80、19.90或20.00秒)内执行的靶存在、量和/或浓度的测量。

以上说明书中提到的所有出版物和专利出于所有目的通过引用整体并入本文中。在不背离所述技术的范围和精神的情况下，所述技术的描述的组合物、方法和用途的各种修改和变型对本领域的技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的示例性实施方案描述了所述技术，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不当地限于这样的具体实施方案。实际上，对于本领域的技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种修改意欲在所附权利要求书的范围内。