干预BOK在制备治疗新冠肺炎药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，公开了干预BOK在制备治疗新冠肺炎药物中的应用。为给新冠肺炎的综合治疗寻找一种新的免疫治疗方案，本发明对新冠肺炎患者肺组织进行研究发现，BOK在新冠肺炎患者的肺组织细胞内的表达量增加，对BOK基因敲除能抑制新冠病毒膜蛋白诱导人源肺细胞和血管内皮细胞凋亡的作用，通过对小鼠行气管注射慢病毒表达针对BOK的shRNA，BOK的敲减可以抑制新冠病毒膜蛋白诱导肺组织凋亡的作用，提示BOK有望应用于新冠肺炎的综合治疗中，制备成治疗新冠肺炎药物的形式，以减轻新冠肺炎患者肺部损伤和肺泡腔液渗入，适用于新冠肺炎过程中肺组织器官的保护作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及干预BOK在制备治疗新冠肺炎药物中的应用。

背景技术

冠状病毒病2019(COVID-19)是由急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的一种呼吸系统疾病，大多数COVID-19患者表现出轻度至中度症状，但约15％进展为严重的肺炎，约5％最终发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，败血性休克和/或多器官功能衰竭。临床治疗的主要包括对症管理和氧气治疗，并为呼吸衰竭患者提供机械通气。尽管正在积极测试包括核苷酸类似物remdesivir在内的几种抗病毒药物，但尚未存在治疗COVID-19的特效药。除了直接针对病毒或阻断病毒进入的疫苗开发和方法外，解决感染的病理学问题的治疗也成为主要关注点。

SARS-CoV-2感染宿主细胞可导致细胞凋亡，进一步导致器官组织损伤及病变，尤其是肺泡表皮及上皮细胞和紧邻的血管内皮细胞。这些组成宿主免疫“防线/屏障”的细胞的死亡，一方面导致病毒在体内的扩散和感染，加重患者病情，甚至导致继发性感染；另一方面，凋亡的肺上皮细胞和血管内皮细胞会造成组织液渗漏，引起生理功能紊乱。新冠肺炎肺死亡患者肺切片免疫组化，肺表皮细胞受到SARS-CoV-2的侵害后导致的呼吸道病变，包括支气管和肺泡组织的渗出、肺泡壁破坏、肺泡腔含有各种脱落细胞的粘液，使得氧气无法到达肺泡表面进行氧交换。病理报告提示开发一种减轻，甚至是抑制支气管及肺泡内因细胞凋亡造成的碎片脱落和肺泡腔渗出液，能改善肺组织供氧，挽救患者生命。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏能够抑制肺泡内细胞凋亡的方法或药剂的缺陷，首先提供了一种用于治疗新冠肺炎的药物，所述药物能减轻新冠病毒感染引起的肺泡内的细胞凋亡和碎片脱落。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种用于治疗新冠肺炎的药物，所述药物能够抑制或拮抗BOK蛋白表达。

B淋巴细胞瘤-2基因卵巢癌杀伤蛋白(BCL-2ovarian killer，BOK)是介导细胞内源性凋亡中重要途径的参与分子。本发明通过对新冠肺炎患者病理切片研究发现，SARS-CoV-2感染的肺组织细胞呈现强阳性表达的BOK细胞与凋亡活化酶共染，分子水平研究显示SARS-CoV-2的膜蛋白能通过BOK介导细胞凋亡，敲除BOK能废除膜蛋白诱导细胞凋亡的能力，动物体内实验显示，表达SARS-CoV-2膜蛋白的慢病毒感染会导致肺部细胞凋亡和脱落，通过敲减BOK能减轻膜蛋白引起的肺组织凋亡。

优选的，所述药物能够抑制BOK蛋白介导的肺组织内细胞凋亡。

优选的，所述药物还包括药学上可以接受的辅剂。通过与药学上可以接受的辅剂配合使用，能够保证治疗效果的同时，还能够提高药物的安全性，有效性和稳定性。

更优选的，药物的剂型为注射给药剂型或者经胃肠道给药剂型，以增加药物的适用范围；具体地，经胃肠道给给药剂型包括常用的散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等；注射给药剂型包括常用的注射剂(例如静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂)。更优选的，当所述药物的剂型为注射给药剂型时，使用时将药物与生理盐水混合制成溶液即可。

本发明通过研究发现：SARS-CoV-2侵染宿主细胞后合成膜蛋白依赖BOK分子介导细胞凋亡，导致肺泡细胞脱落，凋亡抑制剂和BOK敲减能抑制膜蛋白介导的肺组织凋亡。

因此，本发明还提供特异性抑制BOK蛋白表达的物质在制备治疗新冠肺炎的药物中的应用。

本发明是通过BOK相关药物是抑制机体感染SARS-CoV-2后细胞过度凋亡，抑制肺泡通透性来治疗新冠肺炎。因此，本发明还提供特异性抑制BOK蛋白表达的物质在制备治疗由新冠肺炎病毒引起的肺部细胞凋亡的药物中的应用；优选的，所述肺部细胞为肺泡细胞。

优选的，所述特异性抑制BOK蛋白表达的物质包括以下任一种：

(i)包括但不限于以DDX19A/NOX1转录本为靶序列，且能够抑制DDX19A/NOX1基因表达产物表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；

(ii)包括但不限于能表达或形成(i)中所述小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸构建体；

(iii)包括但不限于含有DDX19A/NOX1互补序列，且能够在转入体内后形成抑制DDX19A/NOX1基因表达产物表达或基因转录的干扰分子的构建体；

(iv)抑制或敲除DDX19A/NOX1基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明对新冠肺炎患者肺组织进行研究发现，BOK在新冠肺炎患者的肺组织细胞内的表达量增加，对BOK基因敲除能抑制新冠病毒膜蛋白诱导人源肺细胞和血管内皮细胞凋亡的作用，通过对小鼠行气管注射慢病毒表达针对BOK的shRNA，BOK的敲减可以抑制新冠病毒膜蛋白诱导肺组织凋亡的作用，提示BOK有望应用于新冠肺炎的综合治疗中，制备成治疗新冠肺炎药物的形式，以减轻新冠肺炎患者肺部损伤和肺泡腔液渗入，适用于新冠肺炎过程中肺组织器官的保护作用。

附图说明

图1为SARS-CoV-2膜蛋白的瞬转表达对人源肺细胞和血管内皮细胞凋亡的影响，图1A为流式分析图，图1B为统计柱状图；

图2为采用WB检测SARS-CoV-2膜蛋白的瞬转表达对细胞内凋亡相关因子的表达的影响；

图3A为采用切片观察和荧光染色检测SARS-CoV-2膜蛋白和BOK敲减对小鼠肺部细胞凋亡和凋亡相关因子的影响；图3B和图3C为采用WB检测SARS-CoV-2膜蛋白和BOK敲减对小鼠肺部细胞凋亡相关因子的影响；

图4A为新冠肺炎患者肺部病理组织切片免疫组化染色(HE)，图4B、图4C和图4D显示胞质内的病毒包涵体、肺泡表皮脱屑、支气管堵塞的脱落细胞和充满嗜酸性粘液的肺泡结构；

图5为采用荧光染色检测健康人和新冠肺炎患者肺组织内BOK强阳性细胞和活化caspase-3。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 NCl-H292和Ea.hy926瞬转质粒表达SARS-CoV-2的膜蛋白后凋亡情况检测

1、检测对象：

NCl-H292和Ea.hy926：分别瞬转空载质粒和表达膜蛋白的质粒。

2、检测方法，具体包括如下步骤：

(1)1×10^5个细胞每孔铺板过夜，隔天利用转染试剂lipo2000，分别将1.5μg质粒(Vector代表空载表达质粒，M-Flag代表表达带Flag标签的SARS-CoV-2膜蛋白)转入细胞，6小时后换液。

(2)48小时胰酶消化，1000rpm离心5分钟，1×PBS洗涤细胞1次。

(3)凋亡染色缓冲液重悬细胞，Annexin-V/PI染色(Annexin-V-FITC，PI-PE，在常温下染色25min，上机检测，凋亡情况以Annexin-V

3、实验结果：

如图1的结果所示，与Vector组相比，瞬转表达膜蛋白的H292和Ea.hy926的Annexin-V和PI细胞比例增高，说明膜蛋白在宿主细胞内的表达会导致细胞凋亡。因此，SARS-CoV-2的膜蛋白瞬转表达会导致H292和Ea.hy926细胞凋亡数明显增加。

实施例2 BOK的敲除和恢复影响SARS-CoV-2膜蛋白诱导细胞凋亡能力

1、检测细胞对象：

BOK敲除的H292细胞系(KO1和KO2)，在BOK敲除细胞系H292基础上采用慢病毒稳转方式恢复BOK表达的细胞系(KO1+BOK+GFP和KO2+BOK+GFP)，KO+Vector+GFP细胞系代表慢病毒空载稳转细胞系。

2、检测方法，具体包括如下步骤：

(1)1×10^5个细胞每孔铺板过夜，隔天利用转染试剂lipo2000，分别将1.5μg相应质粒(Vector代表空载表达质粒，M-Flag代表表达带Flag标签的SARS-CoV-2膜蛋白)转入细胞，6小时后换液。

(2)48小时胰酶消化，1000rpm离心5分钟，采用蛋白裂解液裂解细胞后利用Western blot检测凋亡相关蛋白表达情况，细胞凋亡时剪切体caspase-9、caspase-3和PARP含量增多。

3、实验结果：

如图2的结果所示，与Vector处理组相比，瞬转膜蛋白的WT细胞系的凋亡相关酶活化，BOK敲除后导致膜蛋白无法激活凋亡相关酶Caspase-3、Caspase-9和导致下游PARP的切割，恢复BOK的H292敲除细胞系在瞬转表达膜蛋白后再次出现凋亡相关酶的表达，说明敲除细胞系基础上恢复BOK的表达重新恢复膜蛋白诱导细胞凋亡相关酶的活化，表明SARS-CoV-2膜蛋白诱导细胞凋亡酶的活化需要BOK的参与。

实施例3 SARS-CoV-2膜蛋白表达对小鼠肺组织的影响

1、检测对象：

转导表达SARS-CoV-2膜蛋白慢病毒的小鼠肺组织。

2、检测方法，具体包括如下步骤：

(1)表达SARS-CoV-2膜蛋白慢病毒的制备：将SARS-CoV-2的膜蛋白序列连接到pLVX目的载体，测序验证连接成功，转感受态扩增目的质粒和辅助质粒(pMD2G和psPAX2)。按照目的质粒：pMD2G：psPAX2＝10:7:5，采用PEI转染试剂转染HEK293T细胞包装病毒，8h换液，48h收病毒颗粒上清，超高速离心收集病毒颗粒，PBS重悬制备气管注射内容物；

(2)小鼠随机分八组，气管注射相应内容物：PBS组(50μl PBS)、Lenti-Mock(空载的慢病毒)、Lenti-M(表达膜蛋白的慢病毒)、Lenti-M+Q-VD-OPh(表达膜蛋白的慢病毒，术后尾静脉注射Q-VD-OPh)，PBS+Lenti-M(注射PBS，3天后再注射表达膜蛋白的慢病毒)，ShCtrl.+Lenti-M(注射表达空载干扰shRNA的慢病毒，3天后再注射表达膜蛋白的慢病毒)，ShBOK1+Lenti-M(注射敲低表达BOK干扰shRNA的慢病毒，3天后再注射表达膜蛋白的慢病毒)，ShBOK2+Lenti-M(注射敲低表达BOK干扰shRNA的慢病毒，3天后再注射表达膜蛋白的慢病毒)。

(3)小鼠术后3天后安乐死，肺部4％多聚甲醛固定，进行石蜡切片，或者研磨后进行蛋白提取。

(4)免疫组化染色：石蜡切片组织进行脱蜡、水化和抗原修复后进行HE染色，脱色后进行免疫荧光染色，封片后在免疫荧光显微镜下观察拍照。

(5)Western blot蛋白检测：每组动物肺组织蛋白进行蛋白电泳，转到PVDF膜后采用相应抗体孵育检测相应蛋白表达变化情况。

3、实验结果：

如图3A和图3B的结果所示，表达SARS-CoV-2膜蛋白细胞出现凋亡执行酶(cleavedcaspase 3，C-C3)和脱落，与PBS或空载慢病毒处理组相比，表达膜蛋白慢病毒会导致小鼠肺组织BOK蛋白水平含量增加，细胞凋亡脱落，凋亡相关酶抑制剂Q-VD-OPh能抑制SARS-CoV-2膜蛋白诱导肺组织凋亡酶的活化，图3C结果显示，采用敲减小鼠肺部组织降低肺部内BOK表达水平能减轻SARS-CoV-2膜蛋白诱导肺组织凋亡酶的活化，说明抑制BOK能抑制SARS-CoV-2膜蛋白的诱导作用。

实施例4 SARS-CoV-2感染对新冠肺炎患者肺部的病理损伤

1、检测对象：

新冠肺炎患者肺部组织

2、检测方法，具体包括如下步骤：

(1)新冠肺炎病死患者肺部经10％多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片

(2)免疫组化染色：石蜡切片组织进行脱蜡、水化后进行HE染色，再进行脱水和透明，封片后在普通光学显微镜下观察拍照。

3、实验结果：

如图4A的结果所示，新冠肺炎患者支气管表皮细胞内存在病毒包涵体，说明该患者肺部死亡时肺部仍存在病毒活动。

如图4B的结果所示，新冠肺炎患者肺泡上皮细胞存在大量细胞死亡和脱屑，说明SARS-CoV-2感染导致肺组织破坏。

如图4C和4D的结果所示，新冠肺炎患者肺支气管内堵塞着脱落细胞和肺泡内堵塞着嗜酸性粘液。

实施例5 SARS-CoV-2感染新冠肺炎患者肺部组织BOK和凋亡活化酶Caspase-3表达的关系

1、检测对象：

新冠肺炎患者肺部组织

2、检测方法，具体包括如下步骤：

(1)新冠肺炎病死患者肺部经10％多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片。

(2)石蜡切片组织进行脱蜡、水化和抗原修复后进行HE染色，脱色后进行免疫荧光染色，封片后在免疫荧光显微镜下观察拍照。

3、实验结果：

如图5结果所示，相比未感染SARS-CoV-2人(Healthy control)的正常肺组织，新冠肺炎患者肺组织内表达较多的BOK强阳性细胞和活化caspase-3，且BOK和活化caspase-3共表达，说明该患者肺部细胞死亡酶caspase-3激活和BOK的高表达有关。

由以上结果可以看出，BOK蛋白与COVID-19患者肺细胞凋亡增强有关，细胞进行敲除和恢复实验及动物水平实验证实BOK的抑制能废除SARS-CoV-2膜蛋白诱导细胞凋亡的能力。

本发明对新冠肺炎患者病理切片中的进行免疫组化染色检测到BOK的高表达，且与凋亡酶活化有关，其次，观察到SARS-CoV-2的膜蛋白依赖宿主细胞BOK介导细胞凋亡，导致小鼠肺泡细胞脱落等原因造成肺损伤，说明干预BOK有望应用于新冠肺炎的综合治疗中，制备成治疗新冠肺炎药物的形式，以减轻新冠肺炎肺部病理性改变造成生理功能受损。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。