一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体

摘要

本发明公开了一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明还公开了一种上述所述的耐热小鼠RNase inhibitor突变体在PCR反应中的应用。采用本发明的耐热小鼠RNase inhibitor突变体能够耐受70℃高温反应30min；同时，能够在高温下保护RNA免受RNase降解。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体。

背景技术

在RNA提取、反转录PCR、RNA变性过程中，由于环境中无处不在的RNase(核糖核酸酶)会导致RNA降解，因此需要全过程抑制RNase的活性。小鼠RNase inhibitor(RNases抑制剂)能够与RNase以非共价键结合形成复合体，造成RNase失活。与人源RNase inhibitor相比，小鼠RNase inhibitor不含人源蛋白中的两个对氧化非常敏感的半胱氨酸，因而具有更高的抗氧化活性。然而，由于单链性质的RNA链常常会形成发卡结构，阻止反转录PCR反应而导致实验失败，因此需要更高的反应温度以打开发卡结构。野生型小鼠RNase inhibitor不具有耐热性，在70℃下反应容易失活，因此需要耐热性的RNase inhibitor。

发明内容

本研究针对野生型小鼠RNase inhibitor，运用结构生物学技术和定点突变技术，设计并制备出一种小鼠RNase inhibitor突变体。经实验发现，该突变体相比野生型耐热性显著提高，能够耐受70℃30分钟，为RNA高温反应提供了良好的条件。因此，本发明的第一个目的在于提供一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体。本发明的第二个目的在于提供一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

作为本发明的第二个方面，一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体在PCR反应中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明的小鼠RNase inhibitor突变体能够耐受70℃高温反应30min；

2、本发明的小鼠RNase inhibitor突变体能够在高温下保护RNA免受RNase降解。

附图说明

图1为野生型(WT)、突变体1(MT1)、突变体2(MT2)的序列比对结果图。

图2为野生型(WT)、突变体1(MT1)、突变体2(MT2)的活性测试结果图。

图3为野生型(WT)的RT-qPCR的扩增图谱。

图4为突变体2(MT2)的RT-qPCR的扩增图谱。

图5为野生型(WT)、突变体1(MT1)、突变体2(MT2)分别经70℃热处理10min后RT-qPCR的扩增图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)野生型小鼠RNase inhibitor，其氨基酸序列下载，登录NCBI，输入Q91V17.1，下载序列获得；

(2)根据野生型序列，进行蛋白质结构分析，确定能够增加氢键的氨基酸残基；

(3)根据确定的氨基酸残基位点，进行定点突变；

(4)把野生型RNase inhibitor基因和突变体基因进行原核表达纯化得到野生型小鼠RNase inhibitor(氨基酸序列如SEQ ID N0：1所示)和突变体RNase inhibitor(氨基酸序列如SEQ ID N0：2和SEQ ID N0：3所示)。

其中，纯化后的野生型小鼠RNase inhibitor的氨基酸序列(WT)如下：

突变体RNase inhibitor的氨基酸序列(MTl)如下：

突变体RNase inhibitor的氨基酸序列(MT2)如下：

实施例2序列比对

序列比对结果如图1所示。

实施例3活性测试

RNaseA能够水解胞苷2′，3′-环一磷酸钠盐(cCMP)，使其OD285增加。RNaseinhibitor能够专一性结合RNaseA，抑制RNaseA水解胞苷2′，3′-环一磷酸钠盐(cCMP)，从而使0D285不增加。由此可以测得RNase inhibitor的活性，1U RNase inhibitor可以抑制5ngRNaseA 50％的活性。以未进行70℃处理的RNase inhibitor为对照，其活性定义为100％，分别测试野生型(WT)、突变体1(MT1)、突变体2(MT2)经70℃处理15min、30min、60min的活性，得到图2。

具体活性测试步骤如下：

1)以灭菌去离子水作为空白，波长选择296nm，取500μL cCMP溶液(0.02mg/mL)，加入50μL 100ng/μL RNaseA混匀，加入到1cm微量石英比色杯中，选择反应动力学，10s采集1次，采集40次。

2)取500μL cCMP溶液，加入混好的50μL 100ng/μL RNaseA+25μL 40U NEB RNI，混匀，按照上面进行测量。

3)取500μL cCMP溶液，加入混好的50μL 100ng/μL RNaseA+x μL待测的RNI，混匀按照上面进行测量。

4)根据加入待测的RNI的量，计算待测的RNI活性

结果显示，野生型(WT)在70℃60min，其几乎不含残留活性；突变体1(MT1)在70℃60min，其残留活性为20％；突变体2(MT2)在70℃60min，其残留活性为40％。

实施例4耐热性测试

将野生型RNase inhibitor和突变型RNase inhibitor(MT1)和(MT2)，分别稀释到40U/μL，分别取100μL，置于70℃水浴锅内，水浴15min、30min、60min；将70℃处理后的RNaseinhibitor，80U RNase inhibitor与10ng RNaseA混合，加入到RT-qPCR反应体系内，进行RT-qPCR，以未进行70℃处理的RNase inhibitor与10ng RNaseA混合物作对照。

PCR反应体系如表1所示。RT-qPCR反应扩增测序按表3所示。结果如图3和图4所示。

表1 RT-qPCR的反应体系

其中，2×qPCR Mix、引物1、引物2、TaqMan Probe、Human 293T RNA、RNase A、MMLV等来源见表2。

表2耐热性测试试剂来源

表3 RT-qPCR的扩增程序

结果显示，突变型相比野生型，能够耐受70℃30min。

综上所述，本发明的突变型RNase inhibitor(MT2)，能够耐受70℃30min。因此，本发明的突变型RNase inhibitor(MT2)能够在高温下保护RNA免受RNase降解。可以应用于RNA提取、反转录PCR、RNA变性等过程中。

实施例5实例应用

检测基因表达量的一个重要手段是检测RNA的表达量，这需要将RNA逆转录成cDNA后进行定量检测。RNA的制备过程难以去除内源的RNase活性，需要RNase inhibitor保护逆转录前的RNA。然而，逆转录过程需要高温解除RNA的高级结构，这就迫切需要耐高温的RNase inhibitor。

本实例中使用70℃10分钟处理来去除RNA的高级结构。在微量RNase存在的情况下，RNase inhibitor(MT2)能够有效保护RNA模板。具体如下：

1)，逆转录体系如表4所示。

表4逆转录体系

2)，荧光定量PCR体系和反应程序如表5和表6所示。

表5荧光定量PCR体系

表6荧光定量PCR反应程序

实验结果见图5所示。

结果显示，1号实验6个复孔中有3个没有起峰，起峰的3个复孔CT值平均为43.79。2号实验添加RNase inhibitor MT2 20U，6个复孔都起峰，CT值平均为37.63，模板量是1号实验的约71倍。说明RNase inhibitor MT2在70℃可以显著抑制RNase的活性。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 翌圣生物科技（上海）有限公司

<120> 一种耐热小鼠RNase inhibitor突变体

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