一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对和PCR方法及应用

摘要

本发明公开了一种筛选高产3‑甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对和PCR方法及应用。本发明的筛选高产3‑甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。本发明的筛选高产3‑甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR方法包括：以待测菌株的DNA为模板，以设计的PCR引物对为PCR引物，进行PCR扩增，将扩增的PCR产物进行凝胶电泳，根据凝胶电泳所得的条带大小筛选高产菌株，条带≥2196bp为高产菌株。本发明的筛选高产3‑甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR方法能够实现对高产3‑甲基丁醛的菌株进行高通量和精确快速的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对和PCR方法及应用，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

切达奶酪是一种用凝乳酶将牛奶中的乳蛋白质凝固后，然后酸化、浓缩，最后压制后发酵成熟的硬制奶酪。坚果风味是陈年切达奶酪的主要香气特征，也深受消费者喜爱。3-甲基丁醛因其阈值较低(在水溶液中0.06μg/mL)，并可以与其他风味物质发生协同作用，能够很大程度上提高奶酪的坚果风味，是产生陈年切达奶酪坚果风味的关键化合物之一。这种支链醛在通常切达奶酪的成熟过程9个月后，才能够由奶酪中的微生物菌群代谢支链氨基酸大量生成，即成熟时间较长的切达奶酪才能够具有浓郁的坚果风味。

研究表明，通过在切达奶酪的生产过程中添加高产3-甲基丁醛的菌种作为辅助发酵剂，能显著缩短奶酪成熟时间，提升3-甲基丁醛含量，进而加强奶酪坚果风味，缩短工业生产成本。经过证实，与其他用于发酵生产奶酪的菌株相比，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)因其较高的α-酮酸脱羧酶活性，能够在切达奶酪的成熟过程中高效地合成3-甲基丁醛。因此，结合国内乳制品市场的良好前景和人们对健康天然发酵食品的需求，筛选优良乳酸菌菌种提升发酵食品风味日渐成为研究热点，具有良好的前景。

由于当前对于微生物产3-甲基丁醛等一些风味物质能力的检测通常需要通过气相色谱法或气相色谱-质谱联用进行定性并结合外标或内标法进行定量来判断。该方法操作复杂，需要针对不同样品选合适的前处理方法和气相色谱的柱箱升温程序，并且每一次检测的时间较长，一次只能检测一个样品，效率低下，不适用于菌种的高通量筛选。此外，气相色谱仪及质谱仪较为昂贵，维护复杂，数据结果重现性较低。因此，开发一种简单、高效、经济的快速判断乳酸乳球菌产生3-甲基丁醛能力的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何简单快捷、高效准确地筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌。

为了解决上述问题，本发明提供了一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对，包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。

本发明还提供了一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR方法，包括以下步骤：

步骤1：待测菌株活化培养后，提取待测菌株的DNA；

步骤2：以步骤1提取的待测菌株的DNA为模板、上述筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对为PCR引物进行PCR扩增反应，得到PCR产物；

步骤3：将步骤2所得的PCR产物进行凝胶电泳，EB染色，紫外拍照得到PCR产物的凝胶电泳图；

步骤4：根据凝胶电泳图中PCR产物的条带大小筛选高产3-甲基丁醛的菌株。

优选地，所述步骤2中的PCR扩增反应的底物包括：10×PCR Buffer 2.5μL，25mmol/L Mg

优选地，所述步骤2中的PCR扩增反应的程序为：95℃预变性，10min；30-35个循环，94℃变性30s，55℃-65℃退火30s；72℃延伸130-150s；72℃延伸5min。

优选地，所述步骤3中的凝胶电泳的具体条件为：琼脂糖凝胶1％，电泳电压5V，跑胶时间30min。

优选地，所述步骤4中的筛选高产3-甲基丁醛的菌株的标准为：PCR产物的条带≥2196bp。

更优选地，所述的高产3-甲基丁醛的标准为：3-甲基丁醛的产量≥140μM/L。

本发明还提供了所述的筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对的应用。

优选地，所述应用包括在制备筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的试剂和/或试剂盒中的应用。

本发明的PCR引物对的设计原理为：α-酮酸脱羧酶(KADC)是微生物合成代谢3-甲基丁醛直接途径的关键基因，研究发现该基因序列在不同乳酸乳球菌中存在多样性，在高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌中，该基因具有长段的完整序列，并拥有三个结构域。而在一些低产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌中，该基因往往缺失或者收到某些插入基因的干扰，使得序列末端被破坏，丧失部分活性位点，从而导致该基因未能发挥其原有功能。研究表明，只有具有完整三个结构域的α-酮酸脱羧酶才能够发挥正常生物学功能，该基因的完整性与基因完整度显著性相关。高产3-甲基丁醛菌株编码的完整α-酮酸脱羧酶结构域蛋白的基因核苷酸序列较佳的是GeneBank Accession No.AY548760.1，该基因完整序列长度为1647个核苷酸，如SEQ ID NO：1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明的PCR引物对根据高产3-甲基丁醛乳酸乳球菌菌株的完整α-酮酸脱羧酶基因片段进行设计，该片段可以在乳酸乳球菌菌株中扩增出相应的DNA片段，通过基因型决定表型的原则，能够只特异性的扩增α-酮酸脱羧酶基因，从而使对应的PCR方法具有良好的特异性；

2.本发明的PCR方法检测速度快、灵敏度高、成本低以及操作方便，能够在较短时间内对高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌进行高通量、精确的筛选。

附图说明

图1为实施例2的待测菌株的凝胶电泳图，其中，M为分子量标准品DL10000DNAMarker；

图2为实施例2中的待测菌株的GC-MS外标定量的检测结果图；

图3为实施例3的待测菌株的凝胶电泳图，其中，M为分子量标准品DL10000DNAMarker；

图4为实施例3中的待测菌株的GC-MS外标定量的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

以下实施例中，实施例2和实施例3采用的GC-MS结合外标定量的方法具体操作为：使用浓度为6.25、12.5、25、50、100和500μM/L的3-甲基丁醛标准溶液建立标准曲线，将活化后的待测菌株使用氨基酸培养基在30℃下培养24h，氨基酸培养基的配方为：10mMα-酮戊二酸，0.2mM NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，0.1mM 5-磷酸吡哆醛10mM 18种氨基酸(丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，甘氨酸，酪氨酸，蛋氨酸)。然后通过固相顶空微萃取(SPEM)，使用DVB/CAR/PDMS三合一萃取头进行萃取。将固相微萃取纤维在250℃下引入分流注射器中，通过GC-MS测定待测菌株中3-甲基丁醛的含量，将测得的数据采用标准曲线进行校正，获得待测菌株中3-甲基丁醛的含量。

上述方法中，GC-MS的具体条件为：

色谱柱采用HP-Innowax(60m×0.25mm×0.25μm)；检测器为氢火焰离子检测器，载气为氦气。GC注射参数如下：注射体积1μL；分流比10:1；氦气流速1.2mL/min；柱温40℃，保留3分钟，以3℃/min升温至70℃，保温2分钟，然后以10℃/min升至240℃，保温10分钟。用于分析的MS参数如下：传输线的温度(直接界面)250℃；电子轰击模式；电子能量70eV；离子阱温度230℃；四级杆温度150℃；全扫描模式(35-450m/z)。

实施例1

一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对的设计：

根据NCBI已报道的如表1所示的检测出KADC基因的10株乳酸乳球菌的全基因组序列，运用blast程序找出了拥有KADC基因的菌株的上下游基因所共有的保守区间，其中上游基因编码的是ROK family protein，下游基因编码的是MarR family transcriptionalregulator。选取尽可能靠近KADC基因的保守区间进行引物设计，进而获得片段长度不同的完整KADC基因序列。在引物对的设计中，正向引物设计的位点处于乳酸乳球菌中α-酮酸脱羧酶基因上游基因ROK家族蛋白序列末端保守区域上，较佳的引物设计源于保守区域如SEQID NO:4第519位至770位所示的基因片段，引物设计的长度为15-40bp；另一条引物设计的位点处于乳酸乳球菌中α-酮酸脱羧酶基因下游基因MarR家族转录调节因子序列前端保守区域上，较佳的引物设计源于保守区域如SEQ ID NO:5第25-169位所示的基因片段，引物设计的长度为15-40bp；因此，根据如SEQ ID NO:4所示的上游基因片段和如SEQ ID NO:5所示的下游基因片段，设计出最佳引物对：序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物和序列如SEQ IDNO:3所示的下游引物，其中，上游引物和下游引物的长度均为25bp。

表1检测出KADC基因的10株乳酸乳球菌

实施例2

一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR方法，包括如下步骤：

(1)待测菌株的活化：将如表2所示的10株乳酸乳球菌菌株(编号为1-10)进行活化，选用M17培养基，在30℃下活化培养16小时，然后置于4℃冰箱保存，备用。

(2)采用CTAB法提取活化后的待测菌株中的DNA，具体步骤如下：

步骤a：取1.5ml菌株培养液离心2min,用567μL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH 8.0)重悬；

步骤b：加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，于37℃恒温孵育1h；

步骤c：加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀；

步骤d：加入80μL CTAB/NaCI(100mmol/L Tris-HC1；100mmol/L EDTA；100mmol/LNa

步骤d：加入等体积24：1的氯仿/异戊醇，充分混匀，离心4～5min。将上清转移到新管中；

步骤e：加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)充分抽提，离心4～5min，将上清转移到新管中；

步骤f：加入0.6体积异丙醇，轻轻混匀直到白色纤维状DNA沉淀形成，将沉淀转移至含70wt％乙醇的新管中。离心5min，沉淀用冻干机干燥，重溶于100μL的TE缓冲液中，-20℃下保存备用。

(3)以步骤2中提取的菌株DNA为模板，实施例1设计的引物对为PCR引物，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的底物包括：10×PCRbuffer 2.5uL，25mmol/L Mg

(4)琼脂糖凝胶电泳及高产菌株的筛选：将上述PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶中以55V/cm的电压跑胶30min，EB染色，紫外拍照，得到待测菌株的凝胶电泳图，如图1所示，10株待测菌株中一共有4株菌株产生了条带，其中条带最大的菌株为1号菌株408，其PCR产物的条带大小为2000bp以上，具体为2196bp，属于高产菌株，报告为阳性菌株；其次为2号菌株IMJ10-7和3号菌株YND-1，其PCR产物的条带大小在1800～2000bp，均为1961bp，不属于高产菌株，报告为阴性菌株。条带最小的菌株为4号菌株WZ1-2，PCR产物的条带大小为1500～1700bp，具体为1653bp，不属于高产菌株，报告为阴性菌株。其余剩下的菌株在电泳图中未观察到PCR产物，均不属于高产菌株，报告为阴性菌株。

(5)结果验证：为了验证本发明的PCR方法的可靠性，采用GC-MS结合外标定量的方法测定待测菌株中3-甲基丁醛的含量，GC-MS检测结果如图2所示，由图2可知，菌株408为高产菌株，3-甲基丁醛的产量为140.23μM/L，其余菌株中3-甲基丁醛的含量均远远小于1号菌株Lactococcus lactis 408。本实施例的PCR方法筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的结果与GC-MS结果相吻合，并能在较短的时间内实现对高产3-甲基丁醛的菌株进行高通量、精确的筛选。

实施例3

一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR方法，包括如下步骤：

(1)待测菌株的活化：另选一组待测乳酸乳球菌菌株(编号为1-10，菌株名称如表2所示)进行活化，选用M17培养基，在30℃下活化培养16个小时，然后置于4℃冰箱保存，备用。

(2)同实施例2中的步骤(2)。

(3)同实施例2中的步骤(3)。

(4)琼脂糖凝胶电泳及高产菌株的筛选：将步骤(3)得到的PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶中以55V/cm的电压跑胶30min，EB染色，紫外拍照，得到待测菌株的凝胶电泳图，如图3所示，10株待测菌株中一共有3株菌株产生了条带，其中条带最大的菌株为5号菌株YN19-1-1，其PCR产物的条带大小为2000bp以上，具体为2196bp，属于高产菌株，报告为阳性菌株；其次为6号菌株YN2-1，其PCR产物的条带大小在1800～2000bp，为1961bp，不属于高产菌株，报告为阴性菌株。条带最小的菌株为3号菌株YND-4，PCR产物的条带大小为1500～1700bp，具体为1653bp，不属于高产菌株，报告为阴性菌株。其余剩下的菌株在电泳图中未观察到明显的PCR产物，均不属于高产菌株，报告为阴性菌株。

(5)结果验证：为了验证本发明的PCR方法的可靠性，采用GC-MS结合外标定量的方法测定待测菌株中3-甲基丁醛的含量，GC-MS检测结果如图4所示，由图4可知，菌株YN19-1-1为高产菌株，3-甲基丁醛的产量为170.25μM/L，其余菌株中3-甲基丁醛的含量均远远小于5号菌株YN19-1-1。本实施例的PCR方法筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的结果与GC-MS结果相吻合，并能在较短的时间内实现对高产3-甲基丁醛的菌株进行高通量、精确的筛选。

表2实施例1和实施例2中的待测乳酸乳球菌菌株

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种筛选高产3-甲基丁醛的乳酸乳球菌的PCR引物对和PCR方法及应用

<130> 2021

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1647

<212> DNA

<213> Lactococcus lactis

<400> 1

atgtatacag taggagatta cctattagac cgattacacg agttaggaat tgaagaaatt 60

tttggagtcc ctggagacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc ccgcaaggat 120

atgaaatggg tcggaaatgc taatgaatta aatgcttcat atatggctga tggctatgct 180

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aatggattag caggaagtta cgccgaaaat ttaccagtag tagaaatagt gggatcacct 300

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<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

aatttccatt gagtcaaaac gagat 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

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<210> 4

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

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agaaactaa 969

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<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

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