使用丝状真菌生产纤维素酶的方法

摘要

本发明涉及通过属于丝状真菌的菌株生产酶的方法，其包括三个步骤：(a)在分批阶段，在搅拌和通气式生物反应器(1)中，在至少一种碳基生长底物的存在下生长生物质的第一步骤，(b)稀释在第一步骤(a)中获得的培养基的第二步骤，(c)在分批补料阶段，在至少一种诱导性碳基底物的存在下，由第二步骤(b)中获得的稀释的培养基生产酶的第三步骤。

说明书

技术领域

本发明涉及通过丝状真菌生产酶的方法，特别是纤维素酶(纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶)类型的酶，其是木质纤维素生物质的酶促水解所需的。

这种酶促水解例如用于“第二代”(2G)工艺中，用于生产生物燃料如生物乙醇，或用于生产糖汁，其可用于通过化学或生物化学/发酵途径生产其它产品(例如，醇如乙醇、丁醇、丙醇、异丙醇、或其它分子，例如，溶剂如丙酮，和其它生物基分子)，或用于化学、造纸或纺织工业中的其它工艺中。

现有技术

里氏木霉(Trichoderma reesei)是最广泛用于以工业规模生产纤维素酶的微生物。野生型菌株具有在诱导性底物(substrat inducteur)例如纤维素存在下分泌酶复合物的能力，认为所述酶复合物非常适合于木质纤维素生物质的水解。酶复合物中的酶根据其活性包含三种主要类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。里氏木霉也产生具有对于木质纤维素材料的水解至关重要的性质的其它蛋白质，例如木聚糖酶。

诱导性底物的存在对于纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的表达是必需的。碳基底物的属性对酶复合物的组成具有强烈的影响。木糖就是这种情况，当与碳基诱导性底物如纤维素或乳糖组合时，其显著改善所谓的木聚糖酶活性。已经详细研究了纤维素酶基因在多种碳源上的调控。它们在纤维素、其水解产物(例如：纤维二糖)或某些寡糖如乳糖或槐糖存在下受到诱导(IImén et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306)。

常规的基因突变技术已经使得能够选择高产纤维素酶的里氏木霉菌株，例如以下菌株：MCG77 (Gallo - 专利US 4,275,167)、MCG 80 (Allen, A.L.和Andreotti, R.E.,Biotechnol.-Bioeng. 1982, 12, 451-459 1982)、RUT C30 (Montenecourt, B.S.和Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782)和CL847 (Durand等, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels[Genetics of industrial microorganisms]". Paris. H. Heslot Ed, 第39-50页)。

通过里氏木霉生产纤维素酶的方法已经成为用于外推到工业规模的大量开发研究的主题。为了获得高的酶生产率，必须提供用于里氏木霉生长的可快速同化碳源，以及允许纤维素酶的表达和分泌到培养基中的诱导性底物。纤维素能够实现这两种功能。然而，纤维素难以在工业规模上使用，因为它增加培养基的粘度并且可能破坏氧转移，氧转移对于严格需氧的微生物的生长是至关重要的。它可以被可溶性碳源例如葡萄糖、木糖或乳糖替代，乳糖也充当诱导性底物。其它可溶性糖如纤维二糖和槐糖已被描述为诱导性的，但它们可能被认为太昂贵而难以用于工业阶段。

已经发现，采用可溶性底物由里氏木霉生产纤维素酶的产量远低于“分批”纤维素上获得的纤维素酶的产量。这是由于高浓度下的易于同化的糖的抑制作用。可溶性碳基底物以分批补料(fed-batch)模式连续供料，使得可以通过限制培养物中的残留浓度和通过优化糖的量来消除分解代谢物阻遏，使得可以获得更好的产量和更好的酶生产率，如专利FR-B-2 555 603中所述。该方案导致实现蛋白质浓度为大约35至40 g/L，生产率为大约0.2g/L/h。

为了实现这样的性能，如前述专利中所述的生产纤维素酶的工业方法因此在同一反应器中以两步进行：

-“分批”模式下的生长步骤，其中必须为里氏木霉的生长提供可快速同化碳源。该阶段的特征在于培养基粘度增加以及高的需氧量。

-“分批补料”模式下的生产步骤，使用允许纤维素酶的表达和允许分泌到培养基中的诱导性底物(例如乳糖)。所施加的最佳流量为35至45 mg(糖).g(细胞干重)

蛋白质生产率等于活生物质的浓度与蛋白质生产的比速率的乘积。这样的生产率可以通过提高菌株的生产性能(提高比速率)和/或通过提高细胞生物质的浓度来增加。然而，通过对这些菌株进行如上文先前所述的基因修饰来改善其性能的方法可能达到极限，并且提高生物质的浓度导致粘度的急剧增加，由此限制了氧转移，特别是在生长步骤结束时。

现有技术中提出的生产步骤在搅拌罐中进行，其中生长步骤和生产步骤在同一生物反应器中进行。这是一种令人感兴趣的解决方案，它在工业设备方面很紧凑，但它不一定是最佳的解决方案，因为生长和生产的两个步骤在例如搅拌装置或氧转移方面不具有相同的要求：因此，生物反应器必须具有允许其确保这两个步骤在一起的容积和所有设备和操作装置，尽管所述步骤在相当不同的条件下进行。

因此，本发明的目的是提出由丝状真菌菌株生产纤维素酶的改进方法，特别是能够提高酶生产率的方法，其次，该方法可以在能够实现更大灵活性的设备中以工业规模实施。

发明内容

本发明涉及通过属于丝状真菌的菌株生产酶的方法，所述方法包括以下三个步骤：

(a)在分批阶段，在搅拌和通气式生物反应器中，在至少一种碳基生长底物的存在下生长真菌的第一步骤，

(b)稀释(在体积方面)第一步骤(a)中获得的培养基的第二步骤，

(c)在分批补料阶段，在至少一种诱导性碳基底物的存在下，由第二步骤(b)中获得的稀释的培养基生产酶的第三步骤。

本发明包括这种方法，其中步骤(b)可以在步骤(a)结束之前(一点)开始，或者可以在步骤(c)开始之后(一点)结束。因此，本发明包括具有以下实施方式的这种方法，其中，一方面步骤(a)和(b)以及另一方面步骤(b)和(c)可以彼此部分地重叠。如下文之后详述的原因是稀释步骤(b)可持续若干小时，因此在步骤(a)结束之前的0至4小时之间开始稀释步骤(b)和/或在转变至步骤(c)之后的0至4小时之间结束稀释步骤(b)可能是有利的。

因此，本发明开发了一种新的发酵方案，其在生长步骤和生产步骤之间具有中间稀释步骤。完全令人惊讶地，已经发现对于相同的碳基底物的比流量(相对于反应器中生物质的质量计算)，在生长阶段结束时稀释培养基之后获得的比生产率显著高于用未经稀释的培养基获得的比生产率(增量可以高达30%或更多)。

第三生产步骤(c)优选在鼓泡塔中进行：在该优选实施方案中，本发明还明智地利用了生长步骤和生产步骤不具有相同的要求和不具有相同的程序，特别是在搅拌和氧转移方面，并且因此在两个不同的发酵罐中进行这些步骤更有意义的想法：生物质的生产可以在搅拌罐中在良好的条件下进行，目的优选是高浓度的生物质(例如大于或等于20 g/L的生物质)。生产在鼓泡塔中进行，这是特别适合进行生产的反应器，因为反应器适合于低粘度的稀介质，并且还具有许多优点，例如非常容易清洁，具有比搅拌式生物反应器更高的能量效率，并且允许提供高的反应体积。(在本文中，“搅拌式生物反应器”具有与“搅拌罐”相同的含义)。

第二稀释步骤(b)有利地在真菌生长步骤(a)结束时在生物反应器中和/或在生产酶的第三步骤(c)之前或开始时在鼓泡塔中进行。

因此导致培养基粘度下降的稀释步骤可以由此在任一反应器中进行，或者甚至在第一反应器的内容物转移到第二反应器的过程中在线进行。优选在搅拌罐中进行稀释，以便使已经稀释的培养基更容易从搅拌罐转移到鼓泡塔中。

在稀释步骤(b)中，稀释培养基的因子有利地为至少1.1或1.2，特别是至少1.5，优选大约2，特别是至多6。稀释要进行调节，以使培养基具有允许限制培养基粘度的生物质浓度——即，5至20 g/L的浓度。在本发明中，术语生物质对应于真菌。

稀释因子是体积稀释因子，并且对应于稀释后和稀释前的体积比。由于培养基是水性介质，因此稀释液优选是水或水性介质，例如也是培养基。

根据一个优选的实施方案，提供了用于生物反应器和鼓泡塔之间的流体连接的装置，以确保将在生长步骤中在生物反应器中获得的培养基转移到鼓泡塔，所述装置特别地采取装配有手动阀或控制阀并且特别地装配有(一个或多个)泵的管的形式。

在这种情况下，可以在通过流体连接装置将培养基从生物反应器转移到鼓泡塔的过程中在这些流体连接装置中完全或部分地进行第二稀释步骤(b)。

生物反应器中碳基生长底物的浓度优选大于20 g/L，特别是30至100 g/L，和优选50至80 g/L。

诱导性碳基底物优选以30至140 mg/g细胞生物质/小时，优选35至45 mg/g细胞生物质/小时的比速率供料给鼓泡塔。

生长生物质的步骤有利地持续到生物质(真菌)浓度为至少20 g/L。因此，产物是浓缩的培养基，其随后在生产开始之前被稀释。

根据一个实施方案，可以用n个数量的搅拌和通气式生物反应器和m个数量的鼓泡塔实施本发明的方法，其中n小于或等于m，一个鼓泡塔可以与两个或更多个生物反应器流体连接，反之亦然。可以使鼓泡塔具有比搅拌式生物反应器大得多的容量，从而使得两个或更多个搅拌式生物反应器能够例如供料给单个鼓泡塔，并且可以考虑到生长步骤比生产步骤更快的事实。

碳基生长底物优选选自以下化合物中的至少一种：乳糖、葡萄糖、木糖、在来自纤维素生物质的酶促水解产物的单糖的乙醇发酵之后获得的残余物、以及来自纤维素生物质的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。

诱导性碳基底物优选选自以下化合物中的至少一种：乳糖、纤维二糖、槐糖、在来自纤维素生物质的酶促水解产物的单糖的乙醇发酵之后获得的残余物、以及来自纤维素生物质的预处理的水溶性戊糖的粗提取物。

前述诱导性底物和生长底物可以单独使用或作为混合物使用。

根据其属性，将为了获得生物质而选择的碳基生长底物在灭菌之前引入生物反应器中，或者单独灭菌并在灭菌之后引入生物反应器中。

在分批补料生产步骤过程中引入的诱导性碳基底物优选在被引入鼓泡塔中之前独立灭菌。如果诱导性碳基底物是经预处理的生物质或半纤维素水解产物，则可以在不灭菌的情况下使用它。

优选地，当诱导性碳源是乳糖时，水溶液以200-250 g.L

所用菌株优选属于里氏木霉物种，任选地通过突变选择方法修饰以增强纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶；也可以使用通过基因重组(recombinaison génétique)技术增强的菌株。这些菌株在与它们的生长和酶的生产相容的条件下培养。也可以采用通过与对于木霉属所用的那些相似的过程生产酶的其它微生物菌株。

酶优选是纤维素分解酶或半纤维素分解酶。

因此，所用的丝状真菌菌株优选是里氏木霉的菌株或通过突变、选择或基因重组修饰的里氏木霉的菌株。非常优选地，菌株是CL847、RutC30、MCG77或MCG80菌株。

本发明的另一个主题是通过属于丝状真菌的菌株生产酶的设备，使得所述设备包括：-搅拌和通气式生物反应器，其在分批阶段操作，用于进行在至少一种碳基生长底物的存在下生长真菌的步骤；-鼓泡塔，其在分批补料阶段操作，用于进行由来自所述生物反应器的所述培养基生产酶的步骤；-将所述生物反应器连接至所述鼓泡塔的流体连接装置，用于进行生长培养基从所述生物反应器至所述鼓泡塔的转移；-用于将稀释液注入所述生物反应器和/或所述鼓泡塔和/或所述流体连接装置的装置。生物反应器和/或鼓泡塔优选含有具有属于丝状真菌的菌株的培养基。

该设备可以有利地实施上述方法，具有由此产生的相同优点：比在单个搅拌罐中不具有中间稀释情况下的发酵更好的比生产率，更容易操作和维护设备，适应于可变量的生产等。

鼓泡塔的内体积有利地是搅拌式生物反应器的内体积的至少两倍，从而允许鼓泡塔“吸收”增加体积的稀释的培养基和/或允许其由两个或更多个搅拌式生物反应器来供料。

因此，上述设备可以包括n个搅拌和通气式生物反应器和m个鼓泡塔，其中n小于或等于m (并且其中n大于或等于1)。

附图说明

图1是实施本发明方法的设备的高度示意性图示。

图2a、2b和2c是显示根据三个不同实施例的所产生的蛋白质的质量和细胞生物质的质量的浓度变化的图。

具体实施方式

在一个优选的实施方案中，本发明涉及在搅拌和通气式生物反应器中通过属于里氏木霉物种的菌株生产纤维素酶的方法，其包括三个步骤：

-在分批阶段，在至少一种碳基生长底物的存在下进行生长的第一步骤，其中碳基生长底物的浓度为30至100 g/L，优选50至80 g/L。该步骤在搅拌罐中进行。

-必须以大于1.1且优选2的因子稀释发酵物的第二步骤。该稀释步骤可以在生长罐中进行。另一种解决方案包括在将搅拌罐的内容物转移到鼓泡塔的过程中进行在线稀释。

-在分批补料阶段，在鼓泡塔中，在至少一种诱导性碳基底物的存在下进行生产的第三步骤，该底物以35至140 mg/g细胞/小时，和优选35至45 mg/g细胞/小时的比速率供料。

生产步骤在限制诱导性碳基底物的条件下进行，其流量小于菌株的最大消耗容量。

各种碳基诱导性底物和生长底物已经在上文先前列出。优选地，当诱导性碳源是乳糖时，水溶液以200-250 g.L

根据本发明的方法通过更好地利用搅拌式生物反应器而使得能够实现优异的纤维素酶生产率：搅拌式生物反应器专用于生物质的生长，它们可以更有效地布置和适应于仅这一步骤。随后将生物质转移到鼓泡塔中，鼓泡塔是大容积发酵罐并且其本身将专用于酶的生产。该方法以其整体在公用设施(能耗等)方面更经济并且更灵活。

因此，该方案已相对于常规方法进行了调整，首先通过在生长结束时稀释真菌浓度，其次通过在鼓泡塔中进行生产。

图1中示出了根据本发明的方法的示例性实施方案，其表示实施该方法的设备的一个示例。

附图标记具有以下含义：

1：搅拌罐

2：搅拌罐的供料

3：发动机

4：搅拌装置

5：鼓泡装置

6：空气供料

7：鼓泡塔

8：底物的供料

9：鼓泡塔的供料

10：排放点

11：鼓泡装置

12：空气供料

13：转移管线

14：注入点

15：泵

因此，该设备首先包括搅拌罐1，在其中将进行生长步骤。该罐1具有20至500 m

搅拌罐1包括一至五个旋转搅拌器4，其搅拌功率为0.1至7 kW/m

罐1在1至5巴绝对压力下操作。空气(5、6)以每小时每体积液体0.1至2体积空气(在标准条件下)，优选每小时每体积液体0.2至1体积空气的速率供料给罐1。

该设备还包括鼓泡塔7，以进行生产步骤。作为提醒，鼓泡塔是由圆柱形塔组成的反应室，其高度与直径比通常为1至10，优选2.5至6。该塔装配有空气注入装置，其任选富含氧。该注入装置位于塔的底部，使得注入的空气向全部体积的整体供给气泡，并由此供给氧气。注入装置可以是穿孔板、穿孔管系统或本领域技术人员已知的任何其它系统。W.D.Deckwer (J.Wiley & Sons, 1992)的申请“Bubble Column Reactors”提供了鼓泡塔的全面描述，根据鼓泡塔是空的还是装配有穿孔板内件、再循环管或其它组件，鼓泡塔可以采取多种不同的形式。

根据图1的鼓泡塔7的简化图示表示了向鼓泡塔供料8诱导性碳基底物，在下部与外部空气入口12流体连接的鼓泡装置11。

鼓泡塔具有40至1000 m

如上文先前所述，鼓泡塔可以是空的，或者可以装配有内筒以促进液体的再循环。本领域技术人员随之将该反应器称为“气升式”反应器，它是简单鼓泡塔的公知变体，并且也可用于本发明的环境中。

与罐1类似，鼓泡塔7在1至5巴绝对压力下操作。空气11、12以每小时每体积液体0.1至2体积空气(在标准条件下)，优选每小时每体积液体0.2至1体积空气的流速供料给鼓泡塔7。

培养基通过两个反应器之间的流体连接13从搅拌罐1转移到鼓泡塔7，所述流体连接13为连接两个反应器的一个或多个管的形式。在这种情况下，这些管设置在两个反应器的底部部分，两者基本上都根据垂直轴取向。这些管装配有泵15和手动阀或控制阀，这些允许将培养基从罐1转移到待执行的鼓泡塔7。

在罐1中的生长步骤和鼓泡塔中的生产步骤之间稀释培养基的步骤可以以三种不同的方式进行：-或者在罐1中，在生长结束时，通过在转移到塔7之前将含水液体供应至注入点2，-或者在流体连接处，通过在转移过程中将含水液体供应至培养基(注入点14)，-或者在塔7的入口处，通过在注入点9将含水液体供应至塔7。也可以选择混合这三种稀释模式，换句话说，例如在转移过程中和/或在鼓泡塔中，在罐中加入一些所需的水，而在另一部分中加入一些所需的水。目标是达到所需的稀释水平，例如大约2，这取决于两个反应器各自的容积、生长步骤结束时培养基的粘度等。

因此，根据本发明的在先稀释步骤特别使得可以将生物质的最终浓度调节到5至20 g/L的目标浓度。

考虑到生长和生产的时间不同(在两个步骤的时间之间可能存在3至8的因子，生长总是较短的步骤)，根据本发明的生产酶的工业方法能够使用比鼓泡塔的数量更少数量的搅拌罐，由此使得两种类型的发酵罐的利用最大化成为可能。

例如，如果步骤(a)持续50小时并且步骤(c)持续200小时，则在稀释(b)之后，可以将搅拌罐的内容物转移到第一鼓泡塔中，然后可以将该罐再次重新用于进行步骤(a)。然后将罐中新的内容物稀释并转移到另一个鼓泡塔中。鼓泡塔和搅拌式反应器的数量随着每个步骤的持续时间的变化而进行调节。

实施例

实施例1是对比在分批补料生产步骤过程中在经稳定的生物质的相应浓度为12.5g/L和25 g/L下进行的两个生产阶段的实施例。根据本发明的实施例2证明了在生长步骤期间在搅拌罐中进行的方案和在酶生产步骤期间在鼓泡塔中进行的方案所获得的可行性和生产性能。

对比例3证明了在没有遵守本发明的条件的情况下在鼓泡塔中进行生长步骤的困难。

实施例1 (对比-本发明的初步措施)

纤维素酶在机械搅拌的发酵罐(未显示在图1中)中产生。矿质培养基具有以下组成：KOH 1.66 g/L，H

将含有矿质培养基的发酵罐在120℃下灭菌20分钟；将碳基葡萄糖源在120℃下单独灭菌20分钟，然后以无菌方式加入罐1中以使最终浓度为25 g/L。发酵罐用里氏木霉菌株CL847的液体预培养物以10% (v/v) 接种。预培养物的矿质培养基与发酵罐的矿质培养基相同，除了加入5 g.L

生长步骤在搅拌式生物反应器1中进行50小时，初始浓度为50 L葡萄糖，温度为27℃，且pH为4.8 (用5.5 M氨水调节)。通气为0.5 vvm (体积/体积/分钟)，且培养基中溶解氧分压为40%的P O

将250 g/L乳糖溶液以35至45 mg/g细胞/小时的速率连续注入两个反应器中164小时(对于采用12.5 g/L生物质的实验为大约2 mL/h，对于采用25 g/L生物质的实验为4mL/h)。将温度降低至25℃，并保持pH处于4，直至培养结束。通过加入5.5 N氨水溶液调节pH，其提供分泌的蛋白质的合成所需的氮。溶解氧含量保持在40%的P O

在通过过滤或离心分离菌丝体后，通过使用Lowry方法和BSA标准品分析细胞外蛋白质来监测酶的生产。

图2a显示了对于采用25 g/L生物质的实验，细胞生物质和蛋白质的质量变化，且图2b显示了相同的曲线，但是经稳定的生物质为12.5 g/L。两个图的对比显示，对于采用25g/L生物质的实验，获得47 g蛋白质，而对于在12.5 g/L生物质下的实验，仅获得36 g蛋白质。相反，对于在12.5 g/L生物质下的实验，识别为gp的蛋白质生产的比速率显著更高(大约高65%)。事实上，在25 g/L生物质下，比速率为12±2 mg/g/h，而对于在12.5 g/L生物质下的实验，比速率为20±1 mg/g/h。

这样的对比令人惊讶地显示，相对于25 g/L的浓度，采用12.5 g/L的生物质浓度获得了高至少50%的比速率。这表明了在生产步骤之前进行稀释的优点，由此决定了以下本发明实施例2中呈现的生产模式。

实施例2 (根据本发明)：

在与实施例1相同的条件下进行实验，除了在搅拌罐1中进行稀释步骤(使细胞生物质的浓度从25 g/L转变至12.5 g/L)之后，在通过管道系统13从一个反应器转移至另一个反应器之后，在鼓泡塔7中进行生产步骤，因此在生产中仅通过将空气以1 vvm注入鼓泡塔中进行搅拌。

细胞生物质的质量变化和蛋白质质量变化显示在图2c中：从该图可以看出，所获得的蛋白质的最终质量为42 g (在分批补料生产168 h之后)。计算出的蛋白质生产的比速率为22±1 mg/g/h。

实施例3 (对比)：

实施例3在与实施例1相同的条件下进行，但模拟了如生产中那样的鼓泡塔中的生长步骤：在该实施例中，在搅拌罐中进行生长，但不搅拌，以模拟鼓泡塔中的操作。

这样的结果是培养失败。无法测量在搅拌轴周围形成大球的生物质的浓度，其尚未活化。

总之，本发明整合了中间稀释步骤，其对方法的性能具有非常有利和出乎意料的影响。此外，还证明了使用两种不同类型的反应器来进行生长步骤和生产步骤，使得这些步骤在工业上最佳的条件下进行是非常有利的：本发明允许以稳健和有效的方式将蛋白质生产转变至工业规模，在其实施中保持简单易行且非常灵活。