肺纤维化大鼠模型、其建立方法及评估方法

摘要

本发明公开了一种肺纤维化大鼠模型、其建立方法及评估方法。该肺纤维化大鼠模型建立方法，包括如下步骤：将博来霉素冻干粉用生理盐水溶解，制备成博来霉素溶液；采用喷雾式给药装置将所述博来霉素溶液在第一组大鼠肺部给药，同时采用喷雾式给药装置将生理盐水溶液在第二组大鼠肺部给药；每只大鼠的所述博来霉素溶液以及所述生理盐水溶液的总注射量均分多次给药，在大鼠吸气时快速注射；注射完成后，保持大鼠头朝上、尾朝下的姿势并横向左右晃动几次。本发明肺纤维化大鼠模型建立方法，可扩大博来霉素的分布范围并避免药物过多沉积于近端气道而非远端气道，从而增加受损肺组织比例而加重总体肺脏的肺功能损伤，使动物模型更符合IPF的肺功能特征。

说明书

技术领域

本发明属于肺部病灶模型技术领域，具体涉及肺纤维化大鼠模型、其建立方法及评估方法。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是一种严重危害人类健康的间质性肺疾病，患者肺功能表现为限制性通气功能障碍。博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化模型是目前最常见的IPF动物模型。然而，按照目前文献所报导的常规方法建立的肺纤维化模型虽然肺内具有纤维化病灶，但肺功能损伤普遍较轻，可能不具有限制性通气功能障碍，与IPF的肺功能损伤程度并不相符。据推测，可能有以下三方面原因：①博来霉素的使用剂量较低造成肺纤维化太轻；②大量博来霉素液体由于在近端气道沉积而难以到达肺泡引发肺间质纤维化；③博来霉素在肺内分布范围太小而导致肺内仍存在大量可发挥正常呼吸功能的肺组织。因此，需要针对目前的肺纤维化模型缺点进行建模方法的改进。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种肺纤维化大鼠模型建立方法。

本发明还提供一种肺纤维化大鼠模型。

本发明还提供一种肺纤维化大鼠模型的评估方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种肺纤维化大鼠模型建立方法，包括如下步骤：

将博来霉素冻干粉用生理盐水溶解，制备成博来霉素溶液；

采用喷雾式给药装置将所述博来霉素溶液在第一组大鼠肺部给药，同时采用喷雾式给药装置将生理盐水溶液在第二组大鼠肺部给药；

每只大鼠的所述博来霉素溶液以及所述生理盐水溶液的总注射量均分多次给药，在大鼠吸气时快速注射；

注射完成后，保持大鼠头朝上、尾朝下的姿势并横向左右晃动几次。

上述的肺纤维化大鼠模型建立方法，博来霉素溶液采用喷雾式给药装置给药，以气溶胶的形式进入肺内，可增加受损肺组织比例而加重总体肺脏的肺功能损伤程度，使动物模型更符合IPF的肺功能特征；另外，注射完成后，大鼠左右晃动，使得博来霉素液体的分布范围更大，减少博来霉素液体在近端气道过多沉积的同时增加液体在远端气道的分布，从而进一步加重纤维化病变，使之更符合IPF的肺功能特征，具备更明显的限制性通气功能障碍。

一实施例中，大鼠实验前禁食至少8h。

一实施例中，所述博来霉素溶液的浓度为4mg/mL-6mg/mL，按照大鼠的重量，所述博来霉素溶液及所述生理盐水溶液的注射剂量均为 1.5mL/kg-2.5mL/kg。采用该剂量用药，可以保证大鼠肺部可以大范围接收到药物，加大肺功能损伤程度。

一实施例中，所述博来霉素溶液以及所述生理盐水溶液分多次给药时，每次给药45μL-55μL。采用分次给药的方法，每次药物均能在肺部分散，减少药物在近端气道沉积。

一实施例中，注射完成后，将大鼠常规饲养。

本发明还提供一种肺纤维化大鼠模型，由所述的肺纤维化大鼠模型建立方法形成。

本发明还提供一种肺纤维化大鼠模型的评估方法，注射所述博来霉素溶液的大鼠形成实验组大鼠，注射所述生理盐水溶液的大鼠形成对照组大鼠，检测所述实验组大鼠与所述对照组大鼠的肺总量、肺活量、深吸气量、补吸气量、动态肺顺应性、静态肺顺应性、转化生长因子-β1、检测羟脯氨酸及肺组织病理学情况，并进行对比。

附图说明

图1是本发明实施例所述的肺纤维化大鼠模型采用喷雾式给药装置给药的示意图；

图2是本发明实施例所述的肺纤维化大鼠模型的对照组肺组织HE染色图；

图3是本发明实施例所述的肺纤维化大鼠模型的对照组肺组织Masson染色图；

图4是本发明实施例所述的肺纤维化大鼠模型的实验组肺组织HE染色图；

图5是本发明实施例所述的肺纤维化大鼠模型的实验组肺组织Masson染色图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明实施例所述的肺纤维化大鼠模型建立方法，包括如下步骤：

将博来霉素冻干粉用生理盐水溶解，制备成博来霉素溶液；

请参照图1，采用喷雾式给药装置将博来霉素溶液在第一组大鼠肺部给药，同时采用喷雾式给药装置将生理盐水溶液在第二组大鼠肺部给药；

每只大鼠的博来霉素溶液以及生理盐水溶液的总注射量均分多次给药，在大鼠吸气时快速注射；

注射完成后，保持大鼠头朝上、尾朝下的姿势并横向左右晃动几次。

其中,第一组为实验组,第二组为对照组。

博来霉素溶液采用喷雾式给药装置给药，以气溶胶的形式进入肺内，可增加受损肺组织比例而加重总体肺脏的肺功能损伤程度，使动物模型符合IPF 的肺功能特征；另外，注射完成后，大鼠左右晃动，使得博来霉素液体的分布范围更大，减少博来霉素液体过多沉积于近端气道，增加药物在远端气道的分布，从而进一步加重纤维化病灶特征，更符合IPF的肺功能特征，而且具备明显的限制性通气功能障碍。

大鼠实验前禁食至少8h。

博来霉素溶液的浓度为4mg/mL-6mg/mL，按照大鼠的重量，博来霉素溶液及生理盐水溶液的注射剂量均为1.5mL/kg-2.5mL/kg。采用该剂量用药，可以保证大鼠肺部可以大范围接收到药物，加大肺功能损伤程度。

博来霉素溶液以及生理盐水溶液分多次给药时，每次给药45μL-55μL。采用分次给药的方法，每次药物均能在肺部分散，减少药物在近端气道沉积。

注射完成后，将大鼠常规饲养。

本发明还提供一种肺纤维化大鼠模型，由上述的肺纤维化大鼠模型建立方法形成。

本发明还提供一种肺纤维化大鼠模型的评估方法，注射博来霉素溶液的大鼠形成实验组大鼠，注射生理盐水溶液的大鼠形成对照组大鼠，检测实验组大鼠与对照组大鼠的肺总量、肺活量、深吸气量、补吸气量、动态肺顺应性、静态肺顺应性、转化生长因子-β1、检测羟脯氨酸及肺组织病理学情况，并进行对比。采用对照组和实验组的形式进行对比，可以更容易地判断出肺部纤维化情况。

实施例

本实施例所述的肺纤维化大鼠模型建立方法，包括如下步骤：

材料：选取SPF级雄性SD大鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)20 只，随机分为对照组和实验组，各10只。博来霉素冻干粉(中国瀚晖制药有限公司)；异氟烷(美国WESTGENE公司)；喷雾式给药装置(上海玉研科学仪器有限公司)。

准备：大鼠禁食8h但不禁饮。用生理盐水溶解博来霉素冻干粉，制备成5mg/ml的博来霉素溶液，润洗喷雾式肺部给药装置并排除装置内空气；对照组大鼠给予生理盐水，实验组大鼠给予博来霉素溶液。

实验：

1、大鼠经小动物气体麻醉机吸入异氟烷诱导麻醉后，进行称重，按照 2mL/kg计算生理盐水或博来霉素溶液的注射液体量。

2、预先吸取生理盐水或博来霉素溶液的喷雾式肺部给药装置经大鼠气管往肺内注射液体。每只大鼠的额定总注射量分多次注射，每次50μl，在大鼠吸气时快速注射。每注射完50μl，将大鼠连同手术固定板立起，保持大鼠头朝上、尾朝下的姿势并横向左右晃动5次，以使造模药物在大鼠肺内更均匀地分布和防止溶液倒流。注射完毕将大鼠放回笼中常规饲养。

本实施例所述的肺纤维化大鼠模型的评估方法为：

在建模后第21天，检测大鼠肺功能：肺总量(TLC)、肺活量(VC)、深吸气量(IC)、补吸气量(IRV)、动态肺顺应性(Cdyn)、静态肺顺应性 (Cchord)。

检测完肺功能后将其安乐死，采集血液用于制备血清并检测其中的转化生长因子-β1(TGF-β1)，采集肺组织用于组织病理学分析(HE染色、Masson 染色和Ashcroft评分)和检测羟脯氨酸(HYP)。其中，对照组肺组织HE染色见图2，对照组肺组织Masson染色见图3，实验组肺组织HE染色见图4，实验组肺组织Masson染色见图5。

统计方法：采用统计学软件SPSS 23.0版本进行统计分析。所用数据进行正态性检验后以均数±标准差的形式表示。对照组和实验组之间的对比采用两个独立样本的t检验。P<0.05被认为有显著性差异。结果见表一和表二。

表一肺功能结果

表二血清TGF-β1、肺组织Ashcroft评分和HYP

由表一和表二结果可以看出：

肺功能：与对照组相比，实验组TLC、VC、IC、IRV、Cdyn、Cchord显著降低(P<0.05)。

血清TGF-β1：与对照组相比，实验组TGF-β1显著升高(P<0.05)。组织病理学分析：对照组肺内未见纤维化病灶，实验组肺泡结构严重受损，肺间质中大量成纤维细胞和胶原纤维沉积，肺泡间隔严重增厚。与对照组相比，实验组Ashcroft分值显著升高(P<0.05)。

肺组织HYP：与对照组相比，实验组HYP显著升高(P<0.05)。

结论：成功建立具有肺纤维化大鼠模型。

上述肺纤维化大鼠模型的应用：IPF是一种进行性加重的肺疾病，严重危害人类健康，但目前治疗手段十分有限，因此，需探索新的治疗方法或药物。本发明建立的具有肺纤维化大鼠模型，病变特点与IPF极为相似，可用于新疗法或新药物的疗效评估，并可避免既往模型由于病变较轻而夸大新疗法或新药物疗效的情况，有利于观察新疗法或新药物的真实疗效。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。