一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法及其在清咽产品中的应用

摘要

本发明提供了一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法及其在清咽产品中的应用，涉及化学纯化技术领域，该联合提取方法包括如下步骤：(1)将藤茶、牛蒡子干燥后粉碎，得到藤茶粉末和牛蒡子粉末，将牛蒡子粉末脱脂后与藤茶粉末混合，加入至溶剂A中浸泡，第一次微波提取，过滤，得到滤液A和滤渣，将滤渣加入至溶剂B中浸泡，第二次微波提取，过滤，得到滤液B；(2)将滤液A和滤液B混合后，过层析柱，分别得到二氢杨梅素和牛蒡苷。该提取方法简单高效，能够同时提取出纯度以及含量较高的二氢杨梅素和牛蒡苷用以清咽产品的制备。

说明书

技术领域

本发明涉及化学纯化技术领域，具体涉及一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法及其在清咽产品中的应用。

背景技术

牛蒡苷是牛蒡子中的一种活性成分，其含量占牛蒡子的8.4％左右，具有显著的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等生理活性。二氢杨梅素，多提取自显齿蛇葡萄叶，质具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种奇特功效。目前，牛蒡苷的提取有乙醇加热回流法、超声微波辅助提取法和水煮法，其中以乙醇加热回流法最为常见。而二氢杨梅素则往往通过溶剂提取、超声提取以及色谱分离等方式进行提取。

经研究者研究发现，牛蒡苷和二氢杨梅素对于清咽拥有良好的功效，但目前为止，对于牛蒡苷，多数联合提取方法仍主要以牛蒡子油、牛蒡苷、牛蒡苷元、牛蒡酚E和牛蒡酚H进行同时联合提取；而对于二氢杨梅素而言，联合提取也往往针对藤茶多糖、藤茶多酚、杨梅素和二氢杨梅素进行。例如，中国专利CN105037310B公开了一种同时提取杨梅素和二氢杨梅素的工艺，该工艺以藤茶为原料，具体包括：1)三道提取；2)澄清；3)脱色、过滤；4)粗晶形成；5)精制等步骤。可以制得高纯度，高产的杨梅素和二氢杨梅素，其中，二氢杨梅素收率可以达到25％。中国专利CN105669797B则公开了一种从牛蒡子中分离牛蒡子油、牛蒡苷、牛蒡苷元、牛蒡酚E和牛蒡酚H的方法，该发明采用连续式的一条路线即可完成多种产物的分离，充分利用了原料，节约了资源，脱脂过程不会污染环境，得到的牛蒡子油营养价值高，牛蒡苷元、牛蒡苷、牛蒡酚E和牛蒡酚H纯度高，可单独或与其他物质混合作为原料应用于药食领域。但整体而言，当涉及到多种成分的提取时，往往工序复杂且相对应的产物纯度以及产量也较低，另外，当涉及到牛蒡苷和二氢杨梅素二者进行联合提取时，往往面临着产量以及纯度较低的问题，因此相关文献鲜少有记载。

针对二氢杨梅素和牛蒡苷提取联合提取技术中存在的方法复杂，产量以及纯度较低的问题，亟需寻找一种提取含量更高、更为简便的方法，进而能够高效率地同时提取得到二氢杨梅素和牛蒡苷，进而用于具有清咽功效的相关产品的制备。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法及其在清咽产品中的应用，该提取方法简单高效，能够同时提取出纯度以及含量较高的二氢杨梅素和牛蒡苷用以清咽产品的制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法，包括如下步骤：

(1)将藤茶、牛蒡子干燥后粉碎，得到藤茶粉末和牛蒡子粉末，将牛蒡子粉末脱脂后与藤茶粉末混合，加入至溶剂A中浸泡，第一次微波提取，过滤，得到滤液A和滤渣，将滤渣加入至溶剂B中浸泡，第二次微波提取，过滤，得到滤液B；

(2)将滤液A和滤液B混合后，过层析柱，分别得到二氢杨梅素和牛蒡苷；

所述溶剂A为乙醇、乙酸乙酯和维生素E；

所述溶剂B为乙醇和柠檬酸。

进一步地，步骤(1)中所述溶剂A与脱脂后的牛蒡子粉末和藤茶粉末混合物的重量比为5-6:1。

进一步地，步骤(1)中所述溶剂A中乙醇、乙酸乙酯和维生素E的重量比为8-10:3-5:1，优选为9:3:1。

进一步地，步骤(1)中所述溶剂B中乙醇和柠檬酸的重量比为6-8:1，优选为7:1。

进一步地，步骤(1)中所述溶剂A和溶剂B的重量比为2-5:1。

进一步地，步骤(1)中所述第一次微波提取的温度为60-80℃，提取时间为5-10min，所述第二次微波提取的温度为90-100℃，提取时间为3-5min。

进一步地，步骤(2)中所述过层析柱，具体为过强极性大孔吸附树脂柱，以0.51.0mL/min流速吸附，先使用质量分数为20％的乙醇洗脱4-6个柱体积洗脱，浓缩得到二氢杨梅素，后使用乙醇和乙醚混合液洗脱5个柱体积洗脱，浓缩得到牛蒡苷。所述乙醇的质量分数为，所述乙醇和乙醚的体积比为8:1。

进一步地，步骤(1)溶剂A中所述乙醇的质量分数为70％，溶剂B中所述乙醇的质量分数为30％。

进一步地，步骤(1)中所述浸泡的时间均为2h。

进一步地，步骤(1)中所述粉碎的粒径为80目。所述脱脂具体为将使用CO

本发明还提供了一种清咽产品，包含上述联合提取方法制备得到的二氢杨梅素和牛蒡苷。

进一步地，所述清咽产品的原料包括如下组分：藤茶和牛蒡子。

优选地，所述清咽产品的原料按重量份数计，包括如下组分：15-30份藤茶和6-12份牛蒡子。

进一步地，上述产品的制备方法包括粉碎、提取、混合、造粒、内包等步骤。

本发明所取得的技术效果是：

(1)本发明通过对二氢杨梅素和牛蒡苷联合提取方法中溶剂以及各项参数的优化，充分利用溶剂的抗氧化性以及相互之间的促溶解性，显著提高了二氢杨梅素和牛蒡苷二者的含量和纯度。

(2)本发明通过原料的选择以及配比的优化，得到了一种具有高效清咽作用的产品，其中，产品原料提取得到的二氢杨梅素和牛蒡苷二者对于清咽具有协同增效的作用。

具体实施方式

值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

实施例1

一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法，包括如下步骤：

(1)将藤茶、牛蒡子干燥后粉碎至80目，得到藤茶粉末和牛蒡子粉末，将牛蒡子粉末脱脂后(脱脂具体为将使用CO

(2)将滤液A和滤液B混合后，过层析柱，具体为过强极性大孔吸附树脂柱，以0.5mL/min流速吸附，先使用质量分数为20％的乙醇洗脱4-6个柱体积洗脱，浓缩得到二氢杨梅素，后使用质量分数为70％的乙醇和乙醚的混合液(二者的体积比为8:1)洗脱5个柱体积洗脱，浓缩得到牛蒡苷，分别得到二氢杨梅素和牛蒡苷；

其中，溶剂A为重量比为8:3:1的乙醇、乙酸乙酯和维生素E；溶剂B为重量比为6:1的乙醇和柠檬酸；溶剂A和溶剂B的重量比为2:1；溶剂A与脱脂后的牛蒡子粉末和藤茶粉末混合物的重量比为5:1。

实施例2

一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法，包括如下步骤：

(1)将藤茶、牛蒡子干燥后粉碎至80目，得到藤茶粉末和牛蒡子粉末，将牛蒡子粉末脱脂后(脱脂具体为将使用CO

(2)将滤液A和滤液B混合后，过层析柱，具体为过强极性大孔吸附树脂柱，以1.0mL/min流速吸附，先使用质量分数为20％的乙醇洗脱4-6个柱体积洗脱，浓缩得到二氢杨梅素，后使用质量分数为80％的乙醇和乙醚的混合液(二者的体积比为8:1)洗脱5个柱体积洗脱，浓缩得到牛蒡苷，分别得到二氢杨梅素和牛蒡苷；

其中，溶剂A为重量比为10:5:1的乙醇、乙酸乙酯和维生素E；溶剂B为重量比为8:1的乙醇和柠檬酸；溶剂A和溶剂B的重量比为5:1；溶剂A与脱脂后的牛蒡子粉末和藤茶粉末混合物的重量比为6:1。

实施例3

一种二氢杨梅素和牛蒡苷的联合提取方法，包括如下步骤：

(1)将藤茶、牛蒡子干燥后粉碎至80目，得到藤茶粉末和牛蒡子粉末，将牛蒡子粉末脱脂后(脱脂具体为将使用CO

(2)将滤液A和滤液B混合后，过层析柱，具体为过强极性大孔吸附树脂柱，以0.8mL/min流速吸附，先使用质量分数为20％的乙醇洗脱4-6个柱体积洗脱，浓缩得到二氢杨梅素，后使用质量分数为75％的乙醇和乙醚的混合液(二者的体积比为8:1)洗脱5个柱体积洗脱，浓缩得到牛蒡苷，分别得到二氢杨梅素和牛蒡苷；

其中，溶剂A为重量比为9:3:1的乙醇、乙酸乙酯和维生素E；溶剂B为重量比为7:1的乙醇和柠檬酸；溶剂A和溶剂B的重量比为3:1；溶剂A与脱脂后的牛蒡子粉末和藤茶粉末混合物的重量比为5:1。

对比例1

与实施例3的区别仅在于，溶剂A为重量比为7:6:1的乙醇、乙酸乙酯和维生素E(乙醇、乙酸乙酯和维生素E三者的总重量与实施例3一致)；溶剂B为重量比为5:1的乙醇和柠檬酸(乙醇和柠檬酸二者的总重量与实施例3一致)。

对比例2

与实施例3的区别仅在于，溶剂A和溶剂B的重量比为6:1(溶剂A和溶剂B的总重量与实施例3一致)。

对比例3

与实施例3的区别仅在于，溶剂A不加入维生素E，溶剂B不加入柠檬酸(溶剂中剩余原料的用量重量比与实施例3一致)。

对比例4

与实施例3的区别仅在于，溶剂A中不加入乙酸乙酯(溶剂中其余原料的用量重量比与实施例3一致)。

对比例5

与实施例3的区别仅在于，仅进行一次微波提取，提取前浸泡时间为4h，使用浸泡的溶剂为溶剂A和溶剂B的混合液，提取温度为95℃，提取时间为12min。

应用实施例4

一种清咽产品，包含实施例3中联合提取方法制备得到的二氢杨梅素和牛蒡苷。

其中，清咽产品的原料按重量份数计，包括如下组分：15份藤茶和6份牛蒡子。

应用实施例5

与应用实施例4的区别仅在于，清咽产品的原料按重量份数计，包括如下组分：30份藤茶和12份牛蒡子。

应用实施例6

与应用实施例4的区别仅在于，清咽产品的原料按重量份数计，包括如下组分：22份藤茶和10份牛蒡子。

应用对比例6

与应用实施例6的区别仅在于，产品的原料按重量份数计，包括：3份藤茶、5份牛蒡子(藤茶和牛蒡子的总重量与应用实施例6一致)。

应用对比例7

与应用实施例6的区别仅在于，产品原料中，不加入藤茶，即将藤茶全部替换为牛蒡子。

应用对比例8

与应用实施例6的区别仅在于，产品原料中，不加入牛蒡子，即将牛蒡子全部替换为藤茶。

一、本发明中联合提取方法提取产品情况

考察实施例1-3以及对比例1-5中提取方法提取得到的牛蒡苷和二氢杨梅素含量以及纯度，得到表1。

表1

由表1可知，采用本发明中实时1-3的提取方法提取得到的牛蒡苷的含量达62-72mg/g，纯度达98.5％以上，二氢杨梅素的含量达384mg/g以上纯度达96.3％以上，相比而言，当提取过程的提取溶剂发生改变，或者提取过程发生变化时，牛蒡苷以及二氢杨梅素的含量和纯度均有所下降。

二、本发明中清咽产品的功效

实验样品：应用实施例4-6以及应用对比例6-8的中产品的浓缩液。产品人体推荐量为9g/60kgBW，具体浓缩步骤为：常压、温度80℃，加1050mL无菌水浸泡30min，提取2次，将提取液合并浓缩，得到1.5g产品/mL的浓缩液。

实验动物：

(1)l70-200g，SPF级SD雄性大鼠168只(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，许可证号：SCXK(京)2019-0008，按体重随机分为14组，每组12只，进行棉球植入实验和足趾肿胀实验；

(2)8-22g，SPF级BALB/C雄性小鼠84只(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，许可证号：SCXK(京)2019-0008，按体重随机分为7组，每组12只，进行耳肿胀实验。

各组均给予维持饲料。

实验方法：产品的推荐剂量为人体每日1.5g产品/mL，大鼠实验设置人体推荐量的15倍，即每日2.25g/kg BW剂量组，同时设空白对照组(0g/kg BW)。小鼠实验设置人体推荐量的30倍，即每日4.50g/kg BW剂量组，同时设空白对照组(0g/kg BW)。受试物：量取浓缩液18.0mL加无菌水至60.0mL。受试物每日一次经口给予，连续灌胃36d后测各项指标。大鼠灌胃体积为5mL/kg BW，小鼠灌胃体积为l0mL/kg BW。空白对照组用无菌水代替受试物，每日灌胃体积与受试物剂量组相同。各剂量组均给予维持饲料。

数据处理：用SPSS软件进行数据处理。采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F

(1)实验1：大鼠棉球植入实验

实验结束前8天，用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处的毛，乙酰麻醉大鼠，碘伏消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤，植入经高压灭菌并烘干、称重的棉球，缝合切口，继续给予受试物。实验结束当天，给受试物1小时后，断颈处死大鼠，在原缝合处剪开皮肤，剥离并取出棉球肉芽组织，置于已称重洁净平皿中，恒温干燥箱60℃开盖干燥l小时后称重，计算肉芽肿净重量。

肉芽肿净量(mg)＝干燥后棉球肉芽肿重量-原棉球重量

(2)实验2：大鼠足趾肿胀实验

实验结束当天给一次受试样品，1小时后，用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足趾的容积，作为0小时足趾容积。然后在大鼠右后足趾皮下注入1％葡聚糖4万0.lmL/只，分别于1小时和6小时测量大鼠足趾的容积，同一部位测量3次，取平均值。以不同时间所测足趾容积与致炎剂作用前的足趾容积之差为肿胀值，计算各个时间段的足趾肿胀率。

肿胀率(％)＝肿胀值/致炎前足趾容积×l00％

(3)实验3：小鼠耳肿胀实验

实验结束当天，汲取二甲苯20μL，滴加在小鼠右耳外侧面耳廓的中央，让其自由扩散，30min后，将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用9mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称重(及时称重，以避免水分失去而影响实验结果)，以两耳重量之差为耳廓肿胀值，计算耳廓肿胀率。

耳廓肿胀率(％)＝耳廓肿胀值/对照耳片重量×l00％

经研究发现，在进行上述各项实验后，大、小鼠的体重在各剂量组与空白对照组间比较差异均无显著性，此处不再详细列举，其他功效性实验结果分别如下表2-4所示。

表2大鼠棉球植入实验肉芽肿净量

(*：与空白对照组比较有显著性差异)

由表2可知，分别经口给予大鼠应用实施例4-6受试物36d后，与0g/kg BW组比较，22.5g/kg BW鼠肉芽肿净量降低，有显著性差异。而相比较之下，应用对比例6-8的肉芽肿净含量尽管由于牛蒡子或者藤茶的作用而降低，但牛蒡子和藤茶不能或者难以发挥二者之间的协同作用，因此相对而言，并无显著性。

表3注射致炎剂1％葡聚糖4万后1小时以及6小时大鼠足趾肿胀率

(*：与空白对照组比较有显著性差异)

由表3可知，分别经口给予大鼠应用实施例4-6受试物36d后，与0g/kg BW组比较，2.25g/kg BW组注射致炎剂1％葡聚糖4万后1小时足趾肿胀率降低，有显著性差异。而相比较之下，应用对比例6-8的大鼠足趾肿胀率尽管由于牛蒡子或者藤茶的作用而降低，但牛蒡子和藤茶不能或者难以发挥二者之间的协同作用，因此相对而言，并无显著性。而6小时后，尽管无显著性，但各个应用实施例组相比于对比例组的肿胀率的下降值也更高。

表4小鼠耳肿胀实验耳廓肿胀率

(*：与空白对照组比较有显著性差异)

由表4可知，经口给予小鼠受试物36d后，应用实施例4-6以及应用对比例6-8小鼠耳廓肿胀率与0g/kg BW组比较，差异均无显著性。但耳廓肿胀率的降低情况明显表现为应用实施例组优于应用对比例组，这是由于各个对比例中牛蒡子和藤茶不能或者难以发挥二者之间的协同作用，因此相对而言，显著性不强。

综上可知，本发明中的清咽产品清咽效果较好，产品原料中的藤茶以及牛蒡子二者之间具有协同清咽作用。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。