23-乙酰泽泻醇C的纯化制备方法及其用于制备抗骨质疏松药物的用途

摘要

本发明涉及中药单体药效领域，具体涉及一种23‑乙酰泽泻醇C的纯化制备方法及其制备抗骨质疏松药物的用途；具体利用超声提取结合高速逆流色谱法得到纯化的23‑乙酰泽泻醇C，具有速度快、纯度高、成本低，且可以大量制备的优点；本发明研究发现，23‑乙酰泽泻醇C抑制RANKL诱导的JNK，NFATc1，c‑Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白上调。23‑乙酰泽泻醇C还以剂量依赖性方式下调JNK，NFATc1，c‑Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白。这些结果表明23‑乙酰泽泻醇C通过抑制RANKL介导的JNK激活来抑制破骨细胞生成，即23‑乙酰泽泻醇C具有用于制备抗骨质疏松药物的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及中药单体药效领域，具体涉及一种23-乙酰泽泻醇C的纯化制备方法及其制备抗骨质疏松药物的用途。

背景技术

骨质疏松症作为影响广大老龄患者尤其是绝经后女性的重要疾病之一，以骨微结构遭到破坏、骨骼强度、韧性衰减为特点，最终导致骨骼质量下降，发生脆性骨折的全身骨代谢疾病。骨也是一个动态平衡的组织，经历骨吸收和骨周期性活动，成人的骨骼健康取决于骨吸收和骨形成活性的同步平衡，成骨细胞和破骨细胞功能的平衡是通过骨重塑来维持的。然而，骨质疏松症患者存在明显的破骨细胞过度活动(破骨细胞比例增加)，骨质中成骨细胞和破骨细胞的失衡，由此导致骨质损失而诱发骨质疏松。破骨细胞是在成骨细胞严格的调控下，由造血单核细胞或巨噬细胞分化而来的多核细胞，成骨细胞通过表达巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子kb配体受体激活因子(RANKL)来影响破骨细胞的激活和形成，M-CSF由成骨细胞组成性表达，而RANKL可由成骨细胞对促骨激素、1α,25-二羟基维生素D3(1α,25(OH)

鉴于目前抗骨质疏松药物依然存在有效性和不良反应等的问题，如何在众多天然产物中开发具有制备抗骨质疏松药物用途的成分是亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何在众多天然产物中开发具有制备抗骨质疏松药物用途的成分。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种23-乙酰泽泻醇C的纯化制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将泽泻药材粉碎，制得泽泻粉末；

步骤2：将泽泻粉末与甲基叔丁基醚混合，超声提取，得到泽泻浓缩提取物；

步骤3：将泽泻浓缩提取物通过高速逆流色谱在220-230min得到的流分进行浓缩分离，得到纯化的23-乙酰泽泻醇C。

优选的，所述步骤3具体为：配置溶剂为正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水按10∶7∶7∶8的比例混合而成；

将所述溶剂在分液漏斗中振摇后静置分层，分取上相和下相，上相为固定相，下相为流动相；流动相超声脱气10min；将固定相泵入到空的制备型高速逆流色谱的分离管中，待出口处有液体流出，再将流动相泵入，此时设定波长254nm，水浴温度30℃，打开色谱工作站，设定参数；同时，接收流出液体，直至流动相流出分离管；所述高速逆流色谱柱的体积为300mL；

取泽泻浓缩提取物500mg溶于上相∶下相为1∶1，体积为10mL的溶剂中，由进样阀进样，同时工作站开始采集数据，根据监测器实时记录检测接收220-230min得到的流分进行浓缩分离，得到纯化的23-乙酰泽泻醇C。

优选的，所述步骤1具体为：将泽泻药材粉碎，过60目筛得泽泻粉末。

所述步骤2具体为：取泽泻粉末100g与甲基叔丁基醚800mL混合，超声处理30min，提取三次，合并三次提取液，得到泽泻浓缩提取物。

本发明还涉及23-乙酰泽泻醇C用于制备抗骨质疏松药物的用途。

本发明还涉及23-乙酰泽泻醇C用于制备抑制体内破骨细胞形成的药物的用途。

本发明还涉及23-乙酰泽泻醇C用于制备抑制破骨细胞前体活性以抑制破骨细胞形成的药物的用途。

本发明的有益效果在于：本发明涉及中药单体药效领域，具体涉及一种23-乙酰泽泻醇C的纯化制备方法及其制备抗骨质疏松药物的用途；具体利用超声提取结合高速逆流色谱法得到纯化的23-乙酰泽泻醇C，具有速度快、纯度高、成本低，且可以大量制备的优点；本发明研究发现，23-乙酰泽泻醇C抑制RANKL诱导的JNK，NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白上调。23-乙酰泽泻醇C还以剂量依赖性方式下调JNK，NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白。这些结果表明23-乙酰泽泻醇C通过抑制RANKL介导的JNK激活来抑制破骨细胞生成，即23-乙酰泽泻醇C具有用于制备抗骨质疏松药物的用途。

附图说明

图1为本发明实施例1中的泽泻甲基叔丁基醚提取物的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1中的泽泻提取物制备型高速逆流分离色谱图；

图3为本发明实施例1中的高速逆流分离流分Ⅰ纯度验证薄层色谱图；

图4为本发明实施例1中的高速逆流分离流分Ⅰ高效液相色谱法验证纯度鉴定高效液相色谱图；

图5为本发明实施例1中的高速逆流分离流分Ⅰ的紫外鉴定DAD全波长扫描结果图；

图6为本发明实施例1中的高速逆流分离流分Ⅰ的质谱图；

图7为本发明实施例1中的高速逆流分离流分Ⅰ的核磁共振图谱(A-E)；

图8为本发明实施例2中的23-乙酰泽泻醇C对OVX诱导的大鼠体重增加和器官系数的影响情况柱状图；

图9为23-乙酰泽泻醇C治疗对体内胫骨小梁微结构的影响情况图(A-F)；

图10为23-乙酰泽泻醇C对OVX大鼠血液生化参数的影响情况图(A-I)；

图11为23-乙酰泽泻醇C对大鼠共培养物中1α，25(OH)

图12为23-乙酰泽泻醇C对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响情况图(A-D)；

图13为23-乙酰泽泻醇C对RANKL诱导的信号通路的影响情况图(A-C)；

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明实施例所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。包括：

实施例1

1、实验材料与试剂

乙腈为色谱纯(德国Merck公司),高速逆流用溶剂均为分析纯(上海医药集团上海化学试剂公司)；实验用水为Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)制备并经微孔滤膜过滤；泽泻药材(建瓯GAP基地)；环己烷为分析纯(西陇化工股份有限公司)；乙酸乙酯为分析纯(上海联试化工试剂有限公司)；硫酸为分析纯(上海联试化工试剂有限公司)；正己烷为分析纯(上海联试化工试剂有限公司)；甲醇为分析纯(上海久亿化学试剂有限公司)；95％乙醇为分析纯(上海久亿化学试剂有限公司)；无水乙醇为分析纯(上海品杰化学试剂有限公司)；薄层层析硅胶G为化学纯(青岛海洋化工有限公司)。

2、实验仪器

高分辨飞行时间质谱仪(美国waters公司)；三重四极杆液质联用仪(美国waters公司)；2545AutoPurification质谱引导自动纯化系统(美国waters公司)；多功能提取浓缩设备(上海顺仪科技有限公司)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

3、实验药材

TBE-300A半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术公司)配备有多层聚四氟乙烯螺旋管柱(直径2.6mm，总体积300mL)；Sixstar NS-1007恒流泵(流速为0～9.99mL/min)，8823紫外检测器(北京新技术应用研究所)；六通进样阀(20mL定量环)；N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)。两台仪器均配备有HX1050恒温循环水浴系统(北京博医康实验器具公司)，用于控制实验中分离柱的温度。RE-2000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；DV-2150CD型十万分之一分析天平(美国OHAUS)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FY135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；DZF-300真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)。

4、泽泻粗提物制备

取泽泻药材粉碎，过60目筛得泽泻药材粉末，取泽泻约100g，置1000ml具塞三角瓶中，加入甲基叔丁基醚800mL，密塞，超声处理30min，提取三次，合并三次提取液，浓缩共得提取物2g。取样分析：以Ultimate XB-C18(4.6mm×250mm，5μm)分析型色谱柱，乙腈-水(65：35)，柱温：30℃，流速1.0mL·min

5、两相体系的选择

高速逆流色谱是一种新兴的无任何固态支持介质的液-液分配色谱技术，该技术能否成功分离目标组分的关键在于选择合适的两相溶剂体系。合适的两相溶剂体系应满足以下条件：(1)要有符合分离需要的固定相保留率；(2)两相溶剂分层时间不得超过30s；(3)分配系数(K)数值应接近于1并且相邻两化合物的分离因子(a，a＝K2/K1，K2＞K1)应大于1.5。一般而言，K值偏小会导致色谱峰分辨率较差，但如果K值偏大又会致使样谱带展宽。故采用分配系数测定法来选择溶剂体系，溶剂分配系数的测定方法：在10mL试管中，加入一定量的样品(约1.0mg)，分别加入等量(各4.0mL)的已平衡好的上、下相。充分振摇，使试管中的两相充分混合，同时也使样品在两相中充分溶解与分配，之后静止分层，分取同1ml的上、下相，减压挥干溶剂后，用1ml乙腈复溶，0.45μm微孔滤膜过滤后进样10μl HPLC分析，上、下两相平行操作。读取上、下两相中相对应色谱峰的峰面积，用上相溶剂中相应色谱峰的峰面积除以下相溶剂中相应色谱峰的峰面积即得到分配系数(K)，见表1。

表1 23-乙酰泽泻醇C在不同两相溶剂体系中的分配系数值

从表中可知正己烷:乙酸乙酯：甲醇：水(10:7:7:8)体系较为合适。

流动相溶剂配置在同一磨口三角瓶内混合震摇，再用超声波脱超声处理30分钟，静置冷却后，移液至同一分液漏斗密闭静置20分钟左右，使之饱和。在实验开始前1小时内，将两相溶剂分开放置在两玻璃容器内，并密闭静置，防止蒸发(也可实验前一夜配好上相、下相，分别置于两密闭容器内，密封避光保存)。

选择合适的两相溶剂系统是HSCCC分离纯化天然药物中活性成分的关键。适的两相溶剂体系应满足以下条件：(1)要有符合分离需要的固定相保留率；(2)两相溶剂分层时间不得超过30s；(3)分配系数(K)数值应接近于1并且相邻两化合物的分离因子(a，a＝K2/K1,K2＞K1)应大于1.5。如果分配系数K过小,出峰时间太快,峰之间的分离度较差；而分配系数K过大时出峰时间太长且峰形变宽。本实验经过多种溶剂体系测定，可知正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10:7:7:8)的K值为1.19，固定想保留率为58％，此时分离效果较好。其他影响高速逆流色谱分离效果的因素还有：固定相的保留值、转速、流速、温度等。

6、两相溶剂及样品液的配制

溶剂体系及用量体积比为正己烷：正丁醇：甲醇：水＝10:7:7:8。在室温下，按溶剂体系比配制溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相，流动相超声脱气10min。

泽泻粗提物在选定溶剂系统的上、下相中均能溶解，但在下相的溶解度大于上相。试验中分别用上相、下相和上下相混合溶剂制备样品溶液，并上样分离。结果表明，以上相溶剂和上下相混合溶剂溶解时，分离过程中均存在固定相流失的问题，从而导致分离初期的基线严重漂移；以上相溶解样品时，由于样品在其中的溶解度较小，需要大量的溶剂才能完全溶解样品，而且，由于进样体积较大，造成整个分离过程的分离度大大降低。因此，选择溶剂系统的下相作为溶样溶剂。

7、制备型高速逆流色谱分离制备

根据制备型高速逆流色谱的操作步骤，首先将固定相以9.9mL/min的流速泵入到空的制备型高速逆流色谱的分离管中，待出口处有液体流出(即固定相充满了分离管)；再将固定相换成流动相，以流速1.5mL/min泵入，此时打开主机电源，将分离管正向旋转，转速为850rpm；打开检测器，设定检测波长254nm；水浴温度30℃；打开色谱工作站，设定相关参数。同时，接收流出液体，直至流动相流出分离管(接收容器中出现明显的溶剂分层)，表明两相溶剂体系在分离管中建立了动态平衡，记录固定相排出的体积V。制备型高速逆流色谱柱体积为300mL，按公式1计算固定相保留率，为58％。

其中V是固定相排出量。

取样品溶液500mg溶于混合液(上相：下相1:1)10mL，由进样阀进样，同时工作站开始采集数据。根据检测器实时记录检测接收流份“Ⅰ”。泽泻提取物制备型高速逆流分离色谱图见图2。

8、HSCCC所得流份“Ⅰ”的HPLC分析及结构鉴定

对流分Ⅰ进行浓缩得到分离物15mg，对得到分离物的纯度进行检测与结构鉴定，采用薄层色谱法和高效液相色谱法对分得组分进行纯度检测(峰面积归一化法)，并采用MS、

9、纯度鉴定

9.1、薄层色谱法验证

将分离得到的化合物分别点样于三块硅胶薄层板(2.5*5cm)，用三种流动相分别展开，即石油醚：乙酸乙酯(2:1)，正己烷：乙酸乙酯(1:1)，石油醚：丙酮(4：6)展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃下显色至斑点清晰，结果可知薄层色谱中均只有单一斑点，分别见图3中a、b、c色谱图。

9.2高效液相色谱法验证

色谱条件：色谱柱：Ultimate ODS-C18色谱柱(150mm×4.6mm i.d.；5μm)(月旭，美国)；流动相：甲醇：水(62:38)，乙腈：水(60:40)，乙腈：水(65:35)。流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：254nm。可得其纯度为96.9％。见图4，其中，a-甲醇：水(62:38)；b-乙腈：水(60:40)；c-乙腈：水(65:35)。

10、结构鉴定

10.1、紫外鉴定

图5为紫外鉴定DAD全波长扫描结果图，说明该化合物有共轭双键结构；

10.2、质谱鉴定

电喷雾离子化源(ESi)，正离子扫描模式，毛细管电压：2.50kV，锥孔电压70V，离子源温度120℃，脱溶剂温度200℃，脱溶剂气体(N2)流速为400L/h，锥孔气体(N2)流速50L/h，质量扫描范围：m/z 350～600，质谱图见图6。制备的单体分子离子峰为551，[M+Na]

10.3、

核磁共振氢谱

根据紫外、质谱、

23-乙酰泽泻醇C(alisol C 23-acetate)

综上，高速逆流色谱技术作为二十世纪八十年代初兴起的新型液一液分配色谱技术，具有分离纯度高、样品回收率高、适用范围广、可一步制备纯品的优点，既适用于小量分析，也可用于规模纯化；根据以上实验可知，用高速逆流色谱分离制备23-乙酰泽泻醇C，速度快、纯度高、成本低，且可以大量制备，故用高速逆流色谱来分离纯化泽泻中的23-乙酰泽泻醇C将会是很好的发展趋势。

实施例2

1、试剂与抗体

由实施例1制得的23-乙酰泽泻醇C。戊酸雌二醇(EV)购买自Delpharm Lille SAS(法国巴黎)。Proteintech(Rosemont，IL，USA)提供了抗OPG，RANKL，M-CSF，c-Fos，NFATc1，MMP9，PI3K，JNK，p38，磷酸化(p)-p38，p-JNK，p-AKT，CTK，TRAP和β-肌动蛋白。R&D Systems(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)，RANKL购买自M-CSF Prospec(美国新泽西州东布伦瑞克)。胎牛血清(FBS)购买自Gibco Co.(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

2、动物

福建医科大学实验动物中心提供了3个月大的健康雌性Sprague-Dawley大鼠。他们的平均体重为280±10克。对动物进行人性化维护，并按照福建医科大学伦理委员会的要求执行实验方案。将动物圈养在22±2℃，光照/黑暗周期为12小时(7：00-19：00)。在整个实验过程中，为他们提供食物和水。将十只大鼠随机分为五个组。四组行双侧卵巢切除术。假手术组在不切除卵巢的情况下进行切口缝合。从麻醉中恢复后，将四个OVX组口服给予媒介物(H

3、骨结构分析

通过高分辨率的体内X射线显微断层摄影术(Skyscan 1276，Bruker，卡尔斯鲁厄，德国)评估没有附着软组织的胫骨的形态。分析生成2D和3D图像。用CTAn软件测量小梁骨变量，获得股骨的BMD，小梁厚度/数目(分别为Tb.Th和Tb.N)和BV/TV。胫骨近端是分析的重点部位。

4、组织学和组织形态分析

对大鼠实施安乐死后，取材胫骨，将其胫骨在反复振荡下在10％(w/v)EDTA中脱钙。每3天更换一次溶液。将脱钙的胫骨包埋在石蜡中，进行Masson三色染色，切片，在显微镜下检查，以确认除胫骨平台以外的近端胫骨干phy端的变异。用Motic Med 6.0数字医学图像分析装置(Motic Instruments，巴塞罗那，西班牙)计算骨小梁面积％(视野中的骨小梁面积/总小梁面积)。

5、血清骨转换标志物检测

使用ELISA试剂盒(Biotechnology Systems，Shanghai，China)测量了血清β胶原降解产物(β-CTX)，组织蛋白酶K(CTK)，骨碱性磷酸酶(BALP)，E2和骨钙素(OCN)。同时也测定白细胞介素-1(IL-1)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-6。

6、细胞分离与共培养

6.1、大鼠颅盖成骨细胞分离

从1日龄SD大鼠的颅骨中分离出成骨细胞。将颅盖在120rpm的水浴中振摇，并在37℃下用50mL 0.2％(w/v)分散酶和0.1％(w/v)胶原酶的混合物消化15分钟。回收胶原酶溶液，并加入10mL新鲜的胶原酶溶液。将颅盖在120rpm的水浴中振摇，并在37℃下再孵育10分钟。胶原酶分散酶消化重复3-4次。通过离心收集原代成骨细胞，并在含有MEM和10％(v/v)胎牛血清(FBS)的10厘米培养皿中培养3天。在含有胰蛋白酶-EDTA的培养皿中分离细胞，将其悬浮在含10％(v/v)FBS的α-MEM中，并共培养成骨细胞。

6.2、破骨细胞的分化和共培养

从年龄72小时的雄性大鼠的胫骨和股骨骨髓中分离出原代BMM，并在补充10％(v/v)FBS，100mg/mL链霉素和100U/mL青霉素的α-MEM中培养至90％汇合。湿度为5％的CO

7、通过CCK8分析确定细胞活力

通过CCK-8分析确定23-乙酰泽泻醇C对成骨细胞和BMM增殖的影响。在96孔板中以5×10

8、TRAP染色和活性测定

TRAP活性是重要的细胞化学和生化破骨细胞标志物。分化7天后，将细胞样品在10％(v/v)甲醛中固定10分钟，在1：1乙醇-丙酮中固定1分钟。然后将细胞用TRAP溶液(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，美国)染色，并在显微镜下观察和拍照TRAP阳性细胞。为了测量TRAP活性，将细胞固定在10％(v/v)甲醛中10分钟，然后在95％(v/v)乙醇中固定1分钟。然后，将含有5mM对硝基苯基磷酸酯(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.6)和10mM酒石酸钠添加到96孔板中的细胞中，被干燥。温育1小时后，将混合物转移至含有等体积的0.1N NaOH的新板中。读取OD

9、实时定量PCR

用23-乙酰泽泻醇C处理细胞48小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并收集。根据制造商的协议，使用TRIzol试剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的Invitrogen公司)提取RNA。使用All-in-One

10、免疫印迹

胫骨在液氮中研磨，将细胞在PBS中洗涤三次，并在放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(北京碧云天)中用苯甲磺酰氟(PMSF)裂解。将细胞在冰上放置>3h，并在13,000×g和4℃下离心15分钟。沉积物中的蛋白质含量用双辛可宁酸(BCA)定量工具(中国北京碧云天)进行定量。通过SDS-PAGE分离含量相等的蛋白质，并转移至Hybond-P膜(GE Healthcare，Little Chalfont，英国)。在环境温度下，用5％(w/v)脱脂奶封闭该膜1小时，用含0.1％(w/v)Tween-20的PBS洗涤，摇动孵育过夜，并在4℃与适当的一抗孵育(1：1,000稀释)。然后洗涤膜，并用合适的二抗(0.1：1000稀释度)探测。通过增强的化学发光(ECL；Thermo FisherScientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)检测到该信号。

11、实验及结果

11.1、23-乙酰泽泻醇C对OVX引起的体重增加和器官系数的影响

在本研究中，对大鼠进行了双侧卵巢切除术，以建立绝经后骨质疏松症模型并确定23-乙酰泽泻醇C是否具有体内抗骨质疏松功效。OVX大鼠口服23-乙酰泽泻醇C剂量，共8周。图8A显示体重随年龄增加。治疗后第3周，假手术组和模型组的体重没有实质性差异；图8显示23-乙酰泽泻醇C对OVX诱导的大鼠体重增加和器官系数的影响。治疗8周后，23-乙酰泽泻醇C对(A)体重，(B)股骨湿器官系数，(C)子宫器官系数和(D)阴道器官系数的影响。数据是平均值±SD(n＝10)。与假手术组相比，*P<0.05和**P<0.01。与OVX组相比，*P<0.05和**P<0.01。

11.2、23-乙酰泽泻醇C治疗对体内胫骨小梁微结构的影响

我们使用OVX诱导的骨丢失模型来建立23-乙酰泽泻醇C对体内破骨细胞形成的抑制作用。骨矿物质密度(BMD)和骨结构形态对评估抗骨质疏松剂的疗效至关重要。在大鼠骨质疏松模型中，骨小梁和皮质骨发生形态变化，并且诸如骨量和形成的形态计量指标随着骨吸收的减少而增加。在这里，Masson的三色染色显示，用23-乙酰泽泻醇C治疗的OVX大鼠的骨小梁骨损失明显少于未治疗的OVX大鼠(图9A)。胫骨可以通过微CT图像的3D重建来识别。OVX改变了胫骨小梁的结构，而EV组，23-乙酰泽泻醇C1和23-乙酰泽泻醇C 2治疗减少了OVX引起的改变(图9B)。图9C显示，OVX组的BMD显着低于假手术组。施用23-乙酰泽泻醇C和EV的OVX大鼠的BMD明显高于OVX组。因此，23-乙酰泽泻醇C可以像EV一样有效地减少骨质流失。OVX组和假组之间的BV/TV，Tb.Th和Tb.N显着不同。因此，OVX导致明显的小梁骨丢失。相对于未经处理的OVX大鼠，23-乙酰泽泻醇C分别为1mg/kg/d和2mg/kg/d时，BV/TV和Tb.N(图9D和9F)和Tb.Th(图9E)显着增加。

图9中，用EV(0.1mg/kg/d)或23-乙酰泽泻醇C(1mg/kg/d和2mg/kg/d)处理大鼠8周。(A)术后8周每组代表性的Masson胫骨切片三色染色和小梁面积的相对差异(Tb.area％)。(B)股骨小梁的2D微型CT图像。箭头指示骨骼的变化部分。(C)通过微型CT评估的骨矿物质密度(BMD)。(D)骨体积/组织体积(BV/TV)。(E)用micro-CT Skyscan CTAn软件测量的小梁厚度(Tb.Th)和(F)小梁数(Tb.N)。数据是平均值±SD(n＝3)。与SHAM组相比，#P<0.05和##P<0.01。与OVX组相比，*P<0.05和**P<0.01。

11.3、23-乙酰泽泻醇C对OVX大鼠血液生化指标的影响

血清TRAP5b活性和β-CTX是骨吸收和破坏的指标。CTK是破骨细胞介导的骨基质重塑的重要蛋白水解酶，也是重要的骨质疏松指数。BALP和OCN是骨形成生物标志物，因为它们反映了活跃的成骨细胞。骨质疏松症后，促炎细胞因子如IL-1，TNF-α和IL-6上调，表明破骨细胞的骨吸收能力增强了。为了评估23-乙酰泽泻醇C治疗对OVX大鼠骨骼更新的影响，我们测量了血清TRAP5b，CTK，β-CTX，TNF-α，IL-6，IL-1β，E2，OCN和BALP(表2)。OVX组的TRAP5b，CTK，β-CTX，TNF-α，IL-6和IL-1β的水平高于SHAM和EV组，而23-乙酰泽泻醇C1mg/kg/d和23-乙酰泽泻醇C 2mg/kg/d显着降低组比OVX组(图10A–10F)好。OVX组的血清E2明显低于SHAM和EV组。1mg/kg/d 23-乙酰泽泻醇C和2mg/kg/d 23-乙酰泽泻醇C组的雌二醇水平明显高于OVX组(图10G)。SHAM和EV组的血清OCN和BALP明显高于OVX组。23-乙酰泽泻醇C1mg/kg/d和23-乙酰泽泻醇C 2mg/kg/d组的血清OCN和BALP低于OVX组，但差异不显著(图10H和10I)。与未治疗的OVX大鼠相比，23-乙酰泽泻醇C治疗的OVX大鼠表现出较低的血清TRAP5b，CTK，β-CTX，IL-1β，IL-6和TNF-α，以及较高的血清E2水平。但是，各组的OCN或BALP水平没有显着差异。因此，23-乙酰泽泻醇C通过抑制破骨细胞形成而不是促进体内成骨作用来减少OVX大鼠的骨质流失。

表2 23-乙酰泽泻醇C对OVX大鼠血液生化参数的影响

与SHAM组相比，#P<0.05和##P<0.01。与OVX组相比，*P<0.05和**P<0.01。

图10中，用EV(0.1mg/kg/d)或23-乙酰泽泻醇C(1mg/kg/d或2mg/kg/d)处理大鼠8周。血清TRAP5b(A)，CTK(B)，β-CTX(C)，TNF-α(D)，IL-6(E)，IL-1β(F)，E2(G)，OCN(H)和BALP(I)水平用ELISA试剂盒测量。数据是平均值±SD(n＝3)。与SHAM组相比，*P<0.05和**P<0.01。与OVX组相比，*P<0.05和**P<0.01。

11.4、23-乙酰泽泻醇C对共培养大鼠原代成骨细胞和BMMs中1α，25(OH)

在存在10-8M1α，25(OH)

图11中，(A)通过CCK-8测定法测定成骨细胞的生存力。在1a，25(OH)

11.5、23-乙酰泽泻醇C抑制RANKL诱导的BMM中的破骨细胞形成

为了阐明23-乙酰泽泻醇C对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响，我们评估了23-乙酰泽泻醇C对RANKL诱导的BMM细胞破骨细胞形成的影响。我们通过CCK-8分析评估了23-乙酰泽泻醇C对BMMs细胞的毒性，以确定是否是导致破骨细胞生成抑制的23-乙酰泽泻醇C细胞毒性(图12A)。在测试的浓度下，23-乙酰泽泻醇C不会降低破骨细胞前体细胞的活力。因此，23-乙酰泽泻醇C对破骨细胞形成的抑制作用不是由细胞毒性介导的。23-乙酰泽泻醇C干预后7天，TRAP染色用于检测是否存在RANKL的破骨细胞形成。RANKL刺激后，BMM细胞分化为成熟的破骨细胞。23-乙酰泽泻醇C以剂量依赖性方式显着减少了多核TRAP阳性破骨细胞的数量和TRAP活性(图12B-12D)。因此，23-乙酰泽泻醇C抑制了BMM细胞中RANKL诱导的多核破骨细胞的形成。

图12中，(A)通过CCK-8测定法测定BMM细胞生存力。将BMM细胞在RANKL和各种23-乙酰泽泻醇C浓度下培养7天，固定并用TRAP染色(B)。(C)TRAP阳性多核细胞。(D)TRAP活动。含有≥3个核的TRAP阳性细胞被记为破骨细胞。数据是平均值±SD(n＝3)。与未处理的对照细胞相比，#P<0.05和##P<0.01。与RANKL处理的细胞相比，*P<0.05和**P<0.01。

11.6、23-乙酰泽泻醇C通过抑制RANKL介导的JNK激活来抑制破骨细胞分化

RANKL与RANK结合会激活MAPK，NF-κB和Akt信号传导。BMM细胞用1μM，5μM或10μM的23-乙酰泽泻醇C和RANKL处理10分钟，以试图阐明23-乙酰泽泻醇C抑制破骨细胞形成的机制和途径。23-乙酰泽泻醇C处理不影响RANKL诱导的ERK，p38或Akt磷酸化。23-乙酰泽泻醇C略微但不显着上调IκB磷酸化(图13A)。但是，23-乙酰泽泻醇C处理下调了JNK的磷酸化。NFATc1和c-Fos途径在破骨细胞发育中起重要作用。NFATc1在破骨细胞分化过程中调节破骨细胞相关标记(如TRAP，CTK和MMP9)的转录。在这里，我们研究了在存在RANKL的情况下，不同浓度的23-乙酰泽泻醇C对破骨细胞生成相关标记蛋白表达的影响。23-乙酰泽泻醇C在破骨细胞形成过程中显着抑制NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白表达(图13B)。23-乙酰泽泻醇C抑制RANKL刺激的活性(去磷酸化)NFATc1。RANKL诱导NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK，而23-乙酰泽泻醇C抑制它们。体内试验表明，23-乙酰泽泻醇C下调了OXV大鼠胫骨中的p-JNK和RANKL(图13C)。这些发现表明23-乙酰泽泻醇C通过下调JNK磷酸化抑制破骨细胞形成。

图13中，BMM由M-CSF处理过的骨髓培养物制备。(A)BMM用23-乙酰泽泻醇C和RANKL处理10分钟，并评估JNK，ERK，p38和Akt的磷酸化和IkB降解。剥离免疫印迹并重新检测总JNK，ERK，p38和Akt。(B)23-乙酰泽泻醇C对破骨细胞生成过程中NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白表达的影响。将细胞单独孵育或在23-乙酰泽泻醇C存在下孵育，并用100ng/mLRANKL诱导48小时。(C)通过蛋白质印迹评估大鼠胫骨中的JNK，p-JNK和RANKL蛋白表达水平。数据是平均值±SD(n＝3)。与未处理的对照细胞相比，#P<0.05和##P<0.01。与RANKL处理的细胞相比，*P<0.05和**P<0.01。

综上，破骨细胞和成骨细胞之间以及骨形成和吸收之间的平衡失调导致骨质疏松症，其中破骨细胞增多是骨质疏松症发生发展的重要因素。绝经后骨质疏松症是由破骨细胞逐渐过度吸收骨质所致，可能归因于内源性雌激素缺乏。抑制破骨细胞形成和功能的药物可能在骨质疏松症的治疗中重大价值。绝经后妇女表现为体重增加，子宫和阴道萎缩以及骨流失。绝经后骨质疏松是一种慢性炎性疾病。绝经后骨质疏松症的许多女性表现出升高的促炎细胞因子水平，对骨转换和质量产生负面影响。骨质疏松症可以通过各种抗吸收和合成代谢疗法(例如阿仑膦酸钠)预防。但是，长期使用这些抗骨质疏松剂会带来诸多副作用。最近的研究报道某些天然药物可能有效治疗骨质疏松症，中药泽泻具有抗炎，降血糖，降血脂的功效。其中23-乙酰泽泻醇C具有抗炎作用，可改善某些代谢性疾病。在我们的初步筛选实验中发现23-乙酰泽泻醇C在体外强烈抑制破骨细胞生成。

因此，本研究中，我们评估了23-乙酰泽泻醇C对OVX大鼠绝经后骨质疏松的药理作用。我们还检测了23-乙酰泽泻醇C对BMM中破骨细胞分化的影响。23-乙酰泽泻醇C在OVX大鼠中显示出潜在的抗骨质疏松活性：23-乙酰泽泻醇C缓解子宫和阴道萎缩以及股骨长度变化，并减轻OVX引起的骨质流失；23-乙酰泽泻醇C将OVX大鼠的血清TRAP5b，CTK，β-CTX，TNF-α，IL-6，IL-1β和E2调节后，趋向于正常组。另外，TRAP5b，CTK和β-CTX是骨吸收的重要指标，而OCN和BALP是骨形成指数(成骨调节)。本研究表明，23-乙酰泽泻醇C处理可显着抑制OVX大鼠的血清TRAP5b，CTK和β-CTX活性，但不能调节血清OCN和BALP(提示23-乙酰泽泻醇C可能不作用于成骨细胞)。23-乙酰泽泻醇C调节卵巢切除术诱导的TNF-α，IL-6和IL-1β的升高。Western blot分析显示，23-乙酰泽泻醇C下调了OVX大鼠胫骨的JNK磷酸化和RANKL。由于这些原因，我们推测23-乙酰泽泻醇C对成骨的作用没有显著影响，可能是通过抑制破骨细胞的产生和功能而发挥抗骨质疏松作用。

为了确认23-乙酰泽泻醇C是否直接影响破骨细胞前体而发挥抗骨质疏松作用，我们建立了由23-乙酰泽泻醇C处理的成骨细胞组成的细胞共培养系统。我们通过测量成骨细胞中的RANKL表达来评估23-乙酰泽泻醇C的抗骨质疏松作用。结果23-乙酰泽泻醇C对成骨细胞中的RANKL，OPG和M-CSF mRNA或蛋白质表达没有影响。而破骨细胞的分化和成熟受成骨细胞的RANKL和M-CSF的控制。相反，我们发现23-乙酰泽泻醇C在BMM中抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。因此，23-乙酰泽泻醇C可通过直接作用于破骨细胞前体而非通过间接调控成骨细胞而抑制破骨细胞生成。RANKL结合其RANK受体，并在破骨细胞前体细胞中顺序募集肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)。反过来，TRAF6激活下游的NF-κB，JNK和MAPK信号通路。23-乙酰泽泻醇C显着抑制JNK磷酸化，结合RANK后，RANKL募集TRAF6衔接子蛋白并上调NFATc1。后者是破骨细胞形成过程中的重要转录因子，可调节破骨细胞特异性基因的表达。而NFATc1诱导破骨细胞相关基因的编码TRAP，CTK和MMP9的转录。转录因子c-Fos在破骨细胞形成中起重要作用。23-乙酰泽泻醇C抑制RANKL诱导的NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白上调，下调NFATc1，c-Fos，MMP9，TRAP和CTK蛋白。这些结果表明23-乙酰泽泻醇C通过抑制RANKL介导的JNK激活来直接抑制破骨细胞生成。

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