泽泻醇B 23-乙酸酯的肝保护作用及其药理学机制

摘要

目的:研究泽泻醇B23-乙酸酯(alisol B23-acetate，AB23A)的肝保护作用及其分子药理学机制。
　　方法:(1)泽泻醇B23-乙酸酯通过激活法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)促进小鼠部分肝切除后的肝再生作用。灌胃给予小鼠AB23A(12，5，25和50mg/kg)每日1次，连续7天。在第4、5、6、7天，行70％肝部分切除术或假手术。以肝脏比重、肝细胞增殖比率及有丝分裂指数评价AB23A促肝再生作用;测定细胞周期蛋白Cyclin D1，Cyclin B1及其上游叉头转录因子M1b(forkhead box M1b，FoxM1b)的基因和蛋白表达，揭示AB23A促肝细胞增殖作用机制;以血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及肝内胆汁酸水平评价AB23A肝保护作用;测定胆汁酸合成限速酶Cyp7a1和胆汁酸外排转运体Bsep表达变化，揭示AB23A降低肝内胆汁酸水平的作用机制;采用FXR拮抗剂木苦甾酮(guggulsterone，GS)阻断FXR信号通路，评价AB23A的体内促肝再生及肝保护作用是否与激活FXR有关;体外实验采用小鼠原代肝细胞培养，测定AB23A对FXR靶基因的诱导作用，并采用基因沉默实验测定FXR基因沉默对AB23A诱导FXR靶基因作用的影响;采用双荧光素酶报告基因实验评价AB23A对FXR的激活作用，以分子对接实验模拟AB23A与FXR的结合作用。
　　(2)泽泻醇B23-乙酸酯通过调控FXR介导的胆汁酸转运体和合成酶对ANIT所致小鼠肝损伤及胆汁淤积的保护作用。灌胃给予小鼠AB23A(10，20和40 mg/kg)每日1次，连续7天。在第5、6天给药4小时后，灌胃给予ANIT(75 mg/kg)。以血清ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)，γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP），总胆红素，总胆汁酸、肝内总胆汁酸、胆汁中总胆汁酸水平及肝组织病理学评价AB23A对ANIT所致肝损伤及胆汁淤积的保护作用;测定胆汁酸摄取转运体Ntcp、Oatp1b2及外排转运体Bsep、Mrp2、Mdr2、Mrp3、Mrp4表达，揭示AB23A对肝内胆汁酸转运的作用机制;测定胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1及胆汁酸结合酶Bal、Baat表达，揭示AB23A对胆汁酸合成及结合的作用机制;测定胆汁酸代谢酶Cyp3a11、Cyp2b10、Sult2a1及Ugt1a1表达，揭示AB23A对胆汁酸代谢的作用机制;采用FXR拮抗剂GS阻断FXR信号通路，评价AB23A降低肝内胆汁酸及肝保护作用是否与激活FXR有关;双荧光素酶报告基因实验体外评价AB23A对FXR的激活作用。
　　(3)泽泻醇B23-乙酸酯通过激活FXR和STAT3对四氯化碳所致小鼠肝毒性的保护作用。以FXR激动剂CDCA为阳性对照药，灌胃给予小鼠AB23A(10，20和40 mg/kg)每日1次，连续7天。在第5、6天给药4小时后，腹腔注射给予CCl4(750μL/kg)。以血清ALT、AST、总胆汁酸、肝组织病理学及TUNEL细胞凋亡分析，评价AB23A对CCl4所致小鼠肝毒性的保护作用;以BrdU染色阳性肝细胞数及有丝分裂指数评价AB23A对肝细胞增殖的影响;测定FoxM1b、Cyclin D1及CyclinB1表达，揭示AB23A促肝细胞增殖的作用机制;测定胆汁酸转运体Ntcp、Bsep、Mrp2及胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1表达，揭示AB23A降低肝内胆汁酸水平的作用机制;测定p-STAT3及STAT3靶基因Bcl-xl、SOCS3表达，揭示AB23A减少凋亡肝细胞的作用机制。
　　(4)泽泻醇B23-乙酸酯作用于FXR介导的转运体和酶对雌激素诱导小鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用。以FXR激动剂CDCA为阳性对照药，灌胃给予小鼠AB23A(7.5，15和30 mg/kg)每日1次，连续7天。在第3天给药4小时后，皮下注射给予10 mg/kg的17α-炔雌醇(EE)，每日1次，至第7天。以血清ALP、总胆汁酸、胆汁流、胆汁中胆汁酸水平及肝组织病理学评价AB23A对EE诱导胆汁淤积性肝损伤的保护作用;测定肝内胆汁酸外排转运体Bsep、Mrp2及摄取转运体Ntcp表达，揭示AB23A对胆汁酸转运的作用机制;测定胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1及上游转录因子Shp、Fgf15表达，揭示AB23A对胆汁酸合成的作用机制;测定胆汁酸代谢酶Cyp3a11、Cyp2b10、Sult2a1及Ugtla1表达，揭示AB23A对胆汁酸代谢的作用机制;采用FXR拮抗剂GS阻断FXR信号通路，评价AB23A肝保护作用是否与激活FXR有关。
　　结果:(1)在小鼠部分肝切除实验中，AB23A通过上调肝细胞增殖相关蛋白FoxM1b，Cyclin D1和Cyclin B1表达，剂量依赖性地促进了小鼠肝细胞增殖;AB23A通过抑制胆汁酸合成限速酶Cyp7a1，诱导胆汁酸外排转运体Bsep表达，降低了肝内胆汁酸水平、发挥出肝保护作用;AB23A对上述基因表达的影响、促肝再生及肝保护作用被FXR拮抗剂GS所阻断;体外实验表明AB23A对FXR靶基因的调控作用被FXR基因沉默所逆转;双荧光素酶报告基因实验和分子对接实验进一步证实了AB23A对FXR的激活作用。
　　(2)在抗ANIT所致小鼠肝损伤及胆汁淤积实验中，AB23A通过下调胆汁酸摄取转运体Ntcp，上调外排转运体Bsep、Mrp2及Mdr2表达，减少了肝脏对胆汁酸的摄取，增加了肝脏对胆汁酸的外排;通过抑制胆汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的表达，降低了肝内胆汁酸的合成，通过增加胆汁酸结合酶Bal和Baat的表达，增加了肝内胆汁酸的结合;通过诱导Ⅱ相代谢酶Sult2a1的表达，增加了肝内胆汁酸的代谢。进一步通过体内和体外实验方法证实AB23A对ANIT所致肝损伤和肝内胆汁淤积的肝保护作用是由于FXR介导的上述基因表达的调控。
　　(3)在抗CCl4所致肝毒性实验中，AB23A通过调节参与肝细胞DNA复制及有丝分裂的重要基因FoxM1b、Cyclin D1及Cyclin B1的表达，促进了肝细胞的增殖;通过下调肝内胆汁酸摄取转运体Ntcp和合成酶Cyp7a1、Cyp8b1的表达，上调胆汁酸外排转运体Bsep、Mrp2的表达，降低了肝内胆汁酸水平;此两方面的作用与AB23A激活核受体FXR直接相关;通过诱导p-STAT3及STAT3靶基因Bcl-xl、SOCS3表达，减少了肝细胞的凋亡。
　　(4)在雌激素诱导胆汁淤积性肝损伤实验中，AB23A通过上调外排转运体Bsep和Mrp2，下调肝脏胆汁酸摄取转运体Ntcp的表达，增加了肝脏对胆汁酸的外排，减少了肝脏对胆汁酸的摄取;通过抑制胆汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的表达，降低了肝内胆汁酸的合成;通过诱导Ⅱ相代谢酶Sult2a1的表达，增加了肝内胆汁酸的代谢。并进一步证实了AB23A对EE所致胆汁淤积性肝损伤的肝保护作用是由于FXR介导的上述基因表达的调控。
　　结论:AB23A通过激活FXR，促进了小鼠部分肝切除后的肝再生;通过调控FXR介导的胆汁酸转运体和合成酶对ANIT所致肝损伤及胆汁淤积具有保护作用;通过激活FXR和STAT3对四氯化碳所致肝小鼠肝毒性发挥保护作用;通过作用于FXR介导的转运体和酶对雌激素诱导胆汁淤积性肝损伤起到保护作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 泽泻醇B 23-乙酸酯通过激活法尼醇X受体促进小鼠部分肝切除后的肝再生作用

引言

材料与方法

1．材料

2．实验方法

结果

1．AB23A促进小鼠部分肝切除后的肝再生作用

2．AB23A增加了细胞周期蛋白及FoxM1b的表达

3．AB23A降低了ALT，AST活性，减轻了肝切除术导致的肝病理损伤

4．AB23A降低了肝中胆汁酸水平

5．AB23A通过激活核受体FXR从而促进小鼠肝再生

6．AB23A诱导了小鼠原代培养肝细胞中FXR靶基因的表达

7．AB23A通过激活FXR而调控FXR靶基因BSEP的转录激活

8．AB23A可与FXR配体结合域形成稳定的复合物

9．AB23A不影响IL-6，HGF，Cyp3a11和Mdr1a的表达

讨论

结论

第二部分 泽泻醇B 23-乙酸酯通过调控法尼醇X受体介导的胆汁酸转运体和合成酶对ANIT所致小鼠肝损伤及胆汁淤积的保护作用

引言

材料与方法

1．材料

2．实验方法

结果

1．AB23A对ANIT所致肝损伤和胆汁淤积的保护作用

2．AB23A调控参与胆汁酸转运的转运体基因及蛋白表达

3．AB23A减少了胆汁酸合成酶，增加了胆汁酸结合酶的表达

4．AB23A增加了胆汁酸代谢酶的基因表达

5．AB23A通过激活FXR调节了参与对ANIT所致肝损伤的肝保护作用的基因表达

6．AB23A通过激活HepG2细胞的FXR调控了SHP的转录激活

讨论

结论

第三部分 泽泻醇B 23-乙酸酯通过激活FXR和STAT3对四氯化碳所致小鼠肝毒性的保护作用

引言

材料与方法

1．材料

2．实验方法

结果

1．AB23A对血清中肝功能酶和总胆汁酸的影响

2．AB23A对肝脏病理变化及肝细胞凋亡的影响

3．AB23A促进了小鼠CCl4损伤后肝细胞的增殖

4．AB23A上调了小鼠FoxM1b及细胞周期蛋白的基因和蛋白表达

5．AB23A通过调节胆汁酸转运体与合成酶的表达，降低了肝内胆汁酸水平

6．AB23A对CCl4损伤后STAT3磷酸化的作用

讨论

结论

第四部分 泽泻醇B 23-乙酸酯作用于FXR介导的转运体和酶对雌激素诱导小鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用

引言

材料与方法

1．材料

2．实验方法

结果

1．AB23A对EE诱导的肝毒性和胆汁淤积的保护作用

2．AB23A改变了胆汁酸转运体基因和蛋白表达

3．AB23A降低了胆汁酸合成酶的表达

4．AB23A增加了胆汁酸代谢酶的表达

5．AB23A对参与胆汁酸体内平衡基因的表达被FXR拮抗剂GS所阻断

讨论

结论

参考文献

综述 核受体FXR在肝再生中的作用

英文综述 Pharmacokinetic Interactions Between Herbal Medicines and Prescribed Drugs：Focus on Drug Metabolic Enzymes and Transporters

附录

攻读学位期间发表论文情况

主持及参与基金情况

参加学会及获奖情况

致谢