泽泻醇B乙酸酯抗乙肝作用及机理研究

摘要

由乙型肝炎病毒引起的肝炎是一种严重危害人体健康的病毒性传染病。据世界卫生组织报道，全球有超过20亿人为乙型肝炎病毒携带者，其中约3亿人为慢性终身感染者。而我国的乙肝患者就约占了一半,直到2008年我国乙肝表面抗原携带者约有9300万人。于此同时每年仍约有200万新发肝炎病人，其中乙型肝炎占20%。与非乙肝病毒携带者相比，慢性肝炎感染患者面临较高的肝硬化或癌变的风险。目前在尚未找到能彻底根治乙肝的方法同时，由于近年HBV免疫疫苗、各种抗病毒药物的应用而导致HBV变异株的出现，使HBeAg阴性慢性乙型病毒性肝炎患者（CHBV）增多。而在最新的科学研究中，研究人员发现在感染病毒的肝细胞核内存在的病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,是病毒持续感染久治不愈的重要原因。因此科学研究者在研制不同类型的临床治疗药物的项目上着重研究药物对乙肝病毒cccDNA的影响，希望能够找到直接可以清除病毒cccDNA的药物，让乙肝病人痊愈成为现实。
　　HBV复制大约分别四个阶段：(1)乙肝病毒颗粒首先与细胞膜上的受体羧肽酶D结合，脱去外膜进入细胞内；(2)在经衣壳蛋白的磷酸化作用后脱去衣壳，乙肝病毒进入细胞内，并在细胞内转变成超螺旋DNA结构(cccDNA)。超螺旋DNA是HBV的转录模板，它可转录mRNA，也是造成乙肝病毒无法清除的重要原因之一；(3)在mRNA指导作用下病毒先合成前基因RNA，并在细胞核外被衣壳包裹，然后再以前基因RNA为模板，在细胞核外经逆转录合成乙肝病毒DNA负链，随后合成乙肝病毒正链；(4)衣壳中的乙肝病毒由膜包裹后分泌到细胞外以完整的病毒颗粒进入到其它细胞，也可重新脱去衣壳进入细胞核内，以维持细胞核内病毒超螺旋DNA(cccDNA)的数量。因此每个病毒复制的步骤都是研究抗乙肝病毒的关键，只要阻断病毒的复制过程就可以有效地抑制病毒的增殖。
　　经过大量的研究，乙肝病毒对肝细胞并无直接致病性。相反由乙肝病毒所引发的肝细胞损害的机制主要是由细胞免疫反应所引起的。在HBV感染过程中，先由单核巨噬细胞摄取病毒抗原并加工，然后提呈给Th细胞。然后在单核巨噬细胞释放的白细胞介素1(IL-1)协助下，促使Th细胞活化增殖而释放白细胞介素2(IL-2)。IL-2刺激已被HBV抗原致敏的Tc细胞发生克隆性增殖，形成大量效应性T细胞，攻击受HBV感染的肝细胞，最后导致肝细胞变性坏死。目前认为， Tc细胞攻击靶细胞需依赖所谓“双识别”，即只有表达靶抗原和I类MHC抗原的肝细胞，才可能被Tc细胞识别、攻击和破坏。而肝细胞凋亡、 HBV感染等多种因素所致的肝细胞损害，其最终表现也是肝细胞死亡。
　　本实验以乙肝病毒感染机制、慢性乙肝与cccDNA关系的研究为基础，研究实验药物泽泻醇B乙酸酯对乙肝病毒HBV的抑制作用及其作用机制。泽泻为泽泻科植物泽泻的块茎,性味甘、淡、寒,归肾、膀胱经,是利水渗湿用药，主要用于小便不利、水肿胀满、泄泻、尿少、痰饮、眩晕、热淋涩痛等症。泽泻的化学成分比较复杂，而泽泻醇B乙酸酯属于三萜类化合物。在有关泽泻醇B乙酸酯的研究中，学者们发现泽泻醇B乙酸酯具有多种生物活性：（1）诱导多种肿瘤细胞凋亡；（2）逆转P糖蛋白过表达癌细胞的多药耐药性，提高细胞对抗肿瘤药物的敏感性；（3）抑制抗体过敏性反应；（4）抑制细胞中氮氧化物(NO)的合成反应；（5）抑制乙肝病毒抗原活性,等等。因此泽泻醇B乙酸酯在抗病毒方面具有很大的潜力。
　　在本实验过程中，通过体外、体内实验平行检测泽泻醇B对病毒DNA的影响、对病毒cccDNA的影响从而探索泽泻醇B乙酸酯抗乙肝病毒的机制。在实验中，泽泻醇B乙酸酯在2.215细胞和鸭胚肝细胞上的对病毒的抑制作用并不一致。在2.215细胞上，泽泻醇B乙酸酯的TC50为23.71mmol/L，而在鸭胚肝细胞上的TC50为25.62mmol/L。泽泻醇B乙酸酯在HepG2.215细胞上对病毒两抗分泌的治疗指数分别为1.15、0.74，提示在HepG2.215上泽泻醇B乙酸酯对乙型肝炎病毒表面抗原分泌的抑制作用是在对细胞的毒性作用基础上发挥的，而对病毒的e抗原则无抑制作用。在先天DHBV感染鸭胚原代肝细胞上，泽泻醇B乙酸酯对病毒DNA的治疗指数可达到4.08，则显示出较好的抗病毒作用。在体内实验中，泽泻醇B乙酸酯对病毒的DNA和肝组织中的cccDNA也有一定的抑制作用。通过本实验的初步结果间接提示了泽泻醇B乙酸酯需要经过体内代谢的活化作用才能发挥药物的抗病毒作用。

目录

声明

引言

第一部分：文献研究

一：乙型肝炎的研究进展

1、乙肝的病原学

2、乙肝的流行病学

3、乙肝的发病机制

4、慢性乙肝与病毒cccDNA的关系

二、抗乙肝病毒模型的研究进展

1、体外模型研究进展

2、体内模型研究进展

三、国内外抗乙肝病毒药物和泽泻醇B乙酸酯的研究现状和发展趋势

1、国内外抗乙肝病毒药物的研究现状和发展趋势

2、国内外泽泻醇B乙酸酯的研究现状和发展趋势

第二部分：实验研究

一、泽泻醇B乙酸酯体外抗乙肝病毒研究

（一）、泽泻醇B乙酸酯在HepG2.215细胞上抗乙肝病毒研究

（二）、泽泻醇B乙酸酯在先天DHBV感染鸭胚原代肝细胞上抗乙肝病毒实验

（一）、泽泻醇B乙酸酯在DHBV先天感染雏鸭上抗DHBV DNA实验

（二）、泽泻醇B乙酸酯对先天DHBV感染雏鸭肝脏中病毒cccDNA的影响

三、实验讨论

结语

参考文献

附录

致谢