一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构

摘要

本发明公开了一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构，涉及微流控技术领域，包括依次叠加的上层、中层和下层，上层和下层均设置有压力系统，中层设置有浓度梯度生成器和若干细胞培养单元，浓度梯度生成器与细胞培养单元连通，压力系统与细胞培养单元对应。本发明集物理微环境和化学微环境为一体，通过本发明能够利用少量细胞对软骨细胞体外扩增环境进行高通量筛选，优化选择最佳适合软骨细胞增殖且维持表型的因子浓度及压应力刺激强度，证实了微流控芯片技术在软骨组织工程应用的可行性，模拟体内力学刺激的微环境，为体外快速扩增软骨细胞提供方案，从而提高种子细胞质量，改善自体软骨细胞移植治疗效果。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，特别是涉及一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构。

背景技术

关节软骨无血供、淋巴回流和神经支配，具有极弱的自我修复能力。在体内生理条件下，关节软骨主要受到压应力、间隙液体流动等物理微环境刺激及关节液润滑渗透营养物质等化学微环境刺激。因此，外部的微环境信号刺激对于关节软骨细胞的代谢及维持软骨基质的内环境稳定具有重要作用。对于健康的关节软骨，大约70-80％的组成成分为水，软骨细胞的代谢和营养传递主要通过关节软骨动态压缩而产生的间隙性液体流动刺激来调控。关节软骨在形态上可以分为两部分：一部分是固态物质(固相)，包括软骨细胞、胶原蛋白(Ⅱ型胶原为主)、蛋白多糖(GAGs)和其他少量糖蛋白；另一部分为液态物质(液相)，包括水和离子。关节软骨的微观形态是具有一定垂直纵向排列的取向结构。软骨细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白多糖和水组成，对维持软骨功能具有重要作用。关节软骨的生物学微环境(关节软骨固相/液相的双相理论及与之相应的生物力学)为：当关节软骨受力时，压应力进行传导，ECM(细胞外基质)受到挤压，水在ECM中流动。此时，在固相中，由于压应力的传导作用，ECM作用于软骨细胞，产生力学刺激信号，软骨细胞对于压力-形变是非常敏感的，作用在ECM上的力学变化导致细胞膜应力的变化，软骨细胞获得力学刺激信息，出现代谢活性的变化；在液相中，水由于压力梯度或者ECM的挤压在多孔-渗透性的固体ECM中流动，产生间隙流，刺激并营养软骨细胞的代谢。同时，由于水的流动，运输生化营养物质，产生新陈代谢，润滑关节。

微流控技术的快速发展为化学、生物学、临床医学、生物工程等领域的发展做出了重要贡献。微流控芯片因其具有同细胞大小匹配的微米尺寸构件、同生理环境接近的封闭环境、传质传热快和通量高等特点，已成为细胞生物学研究的理想平台，也为构建细胞自组装体系和功能化研究提供了一种全新的平台和技术。基于微流控系统对于细胞微环境的相关研究已经成为当前研究的热点，当前对于细胞微环境的研究主要涉及生物化学刺激、力学信号刺激、基质表面形态刺激、细胞与细胞间的相互作用、电场刺激、磁场和温度等刺激作用。其中，基于微流控芯片技术对于软骨细胞微环境的研究主要集中于生物化学刺激和力学信号刺激两方面。

生物化学刺激主要包括外部的生长因子或其他大分子物质等。现有技术公开了一种集成的浓度梯度可控的微流控芯片平台，初步探讨了在IGF-1和bFGF生长因子单独和联合作用于三维基质培养的兔软骨细胞增殖的最佳浓度，证实了微流控芯片装置可以作为一种有效的软骨组织工程研究的微平台。然而，该装置局限于生长因子作用的微环境，不能更好地模拟体内复杂的软骨动态微环境。

生理条件下软骨细胞所受到的机械性信号刺激主要包括间歇性的动态压应力和间隙性液体流动刺激。应用微流控芯片技术可以较容易地构建处软骨细胞外的各种机械微环境。现有技术中，运用可变的微加工装置构建出一种基于微操控技术来实现多条件的压应力微环境，该微装置可以对软骨细胞及干细胞成软骨分化提供良好的压力微环境。而该装置使用的是单纯的单项压力微环境，细胞混合水凝胶(聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA))材料，不能更好地模拟软骨细胞外基质材料因动态压缩所产生的的间隙性液体流动以及软骨细胞生长的基质材料及结构微环境。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构，以解决上述现有技术存在的问题，集不同浓度细胞因子刺激、仿生支架成分、形态结构及不同强度机械力刺激为一体。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构，包括依次叠加的上层、中层和下层，所述上层和所述下层均设置有压力系统，所述中层设置有浓度梯度生成器和若干细胞培养单元，所述浓度梯度生成器与所述细胞培养单元连通，所述压力系统与所述细胞培养单元对应。

优选的，所述浓度梯度生成器包括至少两个第一注入口，两个所述第一注入口均通过第一管路与第一支管连通，所述第一支管与N个并行设置的第二管路的一端连通，各所述第二管路的另一端与第二支管连通，所述第二支管与大于N个并行设置的第三管路的一端连通，各所述第三管路的另一端分别与一所述细胞培养单元连通。

优选的，所述第二管路和所述第三管路均为S形弯折管路。

优选的，各所述细胞培养单元均包括两个并行设置的流出通道和若干细胞培养室，若干所述细胞培养室均与两所述流出通道连通，各所述细胞培养室设置有第二注入口，各所述第三管路的另一端分别与两所述流出通道的一端连通，各所述流出通道的另一端设置有废液出口。

优选的，各所述细胞培养室内均设置有若干阻隔柱，若干所述阻隔柱围成培养细胞的培养空间。

优选的，所述上层和所述下层的结构相同，所述压力系统包括依次连通的进气口、若干压力单元组和出气口，各所述压力单元组均包括若干压力室，所述压力单元组的个数与各所述细胞培养单元中的所述细胞培养室的个数相同，各所述压力单元组中的所述压力室的个数与所述细胞培养单元的个数相同。

优选的，同一所述压力单元组中的所述压力室的尺寸相同，相邻所述压力单元组中的所述压力室的尺寸不同。

优选的，所述上层的外侧和所述下层的外侧均设置有一层玻璃基片。

优选的，所述上层、所述中层和所述下层依次通过不可逆封接进行连接。

本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

本发明基于微流控芯片技术，通过浓度梯度生成器得到不同浓度的培养基，将待培养细胞放入细胞培养单元中，浓度梯度生成器与细胞培养单元连通，得到不同浓度的细胞，实现生物化学刺激，上层和下层的压力系统对细胞培养单元进行压力控制，实现不同强度力学信号刺激，同时细胞培养单元内的细胞培养支架选用脱软骨细胞基质这一仿生支架材料。本发明集物理微环境和化学微环境为一体，通过本发明能够利用少量细胞对软骨细胞外扩增环境进行高通量筛选，优化选择最佳适合软骨细胞增殖且维持表型的因子浓度及压应力刺激强度，证实了微流控芯片技术在软骨组织工程应用的可行性，模拟体内力学刺激的微环境，为体外快速扩增软骨细胞提供方案，从而提高种子细胞质量，改善自体软骨细胞移植治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构示意图；

图2为本发明中的上层示意图；

图3为本发明中的中层示意图；

图4为本发明中的下层示意图；

图5为本发明中的细胞培养室示意图；

图6为本发明的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构截面示意图(压力室较大且未受压)；

图7为本发明的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构截面示意图(压力室较大且受压)；

图8为本发明的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构截面示意图(压力室较小且未受压)；

图9为本发明的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构截面示意图(压力室较小且受压)；

其中：100-基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构，1-上层，2-中层，3-下层，4-压力系统，5-浓度梯度生成器，6-细胞培养单元，7-第一注入口，8-第一管路，9-第一支管，10-第二管路，11-第二支管，12-第三管路，13-流出通道，14-细胞培养室，15-第二注入口，16-废液出口，17-阻隔柱，18-进气口，19-压力单元组，20-出气口，21-压力室，22-玻璃基片，23-藻酸盐凝胶，24-软骨细胞，25-不可逆封接处。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构，以解决上述现有技术存在的问题，集不同浓度细胞因子刺激、仿生支架成分、形态结构及不同强度机械力刺激为一体。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

如图1-图9所示，本实施例提供了一种基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构100，采用PDMS软刻蚀技术制成，包括依次叠加的上层1、中层2和下层3，上层1、中层2和下层3均由PDMS膜制成，上层1、中层2和下层3依次通过不可逆封接进行连接。上层1和下层3均设置有压力系统4，中层2设置有浓度梯度生成器5和若干细胞培养单元6，浓度梯度生成器5与细胞培养单元6连通，压力系统4与细胞培养单元6对应。本实施例基于微流控芯片技术，通过浓度梯度生成器5得到不同浓度的培养基，将待培养细胞放入细胞培养单元6中，浓度梯度生成器5与细胞培养单元6连通，得到不同浓度的细胞，实现生物化学刺激，上层1和下层3的压力系统4对细胞培养单元6进行压力控制，实现力学信号刺激，本实施例集物理微环境和化学微环境为一体，通过本实施例能够利用少量细胞对软骨细胞24外扩增环境进行高通量筛选，优化选择最佳适合软骨细胞24增殖且维持表型的因子浓度及压应力刺激强度，证实了微流控芯片技术在软骨组织工程应用的可行性，模拟体内力学刺激的微环境，为体外快速扩增软骨细胞24提供方案，从而提高种子细胞质量，改善自体软骨细胞24移植治疗效果。

具体地，本实施例中，上层1的外侧和下层3的外侧均设置有一层玻璃基片22。

本实施例中，浓度梯度生成器5包括至少两个第一注入口7，两个第一注入口7均通过第一管路8与第一支管9连通，第一支管9与N个并行设置的第二管路10的一端连通，N≥2，本实施例的第二管路10为三个，各第二管路10的另一端与第二支管11连通，第二支管11与大于N个并行设置的第三管路12的一端连通，本实施例的第三管路12为四个，各第三管路12的另一端分别与一细胞培养单元6连通。本实施例中，第二管路10和第三管路12均为S形弯折管路。当细胞因子流体和其他流体以相同速度分别从两个第一注入口7进入浓度梯度生成器5后，它们在节点处保持层流状态，通过S形弯折管路时，层流的细胞因子流体和其他流体通过流体剪切力混合，两种流体在浓度梯度生成器5中不断分配、混合，生成基于多项层流的浓度梯度，即经过浓度梯度生成器5进入到细胞培养单元6的流体(培养基)具有不同的浓度。

本实施例中，各细胞培养单元6均包括两个并行设置的流出通道13和若干细胞培养室14，本实施例的细胞培养单元6为四个，每个细胞培养单元6包括三个细胞培养室14，流出通道13的截面尺寸为400μm×200μm，细胞培养室14的高度为200μm，直径为4mm，若干细胞培养室14并联，若干细胞培养室14均与两流出通道13连通，各细胞培养室14设置有第二注入口15，第二注入口15用于种子细胞或细胞/支架材料混合体的接种，各第三管路12的另一端分别与两流出通道13的一端连通，各流出通道13的另一端设置有废液出口16。各细胞培养室14内均设置有若干阻隔柱17，阻隔柱17的尺寸为40μm×40μm×40μm，阻隔柱17用于固定细胞支架复合物，若干阻隔柱17围成培养细胞的培养空间。细胞培养室14两侧的流出通道13内的培养基通过渗透作用进入细胞培养室14营养细胞，同时细胞代谢产物通过扩散作用进入两侧流出通道13被排除。由于两侧流出通道13内的因子浓度或应力强度相同，当它们进入细胞培养室14达到饱和后，细胞培养室14内因子浓度与两侧流出通道13内浓度或强度相同。

本实施例中，上层1和下层3的结构相同，压力系统4包括依次连通的进气口18、若干压力单元组19和出气口20，各压力单元组19均包括若干压力室21，本实施例的压力单元组19为三个，每个压力单元组19包括四个压力室21，各压力室21通过气路通道连接，气路通道的截面尺寸为400μm×150μm，压力单元组19的个数与各细胞培养单元6中的细胞培养室14的个数相同，各压力单元组19中的压力室21的个数与细胞培养单元6的个数相同。

本实施例中，同一压力单元组19中的压力室21的尺寸相同，相邻压力单元组19中的压力室21的尺寸不同。如图2和图4所示，压力单元组19自上而下设置三个，压力室21的尺寸自上而下依次为4mm、2mm和1mm。

本实施例中，上层1和下层3中的压力系统4均设置有电磁阀，控制系统控制电磁阀的开闭及开度，通过控制系统，上层1和下层3中的压力系统4同时使上层1和下层3产生形变，并通过改变压力室21处PDMS膜的面积从而调节进气量的大小，进而产生不同的形变程度，如图6和图8所示，从而实现对细胞培养室14内软骨细胞24支架复合物不同强度、频率为0.1Hz的压应力刺激。

上层1、中层2和下层3进行不可逆封接前，将取向脱细胞软骨基质支架放入细胞培养室14中阻隔柱17围成的培养细胞的培养空间，然后于等离子体中进行不可逆封接，制备后的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构100加水高压灭菌，再置于无菌工作台内晾干，通过第二注入口15加入软骨细胞24。经过细胞因子培养液灌注培养、不同强度压应力刺激，进而表征细胞的生长和表型情况。本实施例中，同一细胞培养单元6中的细胞培养室14中培养基浓度相同，但受到的压力刺激不同；同一压力单元组19中的压力室21对应的细胞培养室14中培养基浓度不同，但受到的压力刺激相同，采用本实施例可得到12个不同组别的数据。

本实施例通过控制系统控制上层1和下层3中的压力系统4，从而推动PDMS薄膜，对细胞培养室14内的细胞支架材料混合物产生周期性的强度梯度变化的压应力刺激，经过力学传导引起取向脱软骨细胞支架形变，对软骨细胞24产生压应力刺激信号(仿生固相压应力)，影响其代谢；同时，压应力推动液体流动产生间隙流液体流动刺激(仿生液相压应力)，对支架上的软骨细胞24产生液相力学刺激信号。同时结合不同浓度的生长因子(培养基)刺激，通过蛋白多糖及Ⅱ型/Ⅰ型胶原蛋白定量检测，来筛选最佳的力学刺激强度及生长因子浓度，从而促进软骨细胞24快速大量增殖及表型维持。本实施例利用微流控芯片的高度集成与精确的操控特点，制备成集不同浓度生长因子刺激、仿生支架成分、形态结构及不同强度机械力刺激为一体的仿生体内关节软骨微环境的结构。软骨细胞24的扩增微环境符合关节软骨的双相理论(固相/液相)及与之相应的生物力学特点，从而使这种集成化的生物功能体可以高度仿生人体内关节软骨的微环境，同时模仿了体内关节软骨的物理及化学微环境刺激。

本实施例基于微流控芯片技术(Microfluidic Technology)，构建了一种将三维培养、因子干预和模拟生物力学刺激高度集成化的仿生体内关节软骨微环境的结构，利用少量细胞对软骨细胞24外扩增环境进行高通量筛选，优化选择最佳适合软骨细胞24增殖且维持表型的因子浓度及压应力刺激强度。本实施例的基于微流控芯片的仿生体内关节软骨微环境的结构100可以为体外快速扩增软骨细胞24提供方案，从而提高种子细胞质量，改善自体软骨细胞24移植治疗效果。此外，本实施例还可以通过改变灌注炎性因子及过度的压应力强度刺激，为探究临界或病理微环境对软骨细胞24生存代谢的影响提供快速多方案平台。

本说明书中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。