一株防治松材线虫病的寡养单胞菌LC00168及其应用

摘要

本发明提供了一株防治松材线虫病的寡养单胞菌LC00168及其应用，涉及微生物及微生物应用技术领域。所述寡养单胞菌LC00168保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 20895。本发明的寡养单胞菌LC00168的发酵产物具有松材线虫致死能力，可在温室条件下防治由松材线虫引起的松树枯萎病。本发明的寡养单胞菌LC00168可以作为微生物防治松树枯萎病制剂的组分进行开发利用。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及微生物应用技术领域，尤其是涉及一株防治松材线虫病的寡养单胞菌LC00168及其应用。

背景技术

由松材线虫引起的松树枯萎病，是全球森林生态系统中最具危险性、毁灭性的病害之一，被称为“松树的癌症”。1905年在日本九州岛长崎县首次大规模爆发，之后在韩国、美国、加拿大、墨西哥等地也发生了该病害。1982年在南京中山陵的黑松上首次发现松材线虫以来，我国的松材线虫病疫区已分布于18个省市自治区；而且受松材线虫危害的松树树种也不断增加。过去，松材线虫主要受危害马尾松、黑松，目前，已扩展至樟子松、红松与落叶松等树种，严重威胁我国近9亿亩松林的安全。

长期以来，松材线虫病的防控主要依赖砍伐销毁疫木与施用化学药剂。砍伐销毁疫木只能暂缓松材线虫病的传播，并不能彻底消灭区域内的松材线虫，且人工与物资投入巨大；化学药剂的过量使用会造成有害物质残留，破坏生态平衡，给坏境造成沉重负担，化学药剂的滥用亦会导致松材线虫产生耐药性。某些有益微生物具有显著的杀线虫活性，基于有益微生物的生物防治已成为植物线虫病害绿色防控的重要选项之一。应用具有杀线虫活性的有益微生物防治由松材线虫引起的松树枯萎病已引起广泛的关注。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株防治松材线虫病的寡养单胞菌(Stenotrophomonaspavanii)LC00168及其应用，本发明的寡养单胞菌LC00168具有松材线虫致死能力，可在温室条件下防治由松材线虫引起的松树枯萎病。本发明的寡养单胞菌LC00168可以作为微生物制剂的组分用于防治松树枯萎病。

本发明的技术方案如下：

在一个方面，本发明的目的是提供一株防治松材线虫病的寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)，所述寡养单胞菌为寡养单胞菌LC00168，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 20895。

在另一个方面，本发明的目的是提供一种寡养单胞菌发酵产物，所述寡养单胞菌发酵产物由权利要求1所述的寡养单胞菌LC00168接种于培养基中培养得到。

所述寡养单胞菌发酵产物可以为发酵液或其提取物中的一种或多种；或者，所述寡养单胞菌发酵产物也可以为由发酵液或其提取物制成的菌粉。

在一个实施方案中，所述寡养单胞菌发酵产物为发酵液；

所述培养基为液体发酵培养基；优选为LB液体培养基；更优选地，所述培养基的初始pH值为6.0-7.2。

LB液体培养基：氯化钠10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，蒸馏水1L。

在一个实施方案中，所述培养为将寡养单胞菌LC00168在温度30-32℃，转速200-220r/min下，发酵培养14-24小时。

优选地，所述培养为将寡养单胞菌LC00168在温度30-32℃，转速200-210r/min下，发酵培养15-20小时。

更优选地，所述培养为将寡养单胞菌LC00168在温度30℃，转速200r/min下，发酵培养16小时。

在一个实施方案中，所述培养，菌体含量达到10

一种微生物组合物，所述微生物组合物包含本发明前述的寡养单胞菌菌株或前述的寡养单胞菌发酵产物。

本发明提供了寡养单胞菌菌株或所述寡养单胞菌发酵产物在防治松材线虫中的应用。

在具体的应用中，所述寡养单胞菌的发酵产物具有松材线虫致死能力。

在本发明中，在离体条件下，寡养单胞菌LC00168的发酵液具有松材线虫致死能力。

在具体的应用中，所述应用为防治由松材线虫引起的松树枯萎病；优选地，在室温条件下防治由松材线虫引起的松树枯萎病。

在具体的应用过程中，所述应用为将所述寡养单胞菌的发酵产物(尤其是发酵液)喷洒于被松材线虫侵染的松树。

在一个实施方案中，所述松树选自马尾松、黑松、樟子松、红松、落叶松；优选樟子松。

本发明提供的寡养单胞菌LC00168保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC 20895，保藏时间为：2020年10月15日。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明寡养单胞菌LC00168发酵液可以高效杀死松材线虫，实验表明将菌株发酵液喷洒在接种松材线虫的樟子松表面，可以防治由松材线虫引起的松树枯萎病。

2.在离体条件下，经本发明寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的松材线虫的校正死亡率为95.76％，在温室条件下，经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的接种松材线虫的樟子松的病情指数为32.27。

3.本发明提供的菌株，可以作为防治松树枯萎病的生物防治菌株，该菌株发酵条件简单，生防效果优异，且环境友好。

4.本发明的寡养单胞菌LC00168可以作为生物防治松树枯萎病制剂的组分进行开发利用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的死亡松材线虫(图1中A图)和无菌LB液体培养基处理后的活松材线虫(图1中B图)；

图2为寡养单胞菌LC00168菌体发酵液温室防治松树枯萎病的效果；

图3为经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的接种了松材线虫的樟子松的病情指数(注：图中不同的字母表示数据通过Duncan's比较后，在P

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1.菌株的采集、分离以及筛选

(1)采集时间2018年6月，采集地点山东潍坊；

(2)菌株的分离：将文冠果根系浸泡于2mL无菌水中，以10倍浓度梯度稀释，分别涂布于LB平板，30℃培养16小时，挑取单菌落，三线平板划法，30℃培养16小时，分离单克隆菌株。

(3)菌株的筛选：将分离出的单克隆菌株，接种于5mL液体LB培养基，200rpm，30℃摇床培养24小时，收集发酵液(含菌量10

取40μL待测菌株菌体发酵液与20μL 25头/10μL的松材线虫悬浮液共培养，置于25℃培养箱培养24小时，以40μL液体LB培养基作为阴性对照。其中，每组对照与待测菌株各重复3次，每次重复有6个技术平行。根据松材线虫的死亡数量，计算死亡率与校正死亡率。对校正死亡率高于80％的菌株进行温室樟子松防病实验。

在温室条件(25℃)下，将待测菌株的种子发酵液，以体积比1:100接种于50mL液体LB培养基，200rpm，30℃摇床培养24小时，收集发酵液(含菌量10

用手术刀在三年生樟子松主干距离根部5cm处的韧皮部割开面积约为0.3cm×2cm的伤口，然后用1mL的注射器吸取200μL 25头/μL的松材线虫悬浮液，并安装50mL注射器针头，在切开的伤口处注射线虫悬浮液，注射完毕后，用封口膜包扎伤口。并淋洒2mL待测菌株的发酵液。在伤口处注射200μL无菌蒸馏水作为空白对照；在伤口处注射200μL的松材线虫悬浮液作为阴性对照。其中，每组对照与待测菌株各重复3次，每次重复使用3棵樟子松。接种松材线虫一个月后，调查松枝上症状的严重程度，划分病情等级，并计算病情指数。

病情等级：

0级：针叶为绿色，松枝正常；

1级：松枝上1/4以下针叶发黄；

2级：松枝上1/4至3/4针叶发黄；

3级：松枝上3/4以上针叶发黄，1/2以下针叶枯萎；

4级：松枝上1/2以上针叶枯萎，松枝濒死或死亡。

按下列公式计算病情指数：

其中：Xi为各病级的松枝数，ai为病级，amax为最高病级。

2.菌株的鉴定

菌落形态：三线平板划线法，将所述寡养单胞菌LC00168接种于LB平板，30℃培养16小时，菌落为圆形，直径为1-2mm，呈不透明的微黄色，略微凸起，边缘整齐表面光滑，易挑起，有略微的湿润和粘稠感。

所述菌株为革兰氏染色阴性细菌，经16S rDNA序列测定，菌株LC00168为寡养单胞菌。

其中，寡养单胞菌LC00168的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1：cccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcaatgctgatctgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactgagatagggtttctgggattggcttaccgtcgccggcttgcagccctctgtccctaccattgtagtacgtgtgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcggtctccttagagttcccaccattacgtgctggcaactaaggacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtgttcgagttcccgaaggcacccatccatctctggaaagttctcgacatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatactccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggcgaacttaacgcgttagcttcgatactgcgtgccaaattgcacccaacatccagttcgcatcgtttagggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtgcctcagtgtcagtgttggtccaggtagctgccttcgccatggatgttcctcctgatctctacgcatttcactgctacaccaggaattccgctaccctctaccacactctagtcgcccagtatccactgcagttcccaggttgagcccagggctttcacaacggacttaaacgaccacctacgcacgctttacgcccagtaattccgagtaacgcttgcacccttcgtattaccgcggctgctggcacgaagttagccggtgcttattctttgggtaccgtcatcccaaccgggtattagccggctggatttctttcccaacaaaagggctttacaacccgaaggccttcttcacccacgcggtatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctgatcatcctctcagaccagctacggatcgtcgccttggtgggcctttaccccgccaactagctaatccgacatcggctcattcaatcgcgcaaggcccgaaggtcccctgctttcacccgtaggtcgtatgcggtattagcgtaagtttccctacgttatcccccacgacagagtagattccgatgtattcctcacccgtccgc

实施例2：寡养单胞菌LC00168发酵液的制备

菌种活化培养基：LB固体培养基，配方为氯化钠10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，琼脂15g，蒸馏水1L。使用高压灭菌锅，121℃，灭菌20min。待培养基冷却至60-70℃，制成直径为90mm的固体培养基平板。

用接种环挑取保存于-80℃的寡养单胞菌LC00168的培养液，并在LB平板上划线后于30℃培养24小时，获得活化的寡养单胞菌LC00168。

种子培养液制备培养基：LB液体培养基，配方为氯化钠10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，蒸馏水1L。使用高压灭菌锅，121℃，灭菌20min。

吸取5mL液体LB培养基加入无菌试管中，用接种环挑取寡养单胞菌LC00168的单菌落加入其中，30℃，200rpm，培养16小时，获得寡养单胞菌LC00168的种子培养液。

发酵液培养基：LB液体培养基。

发酵方法：

吸取50mL发酵培养基(液体LB培养基)加入无菌250mL锥形瓶中，将寡养单胞菌LC00168的种子培养液以体积比1:100接种于发酵培养基中，30℃，200rpm，培养16小时，获得寡养单胞菌LC00168的发酵液(含菌量达到10

实施例3：松材线虫致死能力测试

离体条件下，进行了寡养单胞菌LC00168菌体发酵液松材线虫致死能力测试。

将寡养单胞菌LC00168菌体接种于5mL液体LB培养基，200rpm，30℃摇床培养24小时，菌体含量达到10

死亡率(％)＝(死亡虫数量/供试虫数量)×100；

校正死亡率(％)＝(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100。

经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的松材线虫的校正死亡率为95.76％。

对照组：将无菌液体LB培养基与松材线虫悬浮液共培养，置于25℃培养箱培养24小时，每个处理重复三次。根据松材线虫的死亡数量，计算死亡率和校正死亡率。

无菌LB液体培养基处理后的松材线虫的校正死亡率为0.17％。

图1为本发明实施例提供的经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的死亡松材线虫(图1中A图)和无菌LB液体培养基处理后的活松材线虫(图1中B图)。

实施例4：寡养单胞菌LC00168菌体发酵液的松树枯萎病防治能力测试

在温室条件(25℃)下，进行寡养单胞菌LC00168菌体发酵液的松树枯萎病防治能力测试(松树采用3年生樟子松苗，购买自哈尔滨市宾县洪山林场)。

将本发明寡养单胞菌LC00168菌体种子培养液以体积比1:100接种于50mL液体LB培养基中，30℃，200rpm，培养24小时，收集发酵液(含菌量10

将松材线虫悬浮液浓度调至25头/μL，备用。

用手术刀在三年生樟子松主干距离根部5cm处的韧皮部割开面积约为0.3cm×2cm的伤口，然后用1mL的注射器吸取200μL 25头/μL的松材线虫悬浮液，并安装50mL注射器针头，在切开的伤口处注射线虫悬浮液，注射完毕后，用封口膜包扎伤口，并淋洒2mL寡养单胞菌LC00168菌体发酵液。

在伤口处注射200μL无菌蒸馏水作为空白对照；在伤口处注射200μL的松材线虫悬浮液作为阴性对照。

其中，空白对照重复3次，每个重复使用3棵樟子松；阴性对照与寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理各重复3次，每个重复使用3棵樟子松。

接种松材线虫一个月后，调查松枝上症状的严重程度，并划分病情等级。

病情等级：

0级：针叶为绿色，松枝正常；

1级：松枝上1/4以下针叶发黄；

2级：松枝上1/4至3/4针叶发黄；

3级：松枝上3/4以上针叶发黄，1/2以下针叶枯萎；

4级：松枝上1/2以上针叶枯萎，松枝濒死或死亡。

按下列公式计算病情指数：

其中：X

结果显示：阴性对照中樟子松幼苗的病情指数为86.07；经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的接种了松材线虫的樟子松幼苗的病情指数为32.27，结果见图3。

寡养单胞菌LC00168菌体发酵液对松材线虫病的作用效果见图2。经寡养单胞菌LC00168菌体发酵液处理的接种松材线虫的樟子松幼苗的枯萎症状与仅接种松材线虫的幼苗相比，显著减轻。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北林业大学

<120> 一株防治松材线虫病的寡养单胞菌LC00168及其应用

<130> PA20038296

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1316

<212> DNA

<213> 寡养单胞菌LC00168 16S rDNA

<400> 1

cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agcaatgctg 60

atctgcgatt actagcgatt ccgacttcat ggagtcgagt tgcagactcc aatccggact 120

gagatagggt ttctgggatt ggcttaccgt cgccggcttg cagccctctg tccctaccat 180

tgtagtacgt gtgtagccct ggccgtaagg gccatgatga cttgacgtca tccccacctt 240

cctccggttt gtcaccggcg gtctccttag agttcccacc attacgtgct ggcaactaag 300

gacaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 360

gccatgcagc acctgtgttc gagttcccga aggcacccat ccatctctgg aaagttctcg 420

acatgtcaag gccaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tactccaccg 480

cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg 540

gcgaacttaa cgcgttagct tcgatactgc gtgccaaatt gcacccaaca tccagttcgc 600

atcgtttagg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgtgc 660

ctcagtgtca gtgttggtcc aggtagctgc cttcgccatg gatgttcctc ctgatctcta 720

cgcatttcac tgctacacca ggaattccgc taccctctac cacactctag tcgcccagta 780

tccactgcag ttcccaggtt gagcccaggg ctttcacaac ggacttaaac gaccacctac 840

gcacgcttta cgcccagtaa ttccgagtaa cgcttgcacc cttcgtatta ccgcggctgc 900

tggcacgaag ttagccggtg cttattcttt gggtaccgtc atcccaaccg ggtattagcc 960

ggctggattt ctttcccaac aaaagggctt tacaacccga aggccttctt cacccacgcg 1020

gtatggctgg atcaggcttg cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1080

agtctggacc gtgtctcagt tccagtgtgg ctgatcatcc tctcagacca gctacggatc 1140

gtcgccttgg tgggccttta ccccgccaac tagctaatcc gacatcggct cattcaatcg 1200

cgcaaggccc gaaggtcccc tgctttcacc cgtaggtcgt atgcggtatt agcgtaagtt 1260

tccctacgtt atcccccacg acagagtaga ttccgatgta ttcctcaccc gtccgc 1316