与大豆蛋白含量显著关联的单核苷酸突变位点SNP、KASP标记及其应用

摘要

本发明提供了一种与大豆蛋白含量显著关联的单核苷酸突变位点SNP、KASP标记及其应用，属于植物分子育种领域。本发明与大豆蛋白含量显著关联的SNP S14_73926位于大豆基因组v2.0的14号染色体73,926bp位置，发生了碱基G至A的替换，表型变异解释率达到6.4％，并对该SNP位点开发了KASP标记，本发明提供的大豆蛋白含量显著关联的SNP及KASP标记可用于大豆蛋白性状的分子标记辅助选择育种，对于加快大豆高蛋白育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

说明书

一、技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，提供了一种与大豆蛋白含量显著关联的核苷酸突变位点SNP、KASP标记及其应用，可用于大豆蛋白质含量性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

二、背景技术

大豆蛋白质含量40％左右，是人类植物蛋白质重要来源之一，所提供的蛋白质约占全世界蛋白质消费总量的68％，含有人体自身不能合成的八种必需氨基酸，因此具有很高的营养价值。随着人们膳食水平的提高，对大豆蛋白的消费需求持续增加，国内大豆供需矛盾更加凸出。因此，研究快速、有效的大豆蛋白性状分子育种技术，对于分子辅助大豆蛋白质性状的遗传改良具有十分重要的生产意义。

传统高蛋白大豆育种是根据育种后代蛋白含量进行的单株选择，这种方式不仅费时耗力而且易受环境干扰准确性不高。利用目标基因存在的碱基差异，开发特异性分子标记进行辅助选择是提高高蛋白大豆选择效率的最佳方法。分子标记在作物育种中具有早期选择、不受环境影响以及准确、快速、高效的优势，已成为一种准确、高效的工具。虽然其中竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)分子标记是建立在等位基因特异性扩增(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)和高灵敏度的荧光检测基础之上的一种新型SNP分型方法。其原理是针对等位基因SNP位点设计两个正向引物和一个通用反向引物，每条正向引物都有特异性序列，可与不同荧光标记结合。带有与不同荧光结合序列的正向引物与通用反向引物PCR扩增样品的DNA，其等位变异就可以通过不同的荧光信号得以反映(He C L,etal.SNP genotyping:the KASPassay.MethodsMolBiol,2014,1145,75-86)。

研究表明大豆蛋白含量受多个基因调控并且容易受到环境的影响，为复杂的数量性状。目前，现有研究报道已经定位了多个控制大豆蛋白含量的QTL位点。单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。全基因组关联(GWAS)作为一种有效的基因定位工具，可以快速、准确地挖掘与大豆蛋白显著关联的SNP。因此，基于鉴定的与大豆蛋白显著关联的SNP，开发与大豆蛋白含量紧密连锁的KASP标记，用于育种早期(低世代)选择，对于减少育种工作量、加速育种进度具有显著的作用，同时经济效益明显。基于挖掘与大豆蛋白显著关联的SNP，开发出用于辅助育种的KASP分子标记，实现目标性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率尤为重要。

三、发明内容

技术要求

本发明的目的是鉴定与大豆蛋白含量显著关联的单核苷酸突变位点(SNP)，并基于该SNP位点信息开发KASP分子标记及其引物对，为实现该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。

技术方案

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种与大豆蛋白含量显著关联的核苷酸突变位点SNP，其特征在于，与大豆蛋白含量显著相关联的SNP S14_73926位于大豆基因组v2.0的14号染色体73,926bp位置，发生了碱基G至A的替换，该SNP所处的核苷酸序列如Seq ID NO.1所述；

本发明所述KASP标记含有三条引物，分别包含两条针对关键位点碱基差异设计的特异性引物，即上游引物F1(Seq ID NO.2)、上游引物F2(Seq ID NO.3)，一条通用引物即下游引物R(Seq ID NO.4)，两条特异性引物3’末端为等位变异碱基，5’端连接英国LGC(Laboratory ofthe Government Chemist)公司KASP反应试剂特定的FAM和HEX荧光接头序列。

KASP标记上游引物F1序列为5’-

KASP标记上游引物F2序列为5’-

KASP标记下游引物R 5’-ttccacctcgccattcatcc-3’。

在合成所述的KASP分子标记引物时，所述正向引物F1的5’端加上羧基荧光素FAM的荧光信号标签(引物下划线部分)；正向引物F2的5’端加上六氯荧光素氨基磷酸酯HEX的荧光信号标签(引物下划线部分)。

针对与大豆蛋白含量显著关联的核苷酸突变位点SNP的KASP分子标记应用于鉴定或辅助筛选方法是检测大豆14号染色体73,926bp位置的脱氧核糖核苷酸的基因型是AA还是GG，用于选择AA基因型大豆低世代育种材料，分子标记辅助大豆蛋白性状的遗传改良。

上述方法中，所述KASP引物组由上游引物F

具体操作步骤如下：

(1)大豆植株基因组DNA的提取；

(2)采用所述的PCR特异性扩增引物对生物样本的基因组DNA进行PCR扩增并检测所述的SNP基因型：

将所述的分子标记引物加入同一PCR反应体系，并设置2个以超纯水代替样品模版DNA的空白对照，在荧光定量PCR仪上对大豆种质资源的DNA进行扩增；

10μl反应体系：大豆样品DNA模板，25ng/μl，2μl；2×KASP Master mix 5μl；KASPAssay Mix，F1:F2:R＝2:2:5，0.14μl；水2.9μl。反应条件包括94℃预变性15min；94℃变性20sec，61～55℃退火60sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，26个循环。

反应完成后，ABI7500实时荧光定量PCR仪会直接对PCR反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形，该分子标记引物可以清楚的将两种基因型分开，其中靠近Y轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA；靠近X轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG。

(3)根据基因型在不同分离世代选择得到高大豆蛋白含量单株或株系。

有益效果

(1)本发明大豆蛋白显著关联的SNP，S14_73926是从1084份大豆种质资源中选出具有代表性的264份(表1)，包含52份地方种和212份栽培种，组成了微核心种质资源，进行10×重测序，经过剔除过滤后获得覆盖全基因组的高密度的SNP分子标记图谱，再利用凯氏定氮法检测两个环境下(2018和2019年)大豆种子的蛋白含量，对大豆蛋白表型数据进行全基因组关联分析得到的，在2个环境中均能检测到与大豆蛋白显著关联的SNP位点S14_73926，表型变异解释率达到6.4％，位于大豆基因组v2.0的14号染色体73,926bp位置。选择AA基因型大豆低世代育种材料，为大豆蛋白质含量性状的分子标记辅助育种提供技术支持。

(2)本发明鉴定了一个位于大豆14号染色体上控制大豆蛋白含量的SNP位点，开发的KASP分子标记能直接对SNP突变位点的G或A碱基进行特异的区分和检测，该KASP分子标记具有良好的应用价值，可实现对大豆蛋白质含量性状的预先选择和分子辅助育种。

(3)利用KASP分子标记引物在实时荧光定量PCR仪上对36份大豆材料进行扩增并进行基因分型，结果表明：该分子标记引物可以清楚的将两种基因型分开，其中靠近Y轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA，有8份，其平均蛋白含量分别为43.29％(2018年)和45.98％(2019年)；靠近X轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG，有28份，其平均蛋白含量分别为38.64％(2018年)和41.48％(2019年)；靠近XY轴原点的点为空白对照(图2)。另外发现，在包含264份大豆材料的关联分析群体中(有4份材料在SNP S14_73926基因型为缺失)，基因型是AA型的21份大豆材料的平均蛋白含量分别为41.85％(2018年)和44.18％(2019年)；基因型是GG型的239份大豆材料的平均蛋白含量分别为39.56％(2018年)和42.26％(2019年)。

四、附图说明

图1.大豆蛋白GWAS结果的曼哈顿及QQ-plot图。A和B分别代表2018和2019年的大豆蛋白GWAS结果的曼哈顿及QQ-plot图，图中红色实线代表显著阈值，-log(p-value)≥6.4。

图2.KASP标记对不同大豆品种基因分型。

(靠近原点的黑色圆点代表无模板DNA的空白对照；靠近Y轴的绿色圆点和靠近X轴的蓝色圆点分别代表携带A等位变异位点的大豆品种和携有G等位变异位点的大豆品种)

五、具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明，所用方法如无特别说明，均为常规方法。

本发明中大豆蛋白显著关联的SNP，S14_73926是通过下列步骤获得的：

(1)从1084份大豆种质资源中选出具有代表性的264份(表1)，包含52份地方种和212份栽培种，组成了微核心种质资源，进行10×重测序，经过剔除过滤后获得覆盖全基因组的高密度的SNP分子标记图谱。

(2)利用凯氏定氮法检测两个环境下(2018和2019年)大豆种子的蛋白含量，利用R语言软件中的GAPIT算法包中的混合线性模型(MLM)对大豆蛋白表型数据进行全基因组关联分析，在2个环境中均能检测到与大豆蛋白显著关联的SNP位点S14_73926，表型变异解释率达到6.4％，位于大豆基因组v2.0的14号染色体73,926bp位置。

实施例1：大豆蛋白含量显著关联的核苷酸突变位点(SNP)获得

(1)蛋白含量的测定：取烘干的实验室大豆样品充分混匀后，粉碎，籽粒全部通过0.25mm孔径筛，装入样品瓶备用。称取试样0.2g，精确至0.0001g，置于300mL消煮管中。然后依据国标GB 5009.5-2016的方法进行蛋白的测定。

(2)DNA提取及高通量测序：采用CTAB法提取264份大豆幼嫩叶片的基因组DNA，进行全基因组重测序。

(3)全基因组关联分析(GWAS)：利用R语言软件中的GAPIT算法包，计算模型为混合线性模型(MLM)，GWAS分析检测到与大豆蛋白含量显著关联的SNP位点24个，且均位于14号染色体上(图1)，其中与大豆蛋白显著关联的SNP位点S14_73926，表型变异解释率达到6.4％。

实施例2：KASP标记特异引物的开发

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Primer-BLAST功能，依据Seq IDNO.1序列设计三个引物，上游引物F1(Seq ID NO.2)、上游引物F2(Seq ID NO.3)和下游引物R(Seq ID NO.4)，其中F1和F2分别包含FAM和HEX荧光接头序列(下划线)，序列如下：

F1序列：5’-

F2序列：5’-

R序列：5’-ttccacctcgccattcatcc-3’

实施例3：检测不同品种大豆SNP位点的基因型及其应用

分别提取大豆样品的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用KASP标记专用引物在进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增是在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行，PCR结束后该仪器根据荧光信号可进行基因分型。所述的扩增体系均为10μl反应体系：大豆样品DNA模板，25ng/μl，2μl；2×KASP Master mix 5μl；KASPAssay Mix，F1:F2:R＝2:2:5，0.14μl；水2.9μl。反应条件包括94℃预变性15min；94℃变性20sec，61～55℃退火60sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，26个循环。

反应完成后，ABI7500实时荧光定量PCR仪直接对PCR反应产物进行荧光数据读取，结果如图2。利用KASP分子标记引物在实时荧光定量PCR仪上对36份大豆材料进行扩增并进行基因分型，结果表明：该分子标记引物可以清楚的将两种基因型分开，其中靠近Y轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA，有8份，其平均蛋白含量分别为43.29％(2018年)和45.98％(2019年)；靠近X轴的圆点为携带G等位变异位点，基因型为GG，有28份，其平均蛋白含量分别为38.64％(2018年)和41.48％(2019年)；靠近XY轴原点的点为空白对照(图2)。另外发现，在包含264份大豆材料的关联分析群体中(有4份材料在SNP S14_73926基因型为缺失)，基因型是AA型的21份大豆材料的平均蛋白含量分别为41.85％(2018年)和44.18％(2019年)；基因型是GG型的239份大豆材料的平均蛋白含量分别为39.56％(2018年)和42.26％(2019年)。

表1.用于重测序及全基因组关联分析的大豆自然群体名称及编号

注：以上264份大豆材料以表1中对应的编号形式均出现在公开发表的文献中(Zhang,W.,Xu,W.,Zhang,H.et al.Comparative selective signature analysisandhigh-resolution GWAS reveal a new candidate gene controlling seedweight insoybean.TheorAppl Genet(2021).https://doi.org/10.1007/s00122-021-03774-6)。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与大豆蛋白含量显著关联的单核苷酸突变位点SNP、KASP标记及其应用

<141> 2021-04-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 179

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

gttgaagtga gatatggtgg acgatttggc gaggtggtgg tagggaagac gggttgagga 60

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<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

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<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 4

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