一种兔瘟2型病毒抗原双孔快速检测卡及检测方法

摘要

本发明公开了一种兔瘟2型病毒抗原双孔快速检测卡及检测方法，包括安装在外壳内的PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间设置质控线和检测线；上外壳对应检测线和质控线开设视窗孔，视窗孔一侧设置定量标识线，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。本发明通过加样孔加样本，清洗孔加稀释液的方式以及设置定量标识线精确控制免疫复合液，不但能提高检测灵敏性、精密性，而且还保留检测方法的快速和简便特性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测卡，特别是涉及一种兔瘟2型病毒抗原快速检测卡及检测方法。

背景技术

兔瘟，又称兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)，是由嵌杯病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV)引起家兔的一种急性、高度致死性传染病。1984年我国首次报道RHD后，世界很多国家相继报道RHD的发生和流行。

2020年4月，我国四川省某养兔场发生疑似RHD疫情，兔死亡率约为73.3％，经红细胞凝集试验、RT-PCR及测序分析等，确定该病原为兔出血症病毒2型(RHDV2)。至2018年11月，全球共报道133例RHDV2疫情。RHDV2严重影响各国养兔业发展，造成巨大经济损失，同时还导致全球野兔种群数量的急剧减少，破坏生态平衡，给人类社会、民众健康带来严重的负面影响。

目前主要的检测方法有：血凝实验是最经典的方法，此法敏感性高，但费时、费力且一直需要新鲜细胞，难以用于兔瘟2型病毒爆发的早期诊断，仅作为一种最终鉴定手段；镧系荧光免疫层析试纸条可用作大规模血清样品的筛选，作为鉴别诊断的有效方法。该方法可定量检测，结果直观、特异性强，但灵敏度仍待提高。因此，如何设计出一种灵敏度高的兔瘟2型病毒抗原的快速检测方法是本领域技术人员关注解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种兔瘟2型病毒抗原双孔快速检测卡及检测方法，能解决现有技术的不足。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种兔瘟2型病毒抗原双孔快速检测卡，包括安装在外壳内的兔瘟2型病毒抗原检测条，该兔瘟2型病毒抗原检测条包括PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫、滤物垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被检测线和质控线；

标记物垫上浸染标记镧系荧光微球的兔瘟2型病毒单抗和标记镧系荧光微球的鸡IgY抗体；在检测线上包被兔瘟2型病毒单抗，质控线上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

作为优选，所述样品垫上方的滤物垫为滤血垫，可用于全血检测。

作为优选，所述外壳包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，在上盖上对应检测线和质控线开设视窗孔，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。

作为优选，所述视窗孔一侧设置定量标识线(M)。

作为优选，所述定量标识线(M)为一根细实线。

作为优选，所述吸水垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，稀释垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm，标记物垫与稀释垫之间有5-10mm的间距。

作为优选，所述标记物垫中加有色素物质。这种设计使样本液在侧流层析过程的液迹更明显。通过“液迹”控制加液量、加稀释液时间和控制检测时间，可以提高试剂检测的敏感性和精密性，实现提高检测灵敏度。具体操作：通过在视窗孔看到或“液迹”监测，当含有色素的样本复合液迹到达定量标识线(M)附近时，提示加稀释液(或清洗液)；当视窗孔再次看到色素时，应停止对检测卡检测。

一种兔瘟2型病毒抗原的检测方法，包括上述的快速检测卡，从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，等待检测线和质控线免疫反应层析，最后通过视窗孔观测或通过仪器进行检测、判读结果。

现有层析技术采用的方式是硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置标记物垫，在标记物垫上由下至上依次设置样品垫和加样孔。无论是样本还是样本稀释液在加入加样孔后，样本、标记物和稀释液在吸水垫的引力作用下，迅速向吸水垫方向侧流，因此样本垫中后侧的部分标记抗原(或抗体)不能完全地与加入的样本液进行充分免疫反应，尤其由于样本基质之间的差异很大，导致在渗透释放到检测线(T线)的样本总量产生偏差，从而直接影响检测结果的敏感性和稳定性。

与现有技术不同，本发明提供了一种兔瘟2型病毒抗原双孔快速检测卡，在硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置稀释垫，标记物垫设置在稀释垫前方(吸水垫方向为前方)，并在标记物垫和稀释垫之间保留了5-10mm硝酸纤维素膜裸露空间。标记物垫上依次设置样品垫、滤物垫、加样孔，稀释垫上方设置清洗孔。当样本加入加样孔后，样本经过滤物垫、样本垫和标记物垫后，样本与标记的抗体免疫反应形成复合物液，在吸水垫和稀释垫作用下，沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释垫两个方向侧流层析。

采用两个方向扩散层析复合液的特征与现有技术具有本质差异，加入样本的量较少(一般为5-50uL)，渗透入硝酸纤维素膜的样本的免疫复合液的流速会减慢直至停滞，这个减慢、停滞过程相比现有技术而言，就延长了样本和标记抗原或抗体免疫复合反应时间，可达到提高灵敏度的作用。

另一方面，与现有技术中免疫反应复合液快速释放到硝酸纤维素膜(T)线上不同，本发明在加入样本后，免疫反应复合液流入硝酸纤维素膜之后，此时，标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤血垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜，因此，当稀释垫加入稀释液后，在吸水垫的作用下，稀释液带着复合液顺着硝酸纤维素膜向前侧流，是来不及流入样品垫和标记物垫，稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本和复合物稀释侧流至吸水垫，而未进入硝酸纤维素膜的剩余复合物和样本液只有极少量向硝酸纤维素膜中渗透，不会对检测结果造成影响，从而保证了检测的稳定性，提高检测的精密性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

一方面，采用加样孔加待测样品、清洗孔加稀释液的方式，另一方面，通过设置定量标识线(M)精确控制样本量，不但可提高被检测物的敏感性、精密性和稳定性，而且仍保留了快诊检测方法的快速和方便特性。该检测卡不仅适用于现场的快速检测，也可用于兔瘟2型病毒的疫情监测，对于野外现场检测及偏远地区爆发的早期防控提供最为快速、敏感、准确的检测方法。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是外壳的俯视图；

图3是兔瘟2型病毒抗原荧光检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

如图1至图3所示，一种兔瘟2型病毒抗原双孔快速检测卡，包括安装在外壳9内的兔瘟2型病毒抗原检测条。

所述兔瘟2型病毒抗原检测条包括PVC底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、稀释垫4、标记物垫5、质控线6、检测线7和样品垫8。

所述硝酸纤维素膜3固定在PVC底板1上，在硝酸纤维素膜3左端搭接吸水垫2，右端搭接稀释垫4，在硝酸纤维素膜3中部靠右的位置设置标记物垫5，标记物垫5上设置样品垫8，在硝酸纤维素膜3上吸水垫2与标记物垫5之间设置检测线7和质控线6。外壳9上对应检测线7和质控线6开设视窗孔10，并在视窗孔10右侧设有定量标识线(M)13，该定量标识线(M)13为一根细实线，对应样品垫8开设加样孔11，对应稀释垫4开设清洗孔12。

所述吸水垫2与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1-2mm，稀释垫4与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1-2mm，标记物垫5与稀释垫4之间有5-10mm的间距。

所述标记物垫5上浸染标记镧系荧光微球的兔瘟2型病毒单抗和标记镧系荧光微球的鸡IgY抗体；在检测线7上包被兔瘟2型病毒单抗，质控线6上包被羊抗鸡IgY抗体的IgG。

作为一种优选的方案，所述标记物垫5为加有色素的标记物垫。所述外壳9包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，且视窗孔10、加样孔11和清洗孔12以及定量标识线(M)13位于上盖上。

所述样品垫8上根据需要可设有滤血垫(图中未画出),滤血垫用于分离全血中的红细胞。

在使用时，从加样孔11加入样品液，一般样品液加入量为5-50μL，样品液经过滤物垫14、样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于稀释垫4和吸水垫2均处于干燥状态，并且样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和远小于两侧的吸水垫2和稀释垫4，因此样品液会带着标记物向硝酸纤维素膜3两侧渗透，由于样品液加入量只有5-50μL，因此，样品液在向两侧层析流动时，会逐渐耗尽，进而停留在硝酸纤维素膜3的定量标识线(M)13附近，且不会到达检测线7；这样样品液和标记物在硝酸纤维素膜3上就获得了更多的反应时间(一般为0.5-5分钟)。当样本流动的液迹出现在定量标识线(M)13时，将稀释液加入清洗孔12，稀释液首先经过稀释垫4，稀释垫4中一般包含有用于消除非特异性反应的试剂组份(如阻断剂)，稀释液与其混合后进入硝酸纤维素膜3，与已经释放到硝酸纤维素膜3内的样本与抗原或抗体标记物免疫反应的复合物作用，消除一些非特异的物质的影响，并在吸水垫2的作用下，随着稀释液向吸水垫2方向流动，与检测线7上包被的兔瘟2型病毒单抗、质控线6上包被的羊抗鸡IgY抗体的IgG进行免疫结合，并被捕获停留在检测线7和质控线6上，直至完成层析。

在初始状态硝酸纤维素膜3干燥，样品液和标记物会快速释放到硝酸纤维素膜3上，基本不受样品差异影响，之后残留在标记物垫5中的标记物和样品液会缓慢进入到硝酸纤维素膜3，此时的释放过程的快慢受样品基质差异影响较大，直接影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔11设置在硝酸纤维素膜3中间偏清洗孔12的位置，样品液和标记物渗透到硝酸纤维素膜3上后会向两测层析，甚至样本耗尽并停留在硝酸纤维素膜3上，并通过延迟或满足预设条件后加入稀释液的方式，增加免疫反应时间(即样本与标记物之间的反应时间)，从而提高了检测灵敏度和精密度。

本发明通过稀释液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，以及增加控制复合液量的定量标识线(M),控制进入硝酸纤维素膜3的样品与标记物免疫反应的复合液的量，可以提高兔瘟2型病毒抗原检测的敏感性和精密性。本发明通过样品液和稀释液分开加样的清洗方式，可改善依靠样品液自清洗的清洗效率，减少使硝酸纤维素膜3的背景洁净度，提高检测试剂的灵敏度。

一种兔瘟2型病毒抗原的检测方法，包括上述的快速检测卡，从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，等待检测线和质控线免疫反应层析，最后通过视窗孔观测或通过仪器进行检测、判读结果。

下面对本检测卡的制作过程进行具体说明。

(一)兔瘟2型病毒的单克隆抗体制备

用乳化后的纯化兔瘟2型病毒抗原免疫小鼠，检测结果显示与兔瘟2型病毒反应效价较强时，取出小鼠脾脏，在铜网上研碎收集好和SP/0骨髓瘤细胞一起加到融合管内融合，最后在96孔细胞培养板上用5％CO2培养内培养，克隆长至孔底面积1/10时，吸出上清检测抗体，筛选杂交瘤细胞，反复多次克隆，以获得由单个细胞增殖而形成同源性的杂交瘤细胞克隆，分泌上清液含单克隆抗体。再进行亚克隆，经过多次亚克隆后得到制备纯的单克隆抗体杂交瘤细胞，制备的单克隆抗体利用间接ELISA方法进行初筛，最后再进行亚类鉴定，确定的单克隆抗体杂交瘤细胞再进行大量抗体制备。

(二)制备兔瘟2型病毒抗原荧光检测卡

检测原理：采用镧系荧光纳米微球作标记示踪物、双抗体夹心免疫反应方法及层析侧流分离技术，经高敏荧光检测技术测定，检测软件依据预置的《兔瘟2型病毒抗原——荧光信号相关的标准曲线》换算，快速测定被测样本中兔瘟2型病毒抗原的含量。

兔瘟2型病毒双孔抗原荧光快速检测卡制备：

步骤一、把NC膜(Sartorius CN140)粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在NC膜上喷涂已稀释至0.3mg/ml的羊抗鸡IgY的IgG形成质控线(C线)和喷涂已稀释至0.5mg/ml的兔瘟2型病毒抗体形成检测线(T线)，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制16小时；

步骤二、制备标记镧系荧光微球鸡IgY和标记镧系荧光微球兔瘟2型病毒抗体：取1mL的镧系荧光微球(成都微瑞生物科技有限公司产品)加入到5mL的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.05M，pH7.2)中，再加入10mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡IgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记镧系荧光微球的鸡IgY；

采用上述同样的方法标记镧系荧光微球兔瘟2型病毒抗体；

步骤三、把标记镧系荧光微球鸡IgY和兔瘟2型病毒抗体分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml混在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在聚酯膜上构成标记物垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四、把标记物垫切成8mm长，样品垫也切成8mm长，然后通过双面胶叠加粘在一起，然后用连续切割机切成5mm宽的加样条，并把它们组装在检测卡外壳上盖的加样孔下面；

步骤五，把305mm长、12mm宽的稀释垫和305mm长、17mm宽的吸水垫对应粘在PVC底板上的NC膜两端(叠加的宽度均为1-2mm)，组装成大卡，再用连续切割机切成4.15mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳下盖内，把检测卡的上、下盖扣合在一起即得到本兔瘟2型病毒检测卡。

(三)兔瘟2型病毒抗原标准曲线的制备

制备标准曲线原理：将经荧光仪检测，一组系列梯度稀释质控品分别加入(二)制备的检测卡，对系列检测的荧光值和对应被检测物浓度值进行线性回归，得出兔瘟2型病毒浓度——荧光信号之间相性《标准曲线》，并形成一个文件，预置到检测云平台，并对应生成条形码，通过客户端检测软件手机扫描该批次条形码，即可从云平台提取该标准曲线。

生成兔瘟2型病毒检测标准曲线：

配置含有兔瘟2型病毒抗原阳性质控品梯度稀释6份，各取50微升分别加入装配好的双孔检测卡的中间加样孔内，然后在后边加样孔中加入80微升稀释液，总静置层析15分钟后，通过荧光分析仪检测，将6次得到的检测荧光信息计算对应的检测线和质控线的荧光信号强度比值，并根据此数据进行线性回归，制出兔瘟2型病毒抗原的标准曲线(图3)，通过软件把标准曲线形成一个文件，并传到云平台上生成条形码。

(四)兔瘟2型病毒抗原检测卡的使用

在加样孔中加入50μL待测样本血清样本，3分种后样本水印移到至检测窗口定量标识线附近，再在清洗孔中加入80μL清洗液，层析15分钟，然后用成都微瑞生物科技有限公司生产的WR-1608型荧光分析仪对检测卡进行检测，荧光分析仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端软件获取检测线和质控线的荧光信号，根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端软件依据通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测兔瘟2型病毒抗原标准曲线，再根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测样本中兔瘟2型病毒的含量。经客户端检测软件显示和存储检测报告。兔瘟2型病毒含量和荧光信号强度成正比。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。