一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒

摘要

本发明涉及细胞显色试剂技术领域，尤其是一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒，包括即用型抗体工作液、试剂C液、试剂D液、试剂E液、试剂F液和试剂G液；即用型抗体工作液：包括抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、鱼皮明胶、防腐剂proclin‑950、嫩叶绿色素、聚乙二醇、酪蛋白、表面活性剂、4‑氨基安替比林和氯化钠，抗体试剂包括试剂A液和试剂B液，本发明可用于宫颈脱细胞,也可用作组织的染色。本发明返蓝方式新创，返蓝效果较市面其他厂家试剂盒效果更好，封片方式更简单，且大大缩短了实验时间。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞显色试剂技术领域，具体领域为一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒。

背景技术

目前有专利文件CN201510085334.8中提出了，对宫颈上皮组织标本，通过免疫组化双染的方法来判断宫颈上皮是否发生瘤样病变。该方法是对宫颈鳞状上皮组织样本的两种标记物磷蛋白(stathmin)和微小染色体维持蛋白(mini-chromosome maintenanceproteins，MCM2)，通过使用免疫酶底物显色法来判断是否发生高度瘤样病变(CIN III)。但是该方法中样本为宫颈活检取材，属于有创性检测，一方面对个体带来创伤，另一方面以目前宫颈癌筛查标准需对病人进行二次取样，增加取样难度；还有该方法的两种标志物在癌前病变中的诊断研究还比较有限，临床应用更加有限。

中国专利CN201210567622.3提出以宫颈脱落细胞，通过免疫细胞化学的方法检测P16INK4a蛋白表达来判断是否有宫颈癌前病变，但通过P16INK4a蛋白除了在宫颈异常增生细胞中过表达，也同时在输卵管化生细胞、子宫内膜细胞和正常柱状细胞中过表达，最终结果诊断仍需要结合细胞形态学来判断，降低医生的工作量比较有限。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒，包括即用型抗体工作液、试剂C液、试剂D液、试剂E液、试剂F液和试剂G液；

即用型抗体工作液：包括试剂A液和试剂B液。成分包括抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、鱼皮明胶、防腐剂proclin-950、嫩叶绿色素、聚乙二醇、酪蛋白、表面活性剂、4-氨基安替比林和氯化钠；

试剂A液：P16INK4a抗体与Ki-67抗体组合成的混合一抗；

试剂B液：HRP标记的羊抗鼠多聚物偶联二抗与AP标记的羊抗兔多聚物偶联二抗组合成的混合二抗；

试剂C液：阻断剂；

试剂D液：二氨基联苯胺；

试剂E液：使试剂D液显色的缓冲液；

试剂F液：核固红色原；

试剂G液：使试剂F液显色的缓冲液。

优选的，所述的试剂A液为p16INK4a单克隆抗体和Ki-67单克隆抗体的Tris缓冲溶液。

优选的，所述的Tris缓冲溶液的pH值为7.19～7.81，其中，p16INK4a抗体浓度为0.09-1.5mg/L；Ki-67抗体浓度为0.09-1.5mg/L。

优选的，所述的试剂B液中HRP标记的羊抗鼠多聚物偶联二抗组合成的混合二抗为将多聚赖氨酸溶于磷酸盐缓冲溶液中加入适量高碘酸钠进行氧化，用多聚赖氨酸基质相同磷酸盐缓冲溶液进行透析过夜，水溶辣根过氧化物酶加入适量高碘酸钠氧化，使用乙二醇终止反应透析过夜；将氧化多聚赖氨酸和羊抗鼠抗体和活化后辣根过氧化物酶混合反应后透析过夜，使用保存液稀释至工作液。

优选的，所述的试剂B液中AP标记的羊抗兔多聚物偶联二抗为将多聚赖氨酸溶于磷酸盐缓冲溶液中加入适量高碘酸钠进行氧化，用多聚赖氨酸基质相同磷酸盐缓冲溶液进行透析过夜，水溶碱性磷酸酶加入适量高碘酸钠氧化，使用乙二醇终止反应透析过夜；将氧化多聚赖氨酸和羊抗兔ki67抗体和活化后辣根过氧化物酶混合反应后透析过夜，使用保存液稀释至工作液。

优选的，所述的多聚赖氨酸基质相同磷酸盐缓冲溶液PH值均为5-9。

优选的，所述的牛血清白蛋白浓度为0.10-2.65g/L；所述的非还原性糖浓度为10-20g/L；所述的鱼皮明胶浓度为1-4g/L；所述的防腐剂浓度为0.2-5ml/L；所述的嫩叶绿色素浓度为0.1-0.5g/L；所述的聚乙二醇浓度为10-50g/L；所述的酪蛋白浓度为0.1g-1g/L；所述的4-氨基安替比林浓度为0.1g-1.5g/L；所述的氯化钠浓度为10g-30g/L；所述的表面活性剂含量0.005-1.2wt％。

优选的，所述的阻断剂为1％-5.1％浓度的过氧化氢溶液。

优选的，所述的试剂A液、试剂B液、试剂C液、试剂D液、试剂E液、试剂F液和试剂G液均在2-8℃的环境中进行保存。

为实现上述目的，本发明还提供如下技术方案：一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒的使用方法，其步骤为：

S1试剂盒从冷藏环境中取出后，在室温放置15－30min后再进行使用；

S2白片制作：

(1)将含有标本的细胞保存液瓶置于样本振荡器上振荡，振荡不少于1min；

(2)在制片仓内加入稀释液；

(3)在制片仓内加入标本后静置；

(4)倒去制片仓内细胞残留液，拧开制片仓将玻片取出，用流水冲洗玻片后，将玻片插入玻片架，放入95％乙醇中固定，随后取出玻片架，室温放置30-60min；

S3抗原修复：将白片放入PBST内水化，无磁口杯内放入适量抗原修复液，在高压锅中加入自来水至容器的1/4-1/3，然后将装有修复液的无磁口杯放入锅中，盖上锅盖及杯盖，电磁炉调至2100w加热7min，将电磁炉调至300w，打开锅盖及杯盖加入水化后的白片，盖上盖子，电磁炉上设置20min倒计时，计时完成后打开盖子自然冷却至修复液不烫手，纯水冲洗白片三次，拿出白片依次画圈，画圈完成后用PBST冲洗3次，每次2min；

S4阻断：将白片上的PBST甩去，每张滴一滴阻断剂，室温下孵育10min，孵育完成后PBST冲洗3次，每次2min；

S5一抗孵育：将白片上的PBST甩去，每张白片加一滴一抗，室温下孵育35min，PBST冲洗3次，每次2min；

S6二抗孵育：将切片上的PBST甩去，每张白片加一滴二抗，室温下孵育20min，PBST冲洗3次，每次2min；

S7 Fast Red显色：将白片上的PBST甩去，每张白片加60ul Fast Red显色剂，室温下孵育10min，PBST冲洗3次，每次2min；

S8加酶：在空白孔除外的每孔加入辣根过氧化物酶50μL；

S9 DAB显色：将白片上的PBST甩去，每张白片加60ul DAB显色剂，室温下孵育5min，PBST冲洗3次，每次2min；

S10苏木素复染及返蓝:将白片上的PBST甩去，每张滴加4-6滴苏木素，室温孵育1-5min，纯水洗净残留苏木素，放入装有EDTA的容器中返蓝3min，返蓝结束后置于纯水中；

S11湿封及镜检：白片从纯水中取出，在湿润的切片上加入一滴水性封片剂封片，自然晾干或烘箱内烘干，随后诊断医生显微镜下诊断判读；

S12判读指南：检测的判读不依赖于细胞形态学，细胞质染色为棕色，核染色为红色，p16棕色信号和Ki-67红色信号共同定位于同一细胞内，则为阳性，细胞核棕色则为P16单阳性；细胞核红色，细胞质浅蓝色则为ki67单阳性；细胞核为蓝色则为双阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明试剂盒以多聚赖氨酸为支撑骨架，复合抗体和信号标记物形成赖氨酸多聚抗体，其携带大量的信号标记物极大的提高了信号强度，降低了抗体使用浓度、避免非特异信号干扰。同时，高分子复合物与酶是多位点结合，为酶的天然三维构象提供了稳定的支撑，大幅度维持了酶和抗体的稳定性，实现大分子之间的高效键合。本发明试剂盒极大的减少了抗体用量，减少了操作流程和时间。返蓝方式独创，且封片方法更简单，时间较罗氏大大简短。

附图说明

图1为本发明的细胞染色显微镜图；

图2为本发明的P16单阳性状态细胞核和细胞质染色图；

图3为本发明的ki67单阳性状态细胞核染色图；

图4为为本发明的阴性细胞染色图；

图5为本发明的组织染色图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒，包括即用型抗体工作液、试剂C液、试剂D液、试剂E液、试剂F液和试剂G液；

即用型抗体工作液：包括试剂A液和试剂B液。成分为抗体试剂、牛血清白蛋白、非还原性糖、鱼皮明胶、防腐剂proclin-950、嫩叶绿色素、聚乙二醇、酪蛋白、表面活性剂、4-氨基安替比林和氯化钠；

试剂A液：P16INK4a抗体与Ki-67抗体组合成的混合一抗；

试剂B液：HRP标记的羊抗鼠多聚物偶联二抗与AP标记的羊抗兔多聚物偶联二抗组合成的混合二抗；

试剂C液：阻断剂；

试剂D液：二氨基联苯胺；

试剂E液：使试剂D液显色的缓冲液；

试剂F液：核固红色原；

试剂G液：使试剂F液显色的缓冲液。

所述的试剂A液为p16INK4a单克隆抗体和Ki-67单克隆抗体的Tris缓冲溶液。

所述的Tris缓冲溶液的pH值为7.19～7.81，其中，p16INK4a抗体浓度为0.09-1.5mg/L；Ki-67抗体浓度为0.09-1.5mg/L。

所述的试剂B液中HRP标记的羊抗鼠多聚物偶联二抗组合成的混合二抗为将多聚赖氨酸溶于磷酸盐缓冲溶液中加入适量高碘酸钠进行氧化，用多聚赖氨酸基质相同磷酸盐缓冲溶液进行透析过夜，水溶辣根过氧化物酶加入适量高碘酸钠氧化，使用乙二醇终止反应透析过夜；将氧化多聚赖氨酸和羊抗鼠p16INK4a抗体和活化后辣根过氧化物酶混合反应后透析过夜，使用保存液稀释至工作液。

所述的试剂B液中AP标记的羊抗兔多聚物偶联二抗为将多聚赖氨酸溶于磷酸盐缓冲溶液中加入适量高碘酸钠进行氧化，用多聚赖氨酸基质相同磷酸盐缓冲溶液进行透析过夜，水溶碱性磷酸酶加入适量高碘酸钠氧化，使用乙二醇终止反应透析过夜；将氧化多聚赖氨酸和羊抗兔ki67抗体和活化后辣根过氧化物酶混合反应后透析过夜，使用保存液稀释至工作液。

所述的多聚赖氨酸基质相同磷酸盐缓冲溶液PH值均为5-9。

所述的牛血清白蛋白浓度为0.10-2.65g/L；所述的非还原性糖浓度为10-20g/L；所述的鱼皮明胶浓度为1-4g/L；所述的防腐剂浓度为0.2-5ml/L；所述的嫩叶绿色素浓度为0.1-0.5g/L；所述的聚乙二醇浓度为10-50g/L；所述的酪蛋白浓度为0.1g-1g/L；所述的4-氨基安替比林浓度为0.1g-1.5g/L；所述的氯化钠浓度为10g-30g/L；所述的表面活性剂含量0.005-1.2wt％。

所述的阻断剂为1％-5.1％浓度的过氧化氢溶液。

所述的试剂A液、试剂B液、试剂C液、试剂D液、试剂E液、试剂F液和试剂G液均在2-8℃的环境中进行保存。

基于上述内容，本发明的试剂盒中，

试剂A液为1.5-6.4ml P16INK4a抗体与Ki-67抗体组合成的混合一抗；

试剂B液为1.5-6.4ml HRP标记的羊抗鼠聚合物偶联二抗与AP标记的羊抗兔聚合物偶联二抗组合成的混合二抗；

试剂C液为1.5-6.4ml阻断剂；

试剂D液为0.1ml-0.44ml二氨基联苯胺(DAB浓缩显色液)；

试剂E液为2-8.8ml使试剂D液显色的缓冲液(DAB底物缓冲液)；

试剂F液为0.03ml-0.132ml核固红色原(Fast Red浓缩显色液)；

试剂G液为2-8.2ml使试剂F液显色的缓冲液(Fast Red底物缓冲液)。

一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒的使用方法，其步骤为：

S1试剂盒从冷藏环境中取出后，在室温放置15－30min后再进行使用；

S2白片制作：

(1)将含有标本的细胞保存液瓶置于样本振荡器上振荡，振荡不少于1min；

(2)在制片仓内加入3mL稀释液；

(3)在制片仓内加入2.5mL标本后静置50min；

(4)倒去制片仓内细胞残留液，拧开制片仓将片子取出，用小流水稍稍冲洗玻片，后将玻片插入玻片架，放入新鲜的95％乙醇中固定30min，随后取出玻片架，室温放置30-60min(使玻片上的酒精挥发彻底)；

S3抗原修复(隔水修复)：将白片放入PBST内水化5min，无磁口杯内放入适量(约600ml)抗原修复液，在高压锅中加入自来水至容器的1/4——1/3，然后将装有修复液的无磁口杯放入锅中，盖上锅盖及杯盖，2100w加热7min，将电磁炉调至300w，打开锅盖及杯盖加入水化后的白片，盖上盖子，电磁炉上设置20min倒计时，计时完成后打开盖子自然冷却至修复液不烫手。纯水冲洗白片三次，拿出白片依次画圈，画圈完成后用PBST冲洗3次，每次2min；

S4阻断：将白片上的PBST甩去，每张滴一滴阻断剂，室温下孵育10min，孵育完成后PBST冲洗3次，每次2min；

S5一抗孵育：将白片上的PBST甩去，每张白片加一滴一抗，室温下孵育35min，PBST冲洗3次，每次2min；

S6二抗孵育：将切片上的PBST甩去，每张白片加一滴二抗，室温下孵育20min，PBST冲洗3次，每次2min。

S7 Fast Red显色：将白片上的PBST甩去，每张白片加60ul Fast Red显色剂，室温下孵育10min，PBST冲洗3次，每次2min。

S8加酶：在空白孔除外的每孔加入辣根过氧化物酶50μL(Fast Red现配现用：FastRed浓缩显色液和Fast Red底物缓冲液按照1:74配置)；

S9 DAB显色：将白片上的PBST甩去，每张白片加60ul DAB显色剂，室温下孵育5min，PBST冲洗3次，每次2min。(注：DAB现配现用：DAB浓缩显色液和DAB底物缓冲液按照1:19配置

S10苏木素复染及返蓝:将白片上的PBST甩去，每张滴加4-6滴苏木素，室温孵育1-5min，纯水洗净残留苏木素，放入装有EDTA的容器中反蓝3min，返蓝结束后置于纯水中。

S11湿封及镜检：白片从纯水中取出，在湿润的切片上加入一滴水性封片剂封片，自然晾干或烘箱内烘干，随后诊断医生显微镜下诊断。(注：封片剂在制片阶段就可放入45℃烤箱内预热，封片中白片需一张张从水中取出，不能干片)。

S12判读指南：检测的判读不依赖于细胞形态学，细胞质染色为棕色(p16)，核染色为红色(Ki-67)，p16信号(棕色)和Ki-67信号(红色)共同定位于同一细胞内，则为阳性(图3)，细胞核棕色则为P16单阳性(图2)，细胞核棕色则为P16单阳性。细胞核红色，细胞质浅蓝色则为ki67单阳性(图4)。细胞核为蓝色则为双阴性。组织染色见图5。

基于上述方法，抗原经一抗试剂(鼠源p16单克隆抗体和兔源Ki-67单克隆抗体混合物)进行孵育后，形成一抗与目标抗原的抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物中一抗分子再与二抗试剂(HRP标记的羊抗鼠多聚物二抗和AP标记的羊抗兔多聚物二抗混合物)进行孵育结合，进一步形成抗原-抗体-二抗的复合物，最后通过HRP催化DAB显色液在p16抗原位点上形成棕色沉积物，AP催化Fast Red显色液在Ki-67抗原位点上产生红色沉积物，通过光学显微镜观察评估染色结果。

通过上述试剂盒及使用方法的技术方案，本发明中采用多种组分保护的即用型试剂，在节省时间，操作方便，提高有效成分稳定性的同时，使即用型试剂中的有效成分可以长期稳定保存，使用多少滴加多少，避免浪费。宫颈脱落细胞白片经抗原修复处理后与一抗试剂进行孵育，形成一抗与目标抗原的抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物中一抗分子再与二抗试剂(HRP标记的羊抗鼠多聚物二抗和AP标记的羊抗兔多聚物二抗混合物)进行孵育结合，进一步形成抗原-抗体-二抗的复合物，最后通过HRP催化DAB显色液在p16抗原位点上形成棕色沉积物，AP催化Fast Red显色液在Ki-67抗原位点上产生红色沉积物。定位效果和显色效果好，标记更加明显。

同时以多聚赖氨酸为支撑骨架，复合抗体和信号标记物形成赖氨酸多聚抗体，其携带大量的信号标记物极大的提高了信号强度，降低了抗体使用浓度、避免非特异信号干扰。同时，高分子复合物与酶是多位点结合，为酶的天然三维构象提供了稳定的支撑，大幅度维持了酶和抗体的稳定性，实现大分子之间的高效键合。本发明试剂盒极大的减少了抗体用量，减少了操作流程和时间。返蓝方式独创，且封片方法更简单，时间较罗氏大大简短。本发明具有更高的显色效率和检测灵敏度。本发明可用于宫颈脱细胞,也可用作组织的染色。本发明返蓝方式新创，返蓝效果较市面其他厂家试剂盒效果更好，封片方式更简单，且大大缩短了实验时间。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。