使用光致发光无机纳米颗粒的毛细作用测试

摘要

本发明涉及一种用于通过毛细作用测试来检测和/或定量液体样品中感兴趣的生物或化学物质的体外方法，所述毛细作用测试使用式A1‑xLnxVO4(1‑y)(PO4)y(II)的光致发光无机纳米颗粒作为探针，其中Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铥(Tm)、镨(Pr)、钬(Ho)及其混合物；A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、镥(Lu)及其混合物；0

说明书

本发明涉及生物分析和体外诊断的领域。更特别地，本发明涉及一种用于通过毛细作用测试来检测和/或定量液体样品中感兴趣的生物或化学物质(例如蛋白质、抗体、毒素和其他化合物)的体外方法，该毛细作用测试使用具有受控的光学和物理化学特性的光致发光无机纳米颗粒作为探针。

毛细作用测试，诸如例如一般称为“条测试(strip test)”的侧流测定(LFA)，通常用于临床、药物、食品或化学分析的目的。它们可以用于检测许多类型的分析物，诸如抗体、抗原、蛋白质、生物标志物、化学分子、核酸等的存在([1])。当在侧流测定中使用的识别分子是抗体时，更通常将其称为“免疫色谱测定”(侧流免疫测定，LFIA)。

毛细作用测试因其使用简单、其速度快(检测时间小于或等于15分钟)以及其低成本而是特别有价值的。

一般地，用于毛细作用测试的装置采用以多孔固体载体(例如硝酸纤维素膜)形式用于毛细作用的器件(means)，在器件内沉积在固体载体一端的测试样品以及掺入在销售原样的装置中的试剂通过毛细作用迁移。

通常，用于毛细作用测试的装置的多孔固体载体包括标记区(英语术语为“结合垫(Conjugate Pad)”)，该标记区承载特异性结合与探针(或检测物质)缀合的待分析物质(或“分析物”)的呈液体形式、冻干或脱水的试剂；以及检测区(英语术语为“检测垫”)，在该检测区上固定特异性捕获分析物的试剂。

特异性结合分析物的试剂以冻干形式固定，但在湿润时变得在固体载体中移动。因此，当使固体载体与液体样品接触时，后者通过毛细作用在所述载体中迁移，从而夹带特异性结合缀合至探针的分析物的试剂。样品和特异性结合分析物的试剂通过毛细作用在固体载体中迁移直至承载对分析物具有特异性的固定的捕获试剂的检测区。

在最常见的“夹心”型毛细作用测试中，当与样品相遇时，缀合至探针的结合试剂与包含在样品中的分析物结合，并且然后通过捕获试剂将分析物固定在固体载体上。因此，通过检测经由分析物而固定在检测区的水平面处的探针，来测量样品中分析物的存在或不存在。

这些装置还包括相对于毛细流动方向位于检测区下游的所谓的对照区，其中固定对标记的靶向试剂具有特异性的第二捕获试剂。在迁移直至检测区之后，未与分析物反应的过量的与探针偶联的结合试剂迁移直至对照区，并与第二捕获试剂结合。因此，用户具有阳性对照，使样品和试剂在装置中的迁移得到验证，以及因而验证测试的适当操作。

因此，通过在检测区的水平面处以及任选地在对照区的水平面处检测探针的存在或不存在，来实现样品中分析物的确定。

毛细作用测试中最常使用的探针是金纳米颗粒([1],[2])。它们吸收对应于其表面等离激元频率的特征波长的光。纳米颗粒的表面等离激元频率取决于其尺寸和其聚集状态。当将金纳米颗粒固定在检测区和/或对照区的水平面处时，与纳米颗粒的表面等离激元的频率相关的吸收靠在一起，因此允许特征颜色，通常是赋予至所述区的肉眼可见的是蓝色/紫色。有利地，与常规免疫检测技术，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)所需的时间相比(通常对于ELISA测定需要几个小时)，这些测试允许快速地(通常在数分钟内)获得样品的分析结果。而且，它们不需要昂贵且庞大的设备来进行制备或分析。

然而，这些测试具有的主要缺点是具有低的检测灵敏度和差的定量限。因此，它们通常仅提供定性或半定量信息。特别地，这些条测试具有的检测灵敏度远低于可通过常规免疫检测测定(例如ELISA类型)获得的检测灵敏度。因此，基于金纳米颗粒的条测试通常使得可以检测到一些大约ng/mL的浓度，而ELISA测定允许检测到一些pg/mL，通常更灵敏2至3个数量级。例如，Cortez Diagnostics公司提供用于检测肌钙蛋白I(心肌梗死的生物标志物)的条测试，具有的灵敏度为1ng/ml([3])，而Abcam公司提供了具有的灵敏度为7pg/mL的ELISA测定(ab200016)。

为了提高条测试的灵敏度，换句话说，为了降低这些测定的检测限，在毛细作用测试中，已提出了多种材料，以及特别是修饰的金纳米颗粒、磁性颗粒、半导体纳米晶体或“量子点”、上转换发光材料、有机荧光团等作为金纳米颗粒的替代物来作为探针([1],[4])。

因此，已经探索了基于金纳米颗粒的若干种纳米材料作为用于毛细作用测试的装置的探针，例如诸如包括由涂覆有金纳米颗粒的Fe

与基于金纳米颗粒的测定相比，使用光致发光探针(以下也更简称为“发光探针”)，诸如有机荧光团和量子点使得可以增加毛细作用测试的灵敏度。实际上，光发射(发光)的检测通常比吸收的检测更灵敏(如在用金纳米颗粒的情况)，后者是针对透射光的更高背景进行的(例如，关于有机荧光团[9]、[10]和[11]；关于QD：[11]-[17]、[50])。

不幸的是，这些光致发光探针具有若干缺点，使得不能充分利用其在条测试中作为探针的潜力。在这些缺点中，我们可以提及例如在有机荧光团的情况下的光漂白现象，在由照明引起的不可逆的结构变化之后，该现象反映在荧光的消失中，或另外是半导体纳米晶体或“量子点”发射的闪烁现象，然后探针周期性地停止发射，并且因此它们不适合产生恒定的可再现的信号。其他缺点例如由发光探针的发射光谱的宽度引起。实际上，太宽的发射光谱使得难以过滤可能存在的任何背景信号，并且这影响信号的品质，并且特别是信噪比。除了有助于生物测定中探针效率的光学因素之外，还必须考虑探针的实际特征和易用性。因此，某些颗粒(如用半导体纳米晶体的情况)在冷冻之后失去其发光特征，这表示生物缀合的半导体纳米晶体存储的缺点。探针容易与允许靶向期望分子的分子化合物偶联也是选择合适的探针时要考虑的方面。因此，在有机溶剂中合成了一定数目的颗粒，包括半导体纳米晶体。于是，用于生物学应用需要表面制备的额外的步骤以将这些颗粒分散在水中，该过程实施起来可能复杂，并且随着时间的推移不稳定([18])。实际上，用于半导体纳米晶体的表面官能化不涉及与纳米晶体表面的共价键合。因此，官能化分子可能变为分离的，并引起特异性结合用作探针的纳米晶体的分析物(抗体或一些其他)的试剂的解离。因此，取决于官能化的类型，这些纳米晶体与分析物的特异性结合试剂的缀合可能耗费数周至数月。然而，毛细作用测试的商业用途要求在探针结合试剂缀合物沉积在测试条上之后，大约两年的稳定性。

这些发光探针的其他缺点是用于检测发光所需的激发可引起杂光的发射，其具有的结果是增加了背景信号并因此降低了信噪比。已经提出了各种方法来消除或至少减小来自寄生发射的这种信号，诸如，例如，使用包含镧系元素离子的螯合物或络合物的发光纳米颗粒，与延迟的发光检测组合；上转换纳米颗粒；或另外具有持续发光的纳米颗粒。

因此，已经提出了负载有镧系元素的螯合物或络合物的发光颗粒作为毛细作用测试中的发光探针。

例如，Zhang et al.([19])提出使用负载有镧系元素(Eu)螯合物的二氧化硅纳米颗粒作为在迁移条测试中用于检测细菌玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)(Pss)的探针。据指出，这些探针使得可以获得检测限是用常规测定使用金颗粒可获得的检测限的1/100。此外，Xia et al.([20])在侧流测定中使用负载有铕螯合物的二氧化硅颗粒来检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。

我们也可以引用Liang et al.([21])和Juntunen et al.([22])的著作，他们提出在侧流测定中使用负载有铕螯合物的聚苯乙烯微粒，用于检测血清样品中的甲胎蛋白(AFP)，或另外用于检测前列腺特异性抗原(PSA)和生物素化的牛血清白蛋白(生物素-BSA)。文档WO 2013/013214和WO 2014/146215还提出了在侧流测试条中使用负载有铽和/或铕的螯合物的聚苯乙烯纳米球作为探针。

在文档WO 2014/146215中还已经提出了利用包含镧系元素离子的螯合物或络合物的这些纳米颗粒的长寿命发射(大约100μs)以实现延迟的检测，使得可以避免其寿命一般为大约1-10ns的寄生发射。

然而，用作发光探针的负载有镧系元素的螯合物或络合物的发光颗粒通常每种螯合物或络合物仅包含单一镧系元素离子。每种螯合物或络合物占据纳米颗粒或微粒内不可忽略的空间，这限制了对于给定粒度相应地发射离子的数目。例如，45nm的纳米颗粒仅包含大约1000个螯合物和发射离子[47]。而且，包含镧系元素离子的络合物或螯合物的这种类型的颗粒的合成包括至少两个步骤：络合物或螯合物的合成，以及然后是包含螯合物的颗粒的合成。因此，这种类型的颗粒的合成是复杂的并因此相对昂贵。最后，这种类型的颗粒的稳定性也受到质疑([23])。

近年来，已提出了其他类型的基于稀土元素的发光纳米颗粒作为发光探针在生物成像以及特别是在毛细作用测试中应用：这些是上转换发光材料的纳米颗粒，在由红外源或近红外源的激发下发射可见光(例如[24]-[29])。在使用这些上转换纳米颗粒的背景下，两个光子在观察到发光发射之前被纳米颗粒吸收，这对应于检测到的信号。作为实例，我们可以提及Niedbala et al.([30])的著作，其提出了使用UPT类型的探针(“上转换发光材料技术”)的侧流测定条，允许达到比酶联免疫吸附测定更高的检测灵敏度。这种上转换发光探针用于例如在文档US 2014/0170674中提出的用于侧流测定的装置。

特别地，这些上转换发光材料具有与上述发光探针相比的如下优点：它们显示出对光漂白现象的抵抗，并且它们具有低水平的引起背景噪声的寄生荧光。实际上，由于激发是在比检测波长低的波长下发生的，因此实际上不存在由于样品中所包含的辅助物质或多孔固体载体引起的发射。

不幸的是，这些上转换发光材料具有的主要缺点是它们具有低量子产率，并且对于激发源的低光功率密度，它们的效率相当大地降低，发光与激发功率密度的平方成比例。而且，必须激发包括测试带以及任选地对照带的相当宽的区，这降低了对于给定功率的激发功率密度。因此，使用这种发光探针读取测试需要将用于激发的激光二极管与其他元件，诸如透镜、滤波器、光电倍增管、前置放大器等组合的复杂的设备。

最后，还已经提出了发射持续发光的无机纳米颗粒，以避免由激发引起的寄生发光。这些无机纳米颗粒由包含镧系元素离子作为掺杂剂的结晶基质形成。具有持续发光的纳米颗粒的特定的特征在于掺杂剂在晶体的电子结构中引入了陷阱态，并且激发的电荷被捕获在那里。因此，这些纳米颗粒的发光发射只能在电荷从这些陷阱态释放之后发生，所述释放是通过热活化发生的([31])。取决于电子结构中这些陷阱态的能量，即取决于陷阱的深度、热激活，并且因此发射的寿命可能达到数小时或甚至数天。因此，可以激发纳米颗粒，然后在激发停止之后将毛细作用测试装置插入合适的读取器中，以及在不存在激发以及因此不存在寄生发射的情况下，通过检测发光来读取测定。例如，Paterson et al.([32])获得的检测灵敏度相对于用金纳米颗粒获得的检测灵敏度显著改进(检测限是用金纳米颗粒获得的检测限的约1/10)。这也使得不必要使用发射滤波器来读取。

然而，这种系统具有的缺点是它需要长的来自发射的信号的采集时间。实际上，由于这些纳米颗粒的发射发生持续若干分钟，特别是若干小时或甚至数天(取决于环境)，因此有必要等待与此寿命相等，以收集发射的光子数目的不可忽略部分。因此，在单位时间内，例如每秒，发射的光子数目将很低，因此需要延长发光的采集时间以达到高水平的灵敏度。这样的采集时间与毛细作用测试的目的对立，毛细作用测试的目的是提供快速诊断。为了抵消该问题，可以增加激发功率；然而，这涉及复杂的设备，这将不满足对紧凑且廉价的测定系统的要求。

最后，在毛细作用测试的其他变型中采用用铕和铋共掺杂的YVO

因此，迄今提出的用于毛细作用测试的探针均不完全令人满意。特别地，仍然需要与用于毛细作用测试装置中兼容的探针，使得该探针可以组合以下优点：探针是非常发光的、复杂度低且合成廉价，其提供了比基于金纳米颗粒的毛细作用系统多得多灵敏的检测，具有用肉眼或读取器读取的紧凑且廉价的系统。

本发明精确具有的目的是提出可以用于毛细作用测试且满足这种需求的新的发光探针。

更特别地，本发明提出在通过毛细作用测试的分析方法中使用掺杂有稀土元素离子的发光纳米颗粒作为探针，所述纳米颗粒具有受控的光学和物理化学特性。

因此，本发明描述了一种用于通过毛细作用测试来检测和/或定量液体样品中感兴趣的生物或化学物质的体外方法，所述毛细作用测试使用下式(I)的光致发光无机纳米颗粒作为探针：

(A

其中：

-M表示能够与氧(O)结合以形成结晶化合物的一种或多种元素；

-Ln对应于一种或多种发光镧系元素离子；

-A对应于形成结晶基质的部分的一种或多种离子，其电子能级不涉及发光过程；

-0

-p、q和a的值是使得遵守(A

所述方法采用在单光子吸收之后的所述纳米颗粒的发光检测，所述纳米颗粒具有的发射寿命短于100ms。

更特别地，根据本发明的第一方面，本发明涉及一种用于通过毛细作用测试来检测和/或定量液体样品中感兴趣的生物或化学物质的体外方法，所述毛细作用测试使用下式(II)的光致发光无机纳米颗粒作为探针：

A

其中：

.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、镥(Lu)及其混合物；

.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铥(Tm)、镨(Pr)、钬(Ho)及其混合物；

.0

.0≤y<1，特别是y具有的值为0；

所述方法采用通过在小于或等于320nm的波长下激发基质，在单光子吸收之后的所述纳米颗粒的发光检测，所述纳米颗粒具有的发射寿命短于100ms。

特别地，发光检测通过在小于或等于300nm，特别是在250与300nm之间的波长下激发基质AVO

根据本发明的方法，检测的信号因此对应于在吸收单光子之后的光致发光纳米颗粒的发光发射，换句话说，在大于激发波长的波长下的发射。在吸收单光子之后的发光发射与用于两光子吸收的颗粒的发光发射的检测的情况特别地不同，如上述的“上转换”颗粒的情况。

用能够识别待分析物质的识别分子(抗体、核酸、肽、适配体等)将这些纳米颗粒官能化，如下文所述。

在本发明的意义上，样品中物质的“分析”涵盖检测或定性表征所述物质的存在或不存在的方面，以及确定或定量表征所述物质的方面。

液体样品特别地可以是生物样品，特别是任何生物流体或体液。它可以是取自人的样品，例如选自血液、血清、血浆、唾液、咳出物、鼻涂片、尿液、稀粪便物、阴道涂片或脑脊液。

它也可以是包含生物分子、化学分子或致病病毒或细菌的溶液，例如诸如环境样品或来自农产品和食品产品的样品。

本发明的方法可以特别是用于检测和/或定量样品，特别地生物样品中的分子、蛋白质、核酸、毒素、病毒、细菌或寄生虫。

例如，它可用于检测生物样品中的生物标志物、抗体、DNA和/或RNA、免疫球蛋白(IgG、IgM等)、抗原的存在，并且抗原也可以是组成病毒、细菌或寄生虫的生物分子。

例如，它也可以是科学警方调查感兴趣的分子，例如非法化学物质，诸如毒品或用于防御的感兴趣的物质(生物恐怖主义剂)。

它也可以是用于食品安全的感兴趣的物质(致病菌，诸如沙门菌属(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)或大肠埃希菌(Escherichia coli)，或病毒，诸如诺如病毒(norovirus)或变应原)或用于环境的感兴趣的物质，例如污染物(杀有害生物剂)。

根据本发明我们旨在通过毛细作用测试来分析的感兴趣的生物或化学物质在下文中通过“待分析物质”或“分析物”的表达来更简单地表示。

在若干方面，在毛细作用测试装置中，例如诸如在测试条中，使用根据本发明的发光无机纳米颗粒作为探针证明是特别有利的。

首先，在下文中更精确地描述的根据本发明采用的式(A

而且，这些纳米颗粒在冷冻之后不会失去其发光。

例如，Riwotzki et al.([45])和Huignard et al.([46])已详细描述了基于掺杂有稀土元素的钒酸钇的纳米颗粒。对于文档EP 1 282 824，它描述了使用表面修饰的无机发光纳米颗粒作为用于检测生物物质或一些其他有机物质的探针。

然而，就发明人所知，从未提出过利用如上定义的，掺杂有稀土元素离子的光致发光无机纳米颗粒，这些纳米颗粒不同于具有持续发光的颗粒，并且在吸收单光子之后发射，以用作毛细作用测试中的发光探针。

以任何方式不可预见的是，这些基于镧系元素离子的纳米颗粒可以用于检测和定量化学或生物物质，特别是在毛细作用测试中，以及此外，它们将导致在测试灵敏度方面的改进的性能。

实际上，除了不存在闪烁之外，认为基于稀土元素的纳米颗粒的发光特性比量子点的发光特性差。在这些掺杂有稀土元素离子的纳米颗粒中，特别是由金属氧化物基质组成的那些纳米颗粒中，发光的激发可以通过基质的直接激发，或较不经常通过发光的稀土元素离子的可见中的直接激发来进行。一般地，直接吸收稀土元素离子的消光系数非常低，但是激发结晶基质的消光系数高很多([35])。

然而，结晶基质的吸收带通常位于UV中，这呈现出以下主要缺点：生物分子以及毛细作用装置的各个部件(例如，毛细扩散膜)在UV中也吸收强烈。例如，在基于钒酸根离子VO

与所有预期相反，发明人发现，即使在UV下激发，以及特别地在小于350nm，有利地小于320nm，更有利地在250与320nm之间以及特别是在250与300nm之间激发的条件下，也可以在毛细作用测试类型的体外诊断技术中使用根据本发明的这些基于稀土元素的光致发光纳米颗粒作为探针。

不希望受理论的束缚，发明人发现，尽管存在来自寄生发射的强信号，但在毛细作用测试中检测到在UV下激发的纳米颗粒的发光被证明是可能的，归因于特定于采用的纳米颗粒的以下三种光学特性：i)本发明的纳米颗粒中包含的大量的发光镧系元素离子，而不必要具有求助于非常大的尺寸的纳米颗粒；ii)稀土元素离子的发射光谱窄，这使得可以有效地消除寄生发射，寄生发射一般地在光谱上非常宽，以及iii)大的斯托克斯位移(Stokesshift)(吸收峰与发射峰之间的位移)，对于掺杂有Eu的YVO

因此，可以获得寄生发射的有效消除，并以足以达到期望的检测灵敏度的信噪比采集信号。

而且，发现，与所有预期相反，连接到通常用于侧流测定的硝酸纤维素膜上的在小于320nm，以及特别是在280nm附近(钒酸盐基质的吸收峰位于那里)(参见图11(A))或在300nm处的激发引起寄生发射，远低于在380nm下的激发(参见图11(B))。已知螯合或络合镧系元素离子的分子通常在320nm([47])与400nm([48])之间吸收，使用在250与300nm之间，特别是在260与300nm之间吸收的基质提供了额外的优点。

特别地，除了在YVO

此外，如在下文给出的实施例中所说明的，本发明的方法使得在检测灵敏度方面可以达到的毛细作用测试的性能改进至少一个数量级，或甚至多得多。

特别地，它不仅使得可以定性分析(样品中存在或不存在分析物)，而且还使得可以半定量和定量分析。

因此，本发明进一步涉及如上定义的纳米颗粒作为毛细作用测试装置中的探针以增加所述毛细作用测试装置的检测灵敏度的用途。

可以在任何已知类型的毛细作用测试，例如侧流测定中采用光致发光纳米颗粒作为探针，无论它是如图2示意地示出的所谓的“夹心”测定，还是如图3所示的所谓的“竞争”测定。特别地，它们适合用于迄今提出的以金纳米颗粒作为发光探针的毛细作用测试装置中，而不必改变毛细作用测试装置的载体的特征。

特别地，如在下文给出的实施例中所说明的，根据本发明的光致发光纳米颗粒可以例如具有与金纳米颗粒的平均尺寸相似的平均尺寸，大约30至50nm，以及因此与适合于这种尺寸的颗粒的迁移的毛细作用器件，通常为硝酸纤维素膜相容。

替代地，根据本发明的光致发光纳米颗粒可以更大，从而使得可以优化发光信号。实际上，镧系元素离子的数目随纳米颗粒的体积而增加，以及因此发射的发光信号随球形颗粒半径的立方而增加。在这种情况下，侧流测定的迁移载体可以包含适应于所选纳米颗粒尺寸的孔。具有可变孔径的膜例如是可商购的(例如，由MerckMillipore公司以参考号HF075、HF090、HF120、HF135、HF180出售的具有可变孔径的膜)。

较大的纳米颗粒可以例如通过对如所例示的颗粒离心以对尺寸进行分选仅保留在尺寸分布中最大尺寸的颗粒而获得，或者可以通过研磨本体材料而获得。也可以使用本领域技术人员已知的任何其他技术。

而且，如在实施例中所说明的，在保持与金颗粒的粒度相似的粒度的同时，本发明的纳米颗粒具有引起发光的大量的离子，特别是显著大于基于镧系元素的螯合物或络合物的颗粒的情况，以及因此使得可以产生高强度的发射信号，以及所以实现改进的灵敏度。

有利地，根据本发明的检测方法使得可以定性测量是采用金纳米颗粒作为探针的同一测定的检测限的最多达1/10，特别是最多达1/100，或甚至最多达1/1000。

最后，在毛细作用测试中使用根据本发明的纳米颗粒作为探针甚至导致与用负载有镧系元素的螯合物的颗粒所获得的结果相比的在灵敏度方面的改进的性能。

根据本发明的其他方面，本发明涉及一种用于检测和/或定量液体样品中感兴趣的生物或化学物质的毛细作用测试装置，所述装置包括如上定义的光致发光无机纳米颗粒作为探针。

因此，本发明更精确地涉及一种用于检测和/或定量液体样品中感兴趣的生物或化学物质的毛细作用测试装置，所述装置包括式A

因此，根据本发明的毛细作用测试装置包括式(II)的光致发光无机纳米颗粒，通过在小于或等于320nm，特别是小于或等于300nm，以及更特别是在250与300nm之间的波长下激发基质，在单光子吸收之后，所述纳米颗粒的发光被检测，所述纳米颗粒具有的发射寿命短于100ms。

更精确地，像在已知的用于侧流测定的装置中常规使用的探针，例如金纳米颗粒一样，根据本发明的光致发光纳米颗粒以与特异性结合待分析物质的至少一种试剂诸如抗体偶联的形式存在于，特别是称为“标记区”(英语术语更通常称为“结合垫”)的测定装置的区的水平面处。

下文参照如在图1中示意性地示出的迁移条型(由英语名称“Lateral FlowStrip”已知)的常规的毛细作用测试装置更特别地描述本发明。当然，本发明的方法可以采用毛细作用测试装置的任何其他变型，前提是它适合于使用本发明的光致发光纳米颗粒作为探针。

通常，根据本发明的毛细作用测试装置因此可以包括在基准方向上的用于毛细作用的器件，特别是多孔固体载体，诸如硝酸纤维素膜，包括：

-用于沉积液体样品的区；

-布置在该用于沉积样品的区的下游的区，称为标记区或偶联区，其负载有与对待分析物质具有特异性的至少一种“结合试剂”(识别分子)，例如抗体偶联的根据本发明的光致发光无机纳米颗粒(探针)；

-布置在该标记区的下游的反应区，也称为“检测区”，其中固定对待分析物质具有特异性的至少一种“捕获试剂”(识别分子)，诸如抗体；

-位于该检测区的下游的试剂迁移的对照区；以及

任选地，吸收垫，其布置在该对照区的下游。

在下文中将更详细地描述用于毛细作用测试的装置的实例。

可以使用根据本发明的毛细作用测试装置直接分析液体样品。根据本发明的方法的液体样品的分析通常包括：

(i)在毛细作用测试装置的沉积区的水平面处施加待分析的液体样品，以及任选地稀释剂；

(ii)孵育装置直到在反应区中检测到由光致发光纳米颗粒产生的发光为止和/或直到在迁移对照区中检测到发光为止；以及

(iii)读取和解释结果。

根据本发明的其他方面，本发明涉及根据本发明的毛细作用测试装置用于检测和/或定量液体样品，特别是生物样品中感兴趣的生物或化学物质的用途。

毛细作用测试装置可以偶联至提供测试结果的读取器。

如下文所详述的，读取结果包括检测由在毛细作用测试装置的检测区的水平面处，以及如果适用的话在对照区的水平面处固定的纳米颗粒产生的发光。

它更特别是通过以下进行：

-激发固定的光致发光纳米颗粒；以及

-检测发光发射。

特别有利地，仅使用合适的滤波器就可以用肉眼读取毛细作用测试装置。

替代地，可以使用简单的检测设备，例如使用发射滤波器和检测器，诸如摄影机的来读取发光。

发射滤波器可以是干涉滤波器，但也可以是简单的高通滤波器。实际上，归因于与这些颗粒的发射相关的大斯托克斯位移，通常具有小的斯托克斯位移的任何寄生发射将位于比这些纳米颗粒的发射更短的波长处。

最后，根据本发明的毛细作用测试装置适合用于多重检测，换句话说，通过相同的毛细作用测试用于同时检测同一样品中的若干种物质。

根据本发明的其他方面，本发明进一步涉及如上所定义的检测方法或如上所定义的毛细作用测试装置用于体外诊断的目的的用途。有利地，用根据本发明的毛细作用测试来检测生物样品中低含量的某些物质的可能性使得例如可以使用本发明的方法用于疾病的早期检测或疾病的进化或治疗性治疗的效果的诊断。

可以通过根据本发明的毛细作用测试来诊断的疾病不受限制，并且包括通过疾病的特定标志物、其中存在一种或多种特异性结合配偶体(配体、抗体、抗原、互补核酸、适配体等)的生物学感兴趣类型的分子(蛋白质、核酸、抗体等)的存在而显示的所有疾病。

作为实例，我们可提及感染性疾病(细菌、寄生虫或病毒，诸如AIDS)、炎性和自身免疫性疾病、心脏病、神经病或肿瘤病(例如，实体癌，诸如乳腺癌或前列腺癌)。

灵敏度的最大增加(增加100或1000倍)使得可以实现接近ELISA测定或ELISA变型之一的性能。因此，本发明的方法特别适合于当需要灵敏地检测ELISA类型但不可用时的情况。

因此，使得可以在护理点(POC)进行快速诊断。

因此，本发明的方法可用于诊断感染性疾病或其他常见疾病，例如在发展中国家、农村和/或边远地区，用于诊断感染性疾病或其他常见疾病。

在急诊护理(SAMU，SMUR急诊医疗服务)的背景下，特别是在当患者的生存可能处于危险(心力衰竭、静脉血栓形成、炎性综合征、全身性细菌感染(脓毒症)、急性胰腺炎)时的情况下，它也可以证明是特别有用的，以允许紧急诊断。在这样的情况下，它可以用于以与ELISA测定的灵敏度相当的灵敏度在到达医院之前进行快速测定，从而节省了患者的诊断和管理时间，以及因此提高了患者的生存机会。

而且，通过使用根据本发明的颗粒作为探针的毛细作用测试的诊断对于需要定期诊断测试以调节所给药的药品的剂量的患者特别地有用(例如在免疫调节剂或免疫抑制剂的情况下)。实际上，进行条测试而不是通过采集血液样品或其他更具侵入性的检查进行诊断，有利地使得可以提高患者的舒适度，降低诊断成本，更及时地进行检测/定量，以及因此允许更好地调节所给药的药品的剂量。

当然，本发明的方法不限于以上提及的应用。因此，它可以用于检测核酸(例如，种子中的GMO)，或用于检测环境中，例如，水中或旨在用于人或动物消耗的食物中的污染物或病原体。

因此，本发明的方法的应用可以从免疫学扩展到分子遗传学，或者扩展到DNA和RNA的检测。它可以用于标记其中将部分互补片段结合到纳米颗粒上的生物样品的一条或多条RNA链，以及然后按照类似于Affymetrix类型的DNA芯片的方法，通过在接枝在条底物上的其他区域的互补片段上的杂交来检测它们。本发明的一个优点是不存在这些方法通常所必需的扩增步骤。

本发明的方法还可以用于检测非法化学物质，例如毒品或警方或防御感兴趣的任何其他物质。

它也可以用于检测和/或定量农产品、食品产品或环境中的感兴趣的物质，特别是病原体。

通过阅读下文给出的出于说明目的而不是限制本发明的描述、实施例和附图，根据本发明的方法和毛细作用测试装置的其他特征、变型和优点将变得更加清楚。

在下文中，除非另有说明，否则表述“在……与……之间”，“范围从……至……”和“从……至……变化”是等同的，并且旨在表示包括该范围的极限。

除非另有说明，否则表达“包括一个/种(a)/一个/种(one)”应当理解为“包括至少一个/种”。

如上所述，本发明的方法采用具有特定光学和物理化学特性的光致发光无机纳米颗粒作为毛细作用测试装置中的探针。

本发明的光致发光纳米颗粒由掺杂有稀土元素离子的结晶基质形成。“结晶基质”是其中某些原子被称为“取代的离子”的其他原子替换的结晶固体的典型。取代的离子使得可以改变结晶基质的化学或物理特性，特别地赋予纳米颗粒光学发射的品质。

本发明的纳米颗粒中的稀土元素离子不呈稀土元素离子的络合物或螯合物的形式，后者是由稀土元素离子与合适的有机配体组合而形成的，例如在Yuan等人([36])的著作中所述。

本发明的纳米颗粒可以掺杂有相同性质或不同性质的稀土元素离子。

更特别地，它们可以是选自以下的镧系元素离子：铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、镨(Pr)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铈(Ce)、钬(Ho)、铽(Tb)、铥(Tm)及其混合物。

特别地，镧系元素离子可以选自Eu、Dy、Sm、Pr、Nd、Er、Yb、Ho、Tm及其混合物，特别是选自Eu、Dy、Sm、Yb、Er、Nd及其混合物，特别是选自Eu、Dy、Sm及其混合物，以及特别是Eu。

在根据本发明的毛细作用测试中用作探针的发光无机纳米颗粒更特别地具有下式(I)：

(A

其中：

-M表示能够与氧(O)结合以形成结晶化合物的一种或多种元素；

-Ln对应于一种或多种发光镧系元素离子；

-A对应于形成结晶基质的部分的一种或多种离子，其电子能级不涉及发光过程；

-0

-p、q和a的值是使得遵守(A

所述方法采用在单光子吸收之后的纳米颗粒的发光检测，纳米颗粒具有的发射寿命短于100ms，换句话说，在大于激发波长的波长下的发光检测。

A可以更特别是选自钇(Y)、钆(Gd)，镧(La)、镥(Lu)及其混合物；特别是，A表示Y、Gd或La，特别是Y或Gd；以及优选地，A表示Y。

特别地，上述式(I)中的M可以表示选自以下的一种或多种元素：V、P、W、Mo、As、Al、Hf、Zr、Ge、Ti、Sn和Mn。根据本发明使用的纳米颗粒的结晶基质可以掺入一种或多种类型的阴离子M

优选地，M表示选自以下的一种或多种元素：V、P、Al、Hf、Zr、Ge、Ti、Sn和Mn。

特别地，M可以表示V

根据特定的实施方式，上述的式(I)中的p不同于零。

作为实例，本发明的纳米颗粒可以具有式(I)，其中M表示V和/或P，p具有的值为1，使得所述纳米颗粒的基质A

根据其他特定的实施方式，本发明的纳米颗粒可以具有式(I)，其中M表示Hf或Zr、Ge、Ti、Sn、Mn，p具有的值为2，并且q具有的值为7，使得所述颗粒的基质为A

在其他实施方式实例中，M表示Al，A表示Y或Lu，p具有的值为5且q具有的值为12，使得所述纳米颗粒的基质A

在其他实施方式实例中，p具有的值为零，并且A表示Y或Gd，使得所述纳米颗粒的基质A

因此，根据变型实施方式，在毛细作用测试中使用的发光无机纳米颗粒具有式Gd

在这种变型实施方式的背景下，可以通过在小于250nm的波长下激发基质来检测发光[51]。

根据本发明的纳米颗粒的结晶基质，特别是金属氧化物基质的离子被稀土元素离子的取代度可以更特别是在10％与90％之间，特别是在20％与60％之间，特别是在20％与40％之间，以及更特别是40％。

选择这样高水平的掺杂是违反直觉的(counterintuitive)。实际上，一般而言，掺杂有稀土元素离子的发光纳米颗粒的掺杂的通常水平保持在小于10％的值，以避免在较高浓度下发生“猝灭”效应([42]-[44])。

有利地，如下文更详细描述的，根据本发明的纳米颗粒的不完美结晶性允许避免“猝灭”效应。

根据本发明的光致发光纳米颗粒的其他特征，它们能够在吸收单光子之后发射发光，这对应于检测到的信号。

而且，与所谓的具有持续发光的纳米颗粒([32])相比，本发明的纳米颗粒的发光发射不涉及“陷阱”态。

因此，本发明的纳米颗粒具有的发光发射寿命短于100ms，换句话说，严格小于100ms([35]、[39]、[49])。

发射寿命应当理解为发射纳米颗粒，以及更特别是发射稀土元素离子的激发态的寿命，并且发射寿命实际上是由激发停止后的发光发射光子的持续时间或激发停止后发光的指数式衰减的特征时间决定的。

发射纳米颗粒的发射寿命不同于纳米颗粒的光降解或光漂白之前的发光发射时间。

更特别地，根据本发明使用的纳米颗粒具有的发射寿命小于100ms，或者甚至小于10ms，或者甚至小于1ms。

有利地，根据本发明使用的纳米颗粒具有的发射寿命大于或等于5μs，特别是大于或等于10μs，特别是大于或等于20μs，或者甚至大于或等于50μs。

可以利用本发明的颗粒的发射寿命(与通常的荧光团的纳秒级寿命相比，在Y

根据变型实施方式，根据本发明使用的光致发光纳米颗粒可以具有下式(II)：

A

其中：

.A选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)、镥(Lu)及其混合物，特别是A表示Y；

.Ln选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、钕(Nd)、铒(Er)、镱(Yb)、铥(Tm)、镨(Pr)、钬(Ho)及其混合物，优选地Ln表示Eu；

.0

.0≤y<1，特别是y具有的值为0；

所述方法采用在单光子吸收之后的来自纳米颗粒的发光检测，纳米颗粒具有的寿命短于100ms。

根据特定的实施方式，根据本发明使用的纳米颗粒对应于上述的式(II)，其中y具有的值为0。换句话说，纳米颗粒可以具有式A

在上述的式(II)或(III)中，A可以更特别地选自钇(Y)、钆(Gd)、镧(La)及其混合物。特别地，A表示Y或Gd。根据特定的实施方式，上述的式(II)或(III)中的A表示钇(Y)。

在上述的式(II)或(III)中，Ln可以更特别地选自铕(Eu)、镝(Dy)、钐(Sm)、镱(Yb)、铒(Er)、钕(Nd)及其混合物。特别地，Ln选自Eu、Dy、Sm及其混合物。根据其他特定的实施方式，上述的式(II)或(III)中的Ln表示Eu。

因此，根据变型实施方式，根据本发明作为发光探针使用的纳米颗粒具有式Y

根据变型实施方式，在允许相应的电子跃迁的情况下，可以利用稀土元素离子的直接吸收。在这些情况下，直接吸收比当相应的电子跃迁被禁止时更强，即使它通常保持比氧化物基质的吸收更弱。适用于这种情况的稀土元素离子的两个实例是Eu

根据本发明使用的光致发光纳米颗粒可以具有的平均尺寸大于或等于5nm且严格地小于1μm，特别是在10nm与500nm之间，优选地在20nm与200nm之间，以及特别是在20nm与100nm之间。

因此，根据本发明使用的光致发光纳米颗粒具有足够的体积以包含大量的稀土元素离子，以及因此发射足够的发光信号以允许检测低浓度的分析物。

优选地，本发明的纳米颗粒包括至少10

作为实例，具有直径为30nm的Y

平均尺寸可以通过透射电子显微镜测量。来自透射电子显微镜的图像使得可以确定纳米颗粒的形状(球形、椭圆形)并推断出纳米颗粒的平均尺寸。在总体上为球形的颗粒的情况下，平均尺寸意指颗粒的平均直径。在椭圆形形状的颗粒的情况下，平均尺寸意指与椭圆体体积相同的球体的平均尺寸。通常假设椭圆体的第三轴(在2D投影的透射图像中不可见的)的长度等于最小尺寸的轴。

根据特定的实施方式，本发明的纳米颗粒为细长的(扁长的)总体上椭圆形的形状。

它们可以更特别是具有称为a的长轴长度，在20与60nm之间；以及称为b的短轴长度，在10与30nm之间。特别地，本发明的纳米颗粒可以具有的长轴长度a的平均值为40nm以及短轴长度b的平均值为20nm。

有利地，根据本发明使用的纳米颗粒具有低多分散性。从动态光散射的测量结果可以推导出的多分散性指数严格地小于0.2是优选的。当在颗粒的合成或官能化结束时不是这种情况时，可以通过离心或通过本领域技术人员已知的任何其他技术对尺寸进行分选来获得较低的多分散性。

根据特定的实施方式，使用稀土元素离子例如用铕(Eu)掺杂的水平乘以纳米颗粒发射的量子效率的积最大化。

使用Ln离子的强掺杂，例如在0.2与0.6之间，以及特别是0.4，可以使用Ln离子的掺杂水平x乘以量子效率的积最大化，但是不降低量子效率，特别是通过限制掺杂离子之间的转移过程，导致浓度消光。特别地，为了维持高量子效率，纳米颗粒具有不完美的结晶性。实际上，优异的结晶性促进掺杂离子之间的转移过程，尤其当后者靠在一起时(如是高水平掺杂的情况)，以及因此通过与表面和溶剂的存在相关的非辐射过程促进离子的去激发过程。特别地，在室温下或至少在不超过600℃的温度下合成的方法对于这些纳米颗粒所需的不完美结晶性是有利的。

当通过X射线衍射图在至少一个给定晶向上确定的相干长度小于该方向上的粒度(如从透射电子显微镜图像所测量的)的80％时，纳米颗粒的结晶性被认为是“不完美的”。可以考虑不完美结晶性的不同类型：多晶性、缺陷、孔隙率等。

有利地，根据本发明使用的纳米颗粒各自能够在发射停止之前发射多于10

有利地，根据本发明使用的纳米颗粒显示出在溶液中良好的胶体稳定性。

纳米颗粒在溶液中的稳定性对于满足基于使用这些颗粒作为毛细作用测试装置中的探针的检测的结果的再现性方面的要求特别具有决定性。

特别地，纳米颗粒的良好的胶体稳定性使得可以在液体样品在毛细作用测试的多孔载体中迁移期间确保发光纳米颗粒(如果适用的话，结合至待分析物质)迁移直至装置的检测区以及任选地直至对照区。

“ζ电位”是表示悬浮液稳定性的要素之一。例如，它可以使用来自Malvern公司的Zetasizer Nano ZS类型的设备直接测量。使用光学装置，这种设备测量随施加到颗粒上的电场而变化的颗粒的位移速度。

特别地，本发明的纳米颗粒在合成结束时在pH≥5下的水性介质中有利地具有小于或等于-28mV的称为ζ的ζ电位。特别地，纳米颗粒在pH≥6.5，特别是在pH≥7，以及特别是在pH≥8下的水性介质中具有的ζ电位ζ小于或等于–30mV。

称为ζ的“ζ电位”可以定义为在溶液的本体与颗粒的剪切平面之间存在的电位差。它表示悬浮液的稳定性。剪切平面(或流体动力学半径)对应于围绕颗粒的假想球体，其中当颗粒在溶液中移动时，溶剂与颗粒一起移动。ζ电位可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过在电场中颗粒随其增溶层的位移来确定。

在pH≥5下，纳米颗粒的小于或等于-28mV的这种负ζ电位，增加了纳米颗粒在水性溶液中相对于彼此的静电排斥现象，因此允许抑制絮凝现象。实际上，本领域技术人员凭经验已知，绝对值高的ζ电位，特别是高于28mV，通常允许在低离子强度的介质中抑制絮凝效应。

应当理解，在纯化颗粒的水性悬浮液之后以及因此对于具有严格地低于100μS.cm

根据特定的实施方式，归因于高ζ电位，根据本发明采用的发光纳米颗粒可以具有一种或多种表面分子，促进它们保持在悬浮液中。

根据特定的实施方式，根据本发明使用的纳米颗粒可以在表面上具有四烷基铵阳离子。例如，在以No.FR1754416提交的申请中描述了这种纳米颗粒及其合成方法。

作为实例，根据本发明使用的光致发光纳米颗粒可以具有式Y

根据本发明使用的纳米颗粒，特别是上述的式(II)的纳米颗粒，主要具有结晶和多晶性质，特别是具有通过X射线衍射推导出的平均晶粒尺寸在3与40nm之间。

根据本发明采用的具有掺杂有稀土元素离子的结晶基质的光致发光纳米颗粒可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法来制备。

特别地，它们可以通过胶体合成途径来制备。水性胶体合成的方法是本领域技术人员所熟悉的(Bouzigues et al.,ACS Nano 5,8488-8505(2011)[49])。在水性介质中的这些合成具有不需要溶剂转移的任何后续步骤的优点。

作为实例，式A

元素A和Ln的前体常规地可以呈所述元素的盐的形式，例如硝酸盐、氯化物、高氯酸盐或乙酸盐，特别是硝酸盐。当然，元素A和Ln的前体及其量以考虑纳米颗粒的期望性质的合适方式选择。

例如，式Y

对于根据本发明使用的光致发光纳米颗粒的这种胶体途径的合成方法描述于例如在以No.FR1754416提交的申请中。有利地，如在申请No.FR1754416中所述，可以在有效量的四烷基铵阳离子存在下进行共沉淀反应。

可以通过本领域技术人员已知的任何其他方法，例如通过研磨来完成根据本发明的发光纳米颗粒，特别是更大的尺寸，大于数十纳米的发光纳米颗粒的合成。

像在侧流测定装置中常规使用的探针一样，根据本发明采用的发光纳米颗粒与对待分析物质具有特异性的至少一种结合试剂偶联。

与发光探针偶联的结合试剂的功能以及因此性质的变化取决于如下文所详述采用的毛细作用测试，特别是侧流测定的性质，特别是取决于它是所谓的“夹心”测定还是“竞争”测定。

因此，“结合试剂”意指在“夹心”型测定的背景下能够与需要鉴定的感兴趣的生物或化学物质特异性结合，或在“竞争”测定的背景下，能够与需要其鉴定的感兴趣的生物或化学物质竞争的检测区的捕获试剂特异性结合的任何化学、生物化学或生物化合物。如下文所详述，结合试剂还能够与固定在用于侧流测定的装置的对照区中的第二捕获试剂特异性结合。

“结合(Bind)”或“结合(binding)”意指任何强键，例如共价键，或优选地，弱键集合，例如抗原/抗体类型。

当然，考虑样品中待分析物质，选择与根据本发明用作探针的发光纳米颗粒偶联的结合试剂的性质。

有利地，根据本发明使用的光致发光纳米颗粒完美地适合于多种生物靶向，具体结果取决于结合试剂或接枝在纳米颗粒表面上的试剂的性质。

结合试剂可以更特别是选自多克隆或单克隆抗体、抗体片段、纳米抗体、抗原、寡核苷酸、肽、激素、配体、细胞因子、肽模拟物、蛋白质、碳水化合物、化学修饰的蛋白质、化学修饰的核酸、靶向已知的细胞表面蛋白质的化学修饰的碳水化合物、适配体、蛋白质和DNA/RNA的装配体或用于标记HaloTag类型的氯代烷。也可以使用SNAP-Tag或CLIP-Tag类型的方法。

根据特定的实施方式，它是抗体或抗体片段、肽、化学修饰的核酸或适配体，特别是抗体。

合适的抗体片段包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，诸如简单可变结构域Fv、scFv、Fab、(Fab')

根据本发明的术语“抗体”包括嵌合抗体、人或人源化抗体、重组和修饰的抗体、缀合的抗体及其片段。

结合试剂也可以源自已知的结合细胞表面受体的分子。例如，靶向片段可以源自低密度脂蛋白、转铁蛋白、EGF、胰岛素、PDGF、血纤蛋白溶解酶、抗HER2、抗HER3、抗HER4、膜联蛋白、白介素、干扰素、红细胞生成素或集落刺激因子。

对于本领域技术人员高兴的是，采用合适的偶联/接枝方法来合适地制备与一种或多种结合试剂偶联的颗粒。用于发光纳米颗粒的表面官能化的一种或多种结合试剂的量考虑颗粒的量而调节。

通常，期望每个纳米颗粒与若干种结合试剂，优选地至少五种结合试剂，以及更优选至少十种结合试剂偶联。

结合试剂可以直接或通过间隔基(也称为“接头”)接枝至纳米颗粒上。

将颗粒与生物分子偶联(也称为接枝)的方法是本领域技术人员熟悉的。通常通过共价键、通过表面络合、通过静电相互作用、通过包封或通过吸附来偶联。

在某些情况，包括通过共价键偶联的情况下，可以预先用化学基团对颗粒进行官能化，然后该化学基团能够与结合试剂携带的其他化学基团反应以形成共价键。

作为可以存在于纳米颗粒表面上的化学基团的实例，我们可以提及羧基、氨基、硫醇、醛和环氧基团。

氨基基团可以由分子，诸如氨基有机硅烷，诸如氨基三乙氧基硅烷(APTES)提供。APTES的优点是它借助于共价键在纳米颗粒的周围形成胶囊。因此，由APTES提供的胺随时间推移非常稳定。氨基基团可以通过与琥珀酸酐反应而转化成羧基基团。

羧基基团可以由分子诸如柠檬酸或聚丙烯酸(PAA)提供。

羧基基团可以通过本领域技术人员已知的任何技术活化，特别是通过与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，然后与多肽的表面上的胺官能团反应并形成共价酰胺键(当结合试剂是蛋白质或抗体时)。

用APTES官能化纳米颗粒可以在用二氧化硅层涂覆纳米颗粒之后有利地进行。

在其他情况下，可以将颗粒预先与能够允许随后与结合试剂偶联的分子偶联。

例如，可以将颗粒与允许与生物素化的靶向剂偶联的链霉亲和素偶联。

作为实例，申请No.FR1754416阐明了通过将与链霉亲和素偶联的纳米颗粒与生物素化的抗体偶联来将纳米颗粒与生物素化的抗体偶联。它也可以通过将抗体偶联在如上所述的用APTES官能化的纳米颗粒上直接进行(氨基基团转化为羧基基团，活化羧基基团以及与抗体表面上的氨基基团直接反应)。

结合试剂在纳米颗粒表面上的偶联也可以通过本领域技术人员已知的任何其他方法进行。

它也可以通过用二氧化硅层涂覆纳米颗粒，紧接着涂层与APTES的反应来有利地进行，其胺官能团用于与包括两个NHS官能团的双官能间隔基剂反应。接下来，与双官能间隔基剂偶联的纳米颗粒可以与蛋白质(抗体、链霉亲和素等)表面上的胺官能团反应。这种类型的偶联方法特别地描述于Casanova et al.([38])和Giaume et al.([39])的著作中。

根据本发明的发光纳米颗粒的电荷及其表面的性质、其形状和其尺寸，还可以涂覆有下文称为“迁移剂”的剂，其有助于纳米颗粒在毛细作用测试装置，例如在硝酸纤维素膜内迁移。

本领域技术人员能够用一种或多种迁移剂适当地官能化纳米颗粒。特别地，应当理解，这种迁移剂必须不干扰如上所述的纳米颗粒与结合试剂的偶联，以及特别是后者的在毛细作用测试中与分析物或与分析物竞争的捕获试剂特异性结合的能力。

迁移剂可以特别是选自隐身剂(stealth agent)或钝化剂。

这样的剂可以是例如聚乙二醇(PEG)或聚(环氧乙烷)(PEO)的链，特别是硅烷化的；PEO-聚(环氧丙烷)-PEO；接枝有聚(L-赖氨酸)链的聚(环氧乙烷)的链(“聚(L-赖氨酸)-接枝的-聚(乙二醇)”(PLL-g-PEG))；接枝有聚(L-赖氨酸)的右旋糖酐的链；聚(对二甲苯)(聚对二甲苯)；泊洛沙姆(三嵌段共聚物，其中心部分为环氧丙烷嵌段，以及末端为聚环氧乙烷嵌段，例如由BASF公司以名称

优选地，迁移剂选自硅烷化的PEG链、泊洛沙姆和聚乳酸(PLA)。这些剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法沉积在纳米颗粒的表面上。例如，可以将它们吸附在其上或可以将它们共价固定在其上。

纳米颗粒与一种或多种迁移剂的偶联可以与纳米颗粒与一种或多种结合试剂的偶联同时进行，例如，当结合试剂与纳米颗粒的偶联通过在结合试剂的氨基基团上的反应发生时，通过选择携带氨基基团的迁移剂进行。在这种情况下，相对于结合试剂的量调节迁移剂的量，使得纳米颗粒在其表面上包括足够数目的迁移剂和结合试剂两者。

如上所述，根据本发明，采用如上所定义的光致发光纳米颗粒作为毛细作用测试中，例如在“侧流”测定中的探针。

术语“侧流”是指其中所有溶解或分散的化合物通过毛细作用，优选以当量速度和有规律的流速，通过扩散器件侧向地运输的液体流动。

本发明的方法可以用任何常规的毛细作用测试装置，例如已知用于金纳米颗粒类型的探针的毛细作用测试装置来实施。毛细作用测试装置可以特别假定为任何构造；因此，它可以具有线性、径向、T形、L形、十字形构造等。

在下文中，更特别是参考附图1至3和5，其涉及用于迁移条类型的侧流测定的装置。

而且，根据本发明使用的装置可以适应于“夹心”型测定，或者替代地，适应于“竞争”测定，如下文所详述的。

典型地，如图1所示，根据本发明的毛细作用测试装置，特别是用于侧流测定的装置，包括在基准方向(X)上的用于毛细作用的器件，特别是多孔固体载体(10)，包括：

-区(1)，用于沉积液体样品以及任选地稀释剂；

-区(2)，布置在沉积区的下游，称为“标记区”，其负载有与特异性结合待分析物质的至少一种试剂偶联的根据本发明的光致发光无机纳米颗粒(探针)；

-反应区(3)，也称为“检测区”，布置在标记区(2)的下游，其中固定对待分析物质具有特异性的至少一种捕获试剂；以及

-对照区(4)，位于检测区(3)的下游，其中固定对特异性结合分析物的试剂具有特异性的至少一种第二捕获试剂。

在“夹心”测定中，选择特异性地从检测区捕获分析物的试剂和与探针偶联的结合试剂以分别且特异性地与分析物，例如在分析物的两个不同的表位位点结合。

在“竞争”测定中，与探针偶联的结合试剂与分析物相同或相似，以用于结合与分析物竞争的检测区的捕获试剂。

迁移对照区(4)向用户指示至少部分样品已恰当地通过测定装置的多孔固体载体。

用于侧流测定的装置通常进一步包括吸收垫(5)，其布置在反应区和对照区的下游，其一端与多孔载体流体接触。吸收垫通过毛细作用保持迁移并接收过量的液体样品。

术语“上游”和“下游”是指测定中毛细流动的方向(X)，该迁移从沉积区(1)(在上游功能端)至检测区(3)发生，以及当存在吸收垫(5)时，在该吸收垫的水平面处(在下游功能端)结束。

用于侧流测定的装置的多孔固体载体的不同区中的每一个与相邻的一个或多个区流体连通。

两个元件之间的“流体接触”旨在表示像通常用于毛细作用测试的装置一样，这两个元件是物理接触的，以便允许液体从第一元件迁移到第二元件。优选地，通过使一个元件与另一个重叠来提供这种接触，如图1中示意性所示。

“用于毛细作用的器件”更特别地意指允许通过简单的毛细作用使液体迁移的多孔固体载体(10)。这种载体的孔隙率允许处于液体或湿润状态的样品和/或试剂的毛细流动(或侧向迁移)。多孔载体可以选自在已知的侧流测定装置中已经使用的载体。作为实例，它可以由硝酸纤维素、聚酯、玻璃纤维、纤维素纤维、聚醚砜(PES)、纤维素酯、PVDF等组成。

用于毛细作用的器件可以由一个或多个分开的部分组成，并且载体的不同部分可以由不同的材料组成。当用于毛细作用的器件由不同的部分或不同的材料组成时，这些元件被布置成以便允许用于毛细作用的器件中的毛细流动的连续性。

通常，用于毛细作用的器件由在毛细作用的方向(X)上伸长的多孔固体载体组成。

有利地，它是带或条形式的多孔载体(10)。特别地，它可以是由若干个叠加的或重叠的膜组成的免疫色谱条。

根据特定的实施方式，多孔载体是硝酸纤维素膜。作为硝酸纤维素膜的实例，我们可以提及膜Millipore

用于侧流测定的装置的多孔固体载体的尺寸可以变化。例如，它可以是具有的长度为30至200mm，优选地60至100mm，且宽度为2至10mm，优选地4至5mm的带。

根据本发明的用于侧流测定的装置可以例如由固定在刚性载体(6)上的色谱条组成。

刚性载体(6)可以由各种材料，诸如板、涂塑板或更优选地塑料组成。优选地，刚性载体由聚苯乙烯制成。

有利地，特定的材料对应于用于毛细作用的器件的每个区。

样品的沉积区(1)(英语术语也称为“样品垫”)可以有利地由吸收性多孔材料形成。实际上，用于毛细作用的器件的沉积区旨在接收液体样品，例如使其与尿液或血液样品的流接触。这种材料选自本领域技术人员已知的合适的吸收剂，并且已经在常规的侧流测定中使用。

如上所述的无机光致发光纳米颗粒(7)在用于毛细作用的器件的标记区(2)(英语术语也称为“结合垫”)的水平面处采用，如图2和3所示。

如上所述，这些纳米颗粒(7)与特异性结合待分析物质的至少一种试剂偶联。

在“夹心”测定的背景下，结合试剂能够在侧流测定期间与分析物特异性结合。例如，它可以是分析物的特异性抗体。

在常规的“竞争”测定的背景下，结合试剂能够与分析物竞争的检测区(3)的捕获试剂特异性结合。因此，结合试剂可以是例如分析物本身或合适的类似物。“合适的类似物”意指与特异性捕获分析物的试剂特异性结合的类似物。

与发光探针偶联的结合试剂还能够与固定在对照区中的第二捕获试剂(9)特异性结合。

优选地，如上所述，发光纳米颗粒在其表面上额外地具有旨在促进其在用于侧流测定的装置中迁移的至少一种剂，诸如隐身剂或钝化剂，例如聚乙二醇。因此，如果适用的话，这些剂将促进在多孔载体中，例如在硝酸纤维素膜中通过结合试剂与分析物结合的纳米颗粒的迁移，直到检测区(3)。

与特异性结合分析物的至少一种试剂偶联的无机光致发光纳米颗粒在干燥状态下被固定在用于毛细作用的器件中，但在湿润时它们通过毛细作用自由迁移。

因此，在测定期间，通过毛细作用迁移通过用于毛细作用的器件的样品夹带了与特异性结合待分析物质的试剂偶联的纳米颗粒。

将对待分析物质具有特异性的第一捕获试剂固定在根据本发明的用于侧流测定的装置的用于毛细作用的器件的检测区(3)(英语术语也称为“检测垫”)的水平面处。对于其与分析物特异性结合的能力以合适的方式选择它。

在“夹心”测定的背景下(图2)，检测区的捕获试剂可以具有与如上对于与光致发光纳米颗粒偶联所述的结合试剂相同的性质。例如它可以是对待分析物质具有强亲和力的抗体(8)。

在“竞争”测定的背景下，捕获试剂还能够结合至与发光探针偶联的结合试剂(例如与分析物相同或相似)。

分析物(11)和捕获试剂(8)通常形成配体/受体、抗原/抗体、DNA/RNA、DNA/DNA或DNA/蛋白质对。

因此，如果分析物是抗原或半抗原，则捕获试剂是例如分析物的特异性抗体，或者，如果分析物是抗体，则捕获试剂是被该抗体识别的抗原或特异性识别分析物的抗体。如果分析物是核酸，则捕获试剂是例如互补DNA探针。

捕获试剂以这样的方式沉积并固定在检测区的水平面处，使得它们在湿润时不能移动。这种固定可以通过本领域技术人员已知的技术，例如在硝酸纤维素或电荷修饰的尼龙的膜的情况下通过静电相互作用，或者在聚(偏二氟乙烯)(PVDF)或聚醚砜(PES)的膜的情况下通过疏水相互作用来进行。

根据特定实施方式，在用于毛细作用的器件上，检测区(3)可以包括用一种或多种捕获试剂功能化的空间上分开的一个或多个区域，例如呈带(一个或多个测试线“T”)的形式。在使用测定用于多重检测，换句话说，用于同时检测同一样品中的若干种物质的背景下，使用若干个“测试线”是特别感兴趣的。

毛细作用测试装置通常包括位于检测区(3)下游的用于确认测定的有效性的对照区(4)，其中固定对与探针偶联的结合试剂具有特异性的至少一种第二捕获剂(9)。

对于其与缀合至探针的结合试剂特异性结合的能力，适当地选择该第二捕获剂。在“夹心”型测定的背景下，它可以是例如用作特异性结合分析物的试剂的第二抗体或抗体的特异性抗原。

如与检测区(3)的第一捕获试剂一样，这种第二捕获试剂以在湿润时不移动的这样的方式固定在对照区(4)的水平面处。

用于毛细作用的器件可以任选地固定至通常由塑料制成的固体载体(6)，诸如板或盒上。

如图8示意性所示，根据本发明的毛细作用测试装置可以特别是包括其中放置测试条的箱(12)，所述箱优选地被封闭，除了在某些提供的开口的水平面处之外。特别地，在用于沉积样品的区的上方提供开口(14)。可以例如在检测区(3)和任选的对照区(4)的水平面处提供构成读取窗口(13)的其他开口。替代地，可以提供分别用于观察检测区和对照区的两个窗口。

替代地，为了使这些区可见，箱可以是透明的或者可以提供一个或多个透明部分。

当然，可以采用已知的用于常规毛细作用测试装置的装置的各种构造。例如，包括测试条的箱可以在顶面的水平面处包括至少一个中空间隙(relief)，其底部放置在条的表面上，形成用于沉积液体样品的孔(well)或空间。

根据本发明的方法的用于毛细作用测试的程序更特别是包括：

(i)在所述毛细作用测试装置的沉积区(1)的水平面处施加待分析的液体样品，以及任选地稀释剂；

(ii)孵育所述装置直到在所述反应区(3)中检测到由所述光致发光纳米颗粒产生的发光为止和/或直到在所述迁移对照区(4)中检测到发光为止；以及

(iii)读取和解释结果。

待分析的液体样品可以直接沉积在装置的用于毛细作用的器件的沉积区(1)上。

“液体样品”意指待分析物质呈溶液或悬浮液的任何样品。这种液体样品可以特别是任何生物流体或体液。液体样品也可以从生物流体或体液中获得。它也可以是来自固体样品的液体提取物。

通常，液体样品是尿液、全血、血浆、血清、稀粪便物。

根据特定的实施方式，稀释剂与待分析的样品一起使用，特别是当液体样品是例如血浆、血清、全血、鼻涂片或阴道涂片或咳出物时。稀释剂沉积在装置的沉积区的水平面处。

在沉积样品之前，可以将其与待分析样品混合。替代地，可以将稀释剂在样品之前或之后沉积。这种稀释剂夹带着样品和与结合试剂偶联的探针在多孔载体中迁移。通常，这种稀释剂包括缓冲盐水溶液。它也可以包括洗涤剂或反应所需的任何其他组分。

然后将毛细作用测试装置孵育足够的时间，以使液体样品通过毛细作用从沉积区迁移到对照区。

更特别地，在图2中示意性示出的“夹心”型的侧流测定如下进行。

当使多孔载体与包含分析物(11)的液体样品接触时，后者通过毛细作用在该载体中迁移直至标记区，与探针(7)偶联的特异性结合分析物的试剂位于其中。因此，分析物(11)借助于结合试剂与发光探针(7)结合。

如果存在待分析物质，则后者将通过固定在检测区(3)的水平面处的第一捕获试剂(8)固定在毛细作用测试装置的该区的水平面处。因此，这将导致发光探针固定在检测区(3)的水平面处。

因此，通过在检测区(3)的水平面处检测发光探针，来测量样品中待分析物质的存在或不存在。更特别地，在检测区的水平面处检测到的发光随样品中分析物的浓度增加，特别是与样品中分析物的浓度成比例。

过量的探针，换句话说，与未与分析物反应的结合试剂偶联的纳米颗粒，迁移至对照区。在该对照区中，结合试剂与第二捕获剂(9)结合，导致过量的探针在对照区(4)的水平面处固定。因此，用户具有由其支配的阳性对照，使样品和试剂在装置中的迁移得到验证，以及因而验证测试的适当操作。

根据本发明的方法的其他变型，所采用的测定是“竞争测定”型。在竞争测定的背景下，如图3-a示意性所示，在样品中不存在分析物的情况下，发光探针将通过它们的结合试剂与检测区的捕获试剂的结合而被固定在检测区的水平面处。然而，如果存在分析物，则后者将与发光探针的结合试剂竞争地固定在检测区的捕获试剂上。

因此，在竞争测定的背景下，在检测区的水平面处检测到的发光随样品中分析物的浓度减小，特别是与样品中分析物的浓度成反比。

如图3-b所示，根据“竞争”型的测定的又其他变型，分析物已经被固定在检测区的捕获部位的水平面处，而与标记区的发光纳米颗粒偶联的结合试剂能够与分析物特异性结合，如在“夹心”测定中。

如果样品包含分析物，则后者如在夹心测定中，通过结合试剂固定在发光纳米颗粒上，以及因此无法在检测区的水平面处结合。然而，与未与分析物反应的结合试剂偶联的探针可以通过固定在检测区的捕获试剂的水平面处的分析物与检测区结合。再次，在检测区的水平面处检测到的发光信号将随样品中分析物的浓度减小，特别是将与样品中分析物的浓度成反比。

因此，根据毛细作用测试的上述的变型中的一种或其他，通过检测由在测定结束时在毛细作用测试装置的水平面处固定的，特别是在样品迁移结束时在检测区(3)的水平面处以及任选地在对照区(4)的水平面处固定的纳米颗粒产生的发光来读取结果。

当然，本发明不以任何方式限于如附图中示意性示出的毛细作用测试装置的实现。

可以设想用于实现根据本发明的方法的毛细作用测试装置的其他变型，前提是它们适合于使用本发明的光致发光纳米颗粒作为检测探针。例如，它们可以是用于“试纸条侧流(Dipstick Lateral Flow)”型或另外“竖直侧流(Vertical Lateral Flow)”型等的毛细作用测试的装置。

根据变型实施方式，可以用单次测定来检测样品中的若干种物质(所谓的“多重”检测)。

例如，在“夹心”测定的背景下，可以在反应区(3)的水平面处、在分开区域(例如，若干个测试线“T”)的水平面处固定对待分析物质中的每一种具有特异性的若干种捕获试剂。在这种情况下，用作检测探针的纳米颗粒可以与对待分析物质中的每一种具有特异性的两种或更多种类型的捕获试剂偶联。在不同分析物存在下，将探针固定至包括对每种分析物具有特异性的捕获试剂的每个分开区域上。反应区中的每一个上的发光信号的存在和值将对应于相应的分析物的存在和浓度。在这种情况下，它是空间复用。

替代地，也可以在标记区(2)的水平面处采用掺杂有以不同发射波长发射的不同镧系元素离子的各种探针，探针中的每一种与对待分析物质中的每一种具有特异性的结合试剂以及在单个反应区(3)的水平面处对待分析物质中的每一种具有特异性的若干种捕获试剂偶联。在这种情况下，它是使用若干种发射颜色的复用。在这种情况下，在UV中激发结晶基质是特别有利的，因为它使得可以以相同的激发波长激发以不同波长发射的不同镧系元素离子。

可以将两种方法，即空间复用和用若干种发射颜色的复用结合用于进行，例如，使用具有两种不同发射颜色的两种探针检测四种分析物，每一种探针与对四种待分析物质中的两种具有特异性的两种类型的试剂以及两个反应区偶联，每个反应区包括四种待分析物质中的两种的特异性结合试剂。因此，在第一反应区上具有两种不同颜色的信号将指示前两种分析物的存在和浓度；第二反应区上具有两种不同颜色的信号将指示其他两种分析物的存在和浓度。

如与常规毛细作用测试一样，根据本发明的方法进行的测试(检测和/或定量)的评估是通过观察检测区以及任选地对照区来进行的。

更精确地，通过检测由在检测区和/或对照区的水平面处，优选地在检测区和对照区的水平面处固定的探针产生的发光来读取测定的结果。

对根据本发明的毛细作用测试装置的检测区和对照区的观察更特别是采用激发光致发光纳米颗粒的步骤(i)以及检测发光发射的步骤(ii)。

根据本发明的其他方面，本发明涉及一种体外诊断试剂盒，至少包括：

-根据本发明如上所定义的毛细作用测试装置；以及

-用于检测由在该装置的检测区和任选地对照区的水平面处固定的探针产生的发光的装置。

因此，包括含有激发源的照明装置的简单的检测设置就允许观察到发光探针的存在。

激发必须与纳米颗粒的吸光度特征兼容。激发可以在UV、可见或近红外中发生。

它可以使用非相干激发源诸如灯、发光二极管或激光器来进行。

激发源可以直接激发稀土元素离子和/或其中掺入稀土元素离子的纳米颗粒的基质。优选地，通过以下来激发稀土元素离子：激发在检测区和任选地对照区的水平面处固定的光致发光纳米颗粒的基质(例如，AVO

特别地，在如上所述的式A

在AVO

在包含Eu的氧化物基质的情况下，激发可以在210与310nm之间，特别是在230与290nm之间，以及更特别是在245与275nm之间的波长下进行。

在这种情况下，激发可以使用UV灯、UV发光二极管(LED)或UV激光器来进行。用UV灯或UV LED可以容易获得检测探针所需的激发的功率和强度。优选地，激发使用LED来进行，LED很少涉及能量损失，以及因此很少热量被去除。

而且，有利地，激发在条的表面上，特别是在检测区和对照区的水平面处均匀地进行。这种均匀性可以用UV灯，而且也可以用在检测区和对照区周围布置的若干个低功率的LED来实现。作为实例，如图7所示，可以使用四个LED的四组。图7中的方案指示了用于在条的检测区和对照区周围布置若干个LED的可能方案之一。

激发功率密度可以在0.5与20mW/cm

在根据本发明的毛细作用测试的商业应用的背景下，假设在激发期间产生的热量可以被有效地去除，考虑到给定激发功率获得的检测灵敏度与获得所讨论的激发功率所需的激发源的成本的比率，可以定义品质因素。有利地，根据本发明的诊断试剂盒使得可以优化该品质因素。

根据特别有利的实施方式，特别是在分析物的定性表征的背景下，可以通过直接肉眼观察毛细作用测试装置，特别是检测区以及任选地对照区，特别是使用发射滤波器来进行结果的读取。

发射滤波器使得可以选择发光离子的特征发射带，以及从而排除非特异性信号。作为实例，当使用Y

替代地，可以使用简单的检测设备读取结果。后者可以包括发射滤波器和检测器。

检测器是光子检测器。

它可以是单个检测器，特别是光电倍增管、光电二极管或avalanche光电二极管类型，或由检测像素的2D表面组成的光敏装置阵列类型的检测器，诸如CCD或EM-CCD摄影机或CMOS摄影机。

优选地，它是被称为2D的检测装置，诸如摄影机。因此，它使得可以获得用于侧流测定的条的2D图像。

例如，它可以是智能电话的CCD或CMOS传感器。

有利地，根据本发明的毛细作用测试具有短的发射信号采集时间。特别地，发光可以在数秒内，特别是在小于一秒内，特别是在小于100ms内测量。优选地，发射信号采集时间必须与智能电话的摄影机的图像的采集时间兼容。

然后可以解释发光结果。

对侧流测定的结果的分析可以由以下组成：简单确定在检测区和/或对照区的水平面处的探针的存在(定性测量)，例如通过用肉眼简单地目视观察或通过目视读取条的2D图像，例如用CCD摄影机获得的条的2D图像，例如由智能电话记录的照片。

它使得可以推断在分析的样品中是否存在测定的目标物质。

例如，在“夹心”型的侧流测定的背景下，结果的定性解释可以如下：

.如果存在两个带：测试为阳性；

.如果存在单个对照带：测试为阴性；

.如果存在单个测试带，则测试无效；

.如果没有带存在：则测试无效。

有利地，根据本发明的检测方法使得可以定性测量是使用金纳米颗粒作为探针的同一毛细作用测试的检测限的最多达1/10，特别是最多达1/100，或甚至最多达1/1000。

毛细作用测试的结果分析还可以包括待分析物质的定量表征，换句话说，通过解释发光结果来确定样品内所述物质的浓度。

然后，根据本发明使用的检测系统可以进一步包括用于分析发光发射的任何器件，例如允许记录和利用发光信号的转换器。

可以通过参考预先建立的标准或校准来解释发光测量值。

如上所见，在夹心型测定的背景下，检测区的发光信号随分析物的浓度而增加，特别是与分析物的浓度成比例，而在竞争测定的背景下则可能成反比。

通过参考校准的定量可以例如使用包括不同浓度的待分析物质的若干个对照带，称为校准带来进行。

发光测量值的解释可以特别是利用来自检测区的发光信号与来自对照区的发光信号的比率。

用于解释发光的这些器件可以例如在智能电话应用中组合，从而允许对获得的图像进行分析，并给出获得的结果的定量值。

替代地，根据本发明使用的检测系统可以采用2D检测器(用于记录图像的系统)以及图像分析软件。

替代地，可以将2D检测器集成到读取器中，以及然后可以将记录的图像传输到智能电话或允许图像分析的一些其他系统。

结果分析(例如借助于分析软件)，特别是用于分析物的定量表征的结果分析，例如可以包括确定对应于检测区、对照区的信号和确定背景信号。从其他两个区的值中减去背景信号的发光值。然后计算来自检测区的信号与来自对照区的信号的比率。

更精确地，结果分析(例如，借助于分析软件，或有利地借助于装载在检测装置(智能电话或其他)上的应用程序)，特别是用于分析物的定量表征的结果分析，可以例如包括(i)确定检测区中的发光水平L

在“夹心”型测定的背景下，结果分析优选地包括计算比率R＝S

用于激发、发光检测和结果分析的所有元件可以在称为毛细作用测试装置的读取器(例如，条读取器)的箱内组合。

出于读取测试结果的目的，例如可以在条读取器中产生用于插入一个或多个条的开口。

也可以提供包含USB连接或等效物的开口，以便能够将记录的图像传输到数据分析设备。

根据本发明的方法有利地使得可以检测样品中的含量严格小于5ng/mL，特别是小于0.5ng/mL，或者甚至小于0.05ng/mL的感兴趣的物质。当然，这种性能取决于分析物以及所使用的特异性结合试剂的效率。

有利地，根据本发明的检测方法使得可以定量测量是使用金纳米颗粒作为探针的同一毛细作用测试的定量限的最多达1/10，特别是最多达1/100，或甚至最多达1/1000。

下文呈现的实施例和附图仅出于说明的目的而给出，并不对本发明进行限制。

附图

实施例

1.1.

使用偏钒酸铵NH

新鲜制备0.1M的NH

通过注射泵以1mL/min的流量将离子(Y

选择Y(NO

一旦已经添加Y(NO

现在必须将最终的20mL溶液纯化，以去除过量的反离子。出于这种目的，使用以下直到电导率达到严格小于100μS.cm

其表面上固定四甲基铵阳离子的Y

VO

目视观察在瓶中静置16小时之后的纳米颗粒的溶液，示出均匀扩散的溶液。

即使在合成的最终pH(约pH 5)数月之后，最终溶液在水中仍保持非常稳定。尽管具有高离子强度(>0.1M)，但包括在合成介质中的溶液仍保持稳定(去除过量的反离子之前)。

去除反离子后，用DLS-ζ电位仪器(Zetasizer Nano ZS90,Malvern)确定的纳米颗粒的ζ电位在pH 7下为-38.4mV。

通过TEM观察纳米颗粒(图4)示出纳米颗粒具有细长的椭圆形形状。纳米颗粒的尺寸由约300个纳米颗粒的组的TEM图像确定(图5)。本发明的纳米颗粒具有的称为a的长轴长度在20与60nm之间，其中平均值为约40nm，且具有的称为b的短轴长度在10与30nm之间，其中平均值为约20nm。

Y

YVO

该合成与实施例1.1.a中的合成相同，除了溶液2由离子(Y

选择Y(NO

图13中示出这些纳米颗粒的激发和发射光谱。Dy

该合成与实施例1.1.a中的合成相同，除了溶液2由离子(Y

选择Y(NO

图14中示出这些纳米颗粒的激发和发射光谱。

而且，YVO

该合成与实施例1.1.a中的合成相同，除了溶液2由离子(Lu

选择Lu(NO

Lu

该合成与实施例1.1.a中的合成相同，除了溶液2由离子(Lu

选择Lu(NO

LuVO

该合成与实施例1.1.a中的合成相同，除了溶液2由离子(La

选择La(NO

La

这些纳米颗粒的合成从原钒酸盐前体开始如下进行。新鲜制备0.1M的10mL的NaVO

在搅拌下，通过注射泵以1mL/min的流量将离子(Gd

选择Gd(NO

一旦添加Gd(NO

必须将最终的20mL溶液纯化，如在实施例1.1.a中一样，以去除过量的反离子。出于这种目的，使用以下直到电导率达到严格小于100μS.cm

GdVO

还合成了包含在不同VO

该合成与实施例1.1.a中的合成相同，除了溶液1由总浓度为0.1M的离子(VO

PO

1.2.

根据以下方案，将如第1.1.a点所述获得的Y

在纳米颗粒的合成结束时，将纳米颗粒的溶液在17000g下离心3分钟，以沉淀出纳米颗粒的任何聚集体，并回收上清液。按尺寸进行选择。出于这种目的，在1900g下进行若干次离心持续3min。每次离心之后，紧接着用超声波仪使纳米颗粒再分散，以及然后使用DLS-ζ电位仪器(Zetasizer Nano ZS90,Malvern)确定纳米颗粒的尺寸。

制备具有浓度为20mM的钒酸根离子的25mL体积的Y

然后将溶液纯化以去除过量的硅酸根和钠反离子。将溶液在11000g(Sigma 3K10,Bioblock Scientific)下离心60分钟，并且然后将其通过超声处理(BioblockScientific，超声波处理器，以50％在400W的功率下操作)再分散。重复该步骤，直到溶液的电导率小于100μS/cm。

将225mL的无水乙醇放入500-mL的三颈型烧瓶中，以及添加265μL的APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)(Mw 221.37g/mol Sigma Aldrich)，其对应于1.125mM的最终浓度。该量对应于被引入的5当量的钒酸盐。然后将冷凝器附连至烧瓶。将整个放置在烧瓶加热器上，并置于通风柜下。将混合物在90℃下回流下加热。在三颈烧瓶的一个入口处，使用蠕动泵以1mL/min的流速逐滴添加pH 9下的纳米颗粒在75mL水中的胶体溶液(钒酸根离子浓度[V]＝3mM)。将整个搅拌下加热24h。

48小时之后，使用旋转蒸发器(rotavapor R-100,BUCHI)对纳米颗粒进行部分浓缩。将溶液在合适的烧瓶中旋转，并在50℃的浴中加热。

通过在乙醇:水(3:1)溶剂中的若干次离心来纯化回收的溶液。纯化之后，遵循上述方案按尺寸进行分选。

在开始接枝之前进行溶剂转移。

接枝方案如下。

将胺化的NP从EtOH:H

在5mL的DMF中回收NPS，以及然后将10％的琥珀酸酐添加到玻璃烧杯中(即0.5g，在5mL中)。在惰性气氛下在搅拌下反应至少过夜。

通过离心(13000g持续60min,Legend Micro 17r,Thermo Scientific)至少两次来洗涤羧化的NP，以便去除DMF和过量的琥珀酸酐。

通过超声处理(Bioblock Scientific,超声波处理器)将羧化的颗粒重新悬浮于水或pH 6下的MES缓冲液中。

表面接枝有COOH的纳米颗粒的偶联是根据以下方案进行的：

1.新鲜制备EDC/磺基-NHS(浓度分别为500和500mg/mL)在MES缓冲液(pH 5-6)中的混合溶液。

2.添加90nM的NP(在这种情况下，这是根据参考文献Casanova et al.[37]由钒酸根离子浓度计算的纳米颗粒浓度)至预先制备的3mL的溶液中，并在搅拌下在室温下反应25min。

3.通过用MilliQ水至少离心2次(13000g持续60min,Legend Micro17R,ThermoScientific)来快速洗涤NP，以去除多余的试剂。

4.在pH 7.3的磷酸钠缓冲液中超声处理之后，回收最后的粒料。添加所需量的蛋白质(抗h-FABP抗体，Ref 4F29,10E1,Hytest)作为所需比率(蛋白质:Np)的函数，通常为2μM，比率为20:1，以及5mg/mL的mPEG-硅烷(MW:10kD,Laysan Bio 256-586-9004)。

5.使该溶液在搅拌下在室温下反应2于4h之间。

6.添加阻断剂(1％的甘氨酸)，使得其与游离的COOH反应并阻断NP表面上的残余的反应位点。反应30min。

7.通过使用离心过滤器(Amicon Ultra 0.5mL,Ref UFC501096,Millipore)用pH7.2的PBS来离心将与蛋白质偶联的NP洗涤若干次。将NP转移至其储存介质：磷酸盐缓冲液+Tween 20(0.05％)+0.1％对羟苯甘氨酸+10％甘油。取100μL用于BCA测定。其余的溶液分成等分试样并在-80℃下冷冻。

而且，以与Y

1.3.

纳米颗粒与抗体的被动偶联，而不是实施例1.2中的共价偶联，也可以如下进行。

-将1mL的纳米颗粒的溶液(浓度为5mM的钒酸根离子)在15000g下离心15min。

-将粒料溶于800μL的MilliQ水中，并且然后通过超声处理(BioblockScientific，超声波处理器，最大功率为130W，以50％操作40s)再分散。

-在2mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液中添加100μL的250μg/mL的抗体溶液。

-旋转时孵育持续1小时。

-添加100μL的20mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液/1％BSA。

-在15 000g下离心15min，并去除上清液。

-将粒料溶于1mL的2mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液/0.1％BSA中。通过超声处理(Bioblock Scientific，超声波处理器，最大功率为130W，以50％操作40s)再分散。

-在15 000g下离心15min，并去除上清液。

-将粒料溶于250μL的2mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液/0.1％BSA中。通过超声处理(Bioblock Scientific，超声波处理器，最大功率为130W，以50％操作40s)再分散。

为了开发用于定性或定量地确定蛋白质的存在的快速测试，有必要优化各种参数并寻找反应时间与测试灵敏度之间的折衷。

如图1所示，通过组合四个基本部分来进行测定条的制造：

·使用基本上惰性的玻璃纤维作为标记区(2)(英语术语为“结合垫”)(GFDX103000,Millipore)。

·使用表面修饰的聚酯作为沉积区(英语术语为“样品垫”)(1)(Ref CFSP173000,Millipore)。它们具有的优点是它们具有弱的与蛋白质的非特异性相互作用，优异的牵引力以及良好的处理特性。

·使用硝酸纤维素膜(NC)(HF180MC100,Millipore)作为用于毛细作用的器件(10)。它具有用于流体迁移和固定蛋白质的最佳特性。将NC膜胶粘在无孔粘合塑料的载体(6)(“衬靶纸”)上。

·使用纤维素(CFSP173000,Millipore)作为吸收垫(5)(因其高吸收性能力)。

为了检测作为心脏生物标志物的h-FABP(人脂肪酸结合蛋白)：

在组装各个部件之前，有必要将抗体沉积在NC膜上。

1.将针对h-FABP(ref.4F29,9F3,Hytest)的小鼠单克隆抗体的溶液以浓度为1mg/mL在PBS(pH 7.4)中稀释。该溶液将用于测试带(3)。将针对小鼠抗体的山羊多克隆IgG抗体(Ref ab6708，Abcam)的另一种溶液以浓度为1mg/mL在PBS(pH 7.4)中稀释。后者用于对照带(4)。

2.使用“分配器”(Claremont Bio自动侧流试剂分配器(ALFRD))将抗体溶液沉积在NC膜上。使用注射泵，自始至终沿NC膜(约30cm长，将从中制成若干个条)，每个带沉积0.7μL的体积/2mm。在37℃下干燥1h。

3.沉积抗体之后，将NC膜与在0.04％下的PBS(pH 7.4)+Tween 20中稀释的1％BSA在37℃下孵育30min，以钝化未被抗体占据的固定位点。

4.使用分配器将与NP偶联的Ab沉积在标记区(“结合垫”)上。自始至终沿玻璃纤维膜施加3μL体积/4mm。在室温下干燥1h，然后用在PBS(pH 7.4)中稀释的1％BSA阻断。在室温下干燥。

1.在已经固定Ab的NC的粘合部分上组装各种结构(用作吸收垫的纤维素以及沉积区、标记区(在其上沉积Ab+NP))。部件按以下顺序固定在NC的塑料载体上：标记区(“结合垫”)、沉积区(“样品垫”)以及最后是吸收垫。为了通过毛细作用更好地进行流体迁移，如说明(图1)所示，将各个部件安装为相互重叠。

2.使用切纸机将组装的膜切成4mm宽的单独的片。

3.然后在湿度低于30％的气氛中在吸湿剂(干燥剂)存在下将条储存在铝袋中。

使用在实施例1.2中制备的与抗体偶联的Y

测量从5ng/mL至0.05ng/mL的若干浓度的h-FABP(Ref.8F65,Hytest)。用缓冲液或用血清将重组h-FABP稀释至期望浓度。

1.在进行测试之前回到室温，如以上第2点所述制备条并分析样品。

2.将400μL的样品沉积在竖直放置的瓶中。

3.将条浸入瓶中，将沉积区(“样品垫”)向下定向。轻敲底部的条以开始迁移。将条在管中保持竖直放置持续10min。

4.使用UV灯(Vilber Lourmat,VL-8.MC，8W，在312nm下，以及8W，在254nm下)(拍摄数码照片并通过ImageJ分析，参见图6和7)或使用图8和9中呈现的读取器来读取条的结果。图10说明了使用在Android下操作的手机上的专用应用程序对带的结果的分析。读取器使用在278nm下的4个LED的4组和干涉滤波器(620/15，Semrock)用于检测。高通滤波器诸如RG605滤波器(Schott)也可以用于检测。

纳米颗粒的吸收光谱呈现在图11(A)中。吸收峰位于280nm处，其中半峰全宽为约50nm。UV灯的发射光谱以310nm为中心，其中半峰全宽为40nm。UV LED的发射光谱以278nm为中心，其中半峰全宽为10nm。

结果的定性解释如下：

.如果存在两个带：测试为阳性

.如果存在单个对照带：测试为阴性

.如果存在单个测试带，则测试无效

.如果没有带存在：则测试无效。

图10示出了使用专用应用程序从用手机拍摄的数码照片开始的定量分析的实例。停留在电话屏幕上的“捕获”上时，将触发黑白图像的记录。然后，在停留在“测量”之后，应用程序要求用户用手指在电话屏幕上指向检测区以及然后是对照区，使得应用程序计算包含检测区的矩形内部的累积发光水平L

制备三个条用于包括h-FABP抗原的样品中的每一个的条测试。对于样品不包含抗原的情况，仅制备两个条。

图7中的图示出了通过ImageJ针对包含5、0.5、0.05和0ng/mL的h-FABP的不同液体样品测量的，针对比率R＝S

因此，根据本发明的方法有利地允许检测样品中含量小于或等于5ng/mL，特别是小于或等于0.5ng/mL，或者甚至直到低至0.05ng/mL的值的h-FABP。换句话说，可以以小于或等于330pM，特别是小于或等于33pM的含量，或者甚至直到低至3.3pM的含量检测h-FABP。

根据实施例1.3(被动偶联)，分别将根据实施例1.1.d和1.1.e合成的Lu

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