一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液及保存方法

摘要

本发明公开了一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，包括以下重量份的原料：质量浓度0.5‑0.9％的氯化钠溶液90‑100份、绿豆蛋白1‑5份、内啡肽0.5‑1份、萝卜硫素0.1‑0.5份、L‑茶氨酸5‑10份、L‑苯丙氨酸2‑8份、L‑色氨酸5‑10份。本发明提供的保存液中添加绿豆蛋白、内啡肽及萝卜硫素协同为细胞提供保护作用，和保存液中为细胞提供能量的氨基酸以及维持细胞外渗透压的氯化钠溶液共同发挥作用，细胞在4‑10℃保存48h后细胞的活率大于90％，并且本发明的保存液成分明确，使用安全。本发明还提供了一种羊膜间充质干细胞的保存方法，采用本发明的保存液，针对传代培养得到的羊膜间充质干细胞进行保存，有效延长细胞的保存时间，为羊膜间充质干细胞的长距离运输提供保障。

说明书

技术领域

本发明涉及一种保存液，尤其涉及一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液及保存方法。

背景技术

人羊膜间充质干细胞具有高度自我更新、增殖、可植入性和多系分化能力，异基因个体移植后无免疫排斥和致瘤性风险。而且，人羊膜间充质干细胞来源于产妇分娩后废弃的胎盘，应用到临床不会带来医学伦理争议。羊膜间充质干细胞可用来进行诸多疾病的细胞治疗、组织器官损伤的修复与重建，是再生医学领域理想的种子细胞资源，具有广阔的临床应用前景。

羊膜间充质干细胞治疗涉及细胞的制备、扩增、回输等过程，通常这些过程的实施地点及时间并不一致，从而需要把细胞运输到目的地，在运输过程中需要细胞保存液来维持细胞活性。目前国内可以大量提供人羊膜间充质干细胞的机构通常是采用生理盐水或者细胞培养基作为临床间充质干细胞应用时的溶液介质。如果将人羊膜间充质干细胞分离、培养、扩增后，立即给病人应用，生理盐水是方便安全的，但是羊膜间充质干细胞在生理盐水中活力下降的速度非常快，单纯用生理盐水保存细胞2小时后细胞活力就会降低10％左右，因此只适用于细胞的即时使用。

现有的细胞保存液为提高保存时间会加入了外源物质，会影响其安全性，同时现有保存液维持细胞活力的时间不能满足使用需求。在现有技术的细胞保存液中可以保持90％以上活力仅24个小时，并且随着时间延长，细胞活力下降，那么就意味着超过24小时，细胞活力将下降到90％以下，然而羊膜干细胞治疗及临床试验已经在国内多数城市及国外多个国家开展，利用现有的交通工具，24小时的活力维持时间明显限制了羊膜间充质干细胞的应用范围。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，有效延长细胞的保存时间，并且成分简单明确，使用安全。

本发明的目的之二在于一种羊膜间充质干细胞的保存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，包括以下重量份的原料：质量浓度0.5-0.9％的氯化钠溶液90-100份、绿豆蛋白1-5份、内啡肽0.5-1份、萝卜硫素0.1-0.5份、L-茶氨酸5-10份、L-苯丙氨酸2-8份、L-色氨酸5-10份。

进一步地，上述维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，包括以下重量份的原料：质量浓度0.7％的氯化钠溶液95份、绿豆蛋白3份、内啡肽0.8份、萝卜硫素0.2份、L-茶氨酸8份、L-苯丙氨酸5份、L-色氨酸8份。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种羊膜间充质干细胞的保存方法，采用上述的保存液。

进一步地，所述羊膜间充质干细胞的保存方法包括将羊膜间充质干细胞重悬于保存液中，在4-10℃条件下保存。

进一步地，所述保存液中羊膜间充质干细胞的浓度为1-4×10

进一步地，所述羊膜间充质干细胞为传代培养的P2-P10代细胞。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，在保存液中添加绿豆蛋白、内啡肽及萝卜硫素协同为细胞提供保护作用，在4-10℃的保存条件下抑制细胞的凋亡，有效维持保存液中羊膜间充质干细胞的活性，和保存液中为细胞提供能量的氨基酸以及维持细胞外渗透压的氯化钠溶液共同发挥作用，细胞在4-10℃保存48h后细胞的活率大于90％，为羊膜间充质干细胞的运输和保存提供保障，并且本发明的保存液不含外源性血清和动物蛋白等，成分明确，使用安全。

本发明还提供了一种羊膜间充质干细胞的保存方法，采用本发明的保存液，针对传代培养得到的羊膜间充质干细胞进行保存，有效延长细胞的保存时间，为羊膜间充质干细胞的长距离运输提供保障。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1至4中所保存的羊膜间充质干细胞均是通过常规培养方法得到，本领域技术人员可根据需要在现有技术中进行选择。

实施例1

一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.7％的氯化钠溶液95份、绿豆蛋白3份、内啡肽0.8份、萝卜硫素0.2份、L-茶氨酸8份、L-苯丙氨酸5份、L-色氨酸8份。

一种羊膜间充质干细胞的保存方法，取传代培养的P2代羊膜间充质干细胞重悬2mL保存液中，细胞浓度为3×10

实施例2

一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.5％的氯化钠溶液90份、绿豆蛋白1份、内啡肽0.5份、萝卜硫素0.1份、L-茶氨酸5份、L-苯丙氨酸2份、L-色氨酸5份。

一种羊膜间充质干细胞的保存方法，取传代培养的P5代羊膜间充质干细胞重悬2mL保存液中，细胞浓度为1×10

实施例3

一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9％的氯化钠溶液100份、绿豆蛋白5份、内啡肽1份、萝卜硫素0.5份、L-茶氨酸10份、L-苯丙氨酸8份、L-色氨酸10份。

一种羊膜间充质干细胞的保存方法，取传代培养的P10代羊膜间充质干细胞重悬2mL保存液中，细胞浓度为4×10

实施例4

一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9％的氯化钠溶液98份、绿豆蛋白2份、内啡肽0.7份、萝卜硫素0.3份、L-茶氨酸5份、L-苯丙氨酸5份、L-色氨酸5份。

一种羊膜间充质干细胞的保存方法，取传代培养的P5代羊膜间充质干细胞重悬2mL保存液中，细胞浓度为2×10

对比例1

对比例1提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：省去绿豆蛋白，其余均和对比例1相同。

对比例2

对比例2提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：将绿豆蛋白替换为白蛋白，其余均和对比例1相同。

对比例3

对比例3提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：省去内啡肽，其余均和对比例1相同。

对比例4

对比例4提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：省去萝卜硫素，其余均和对比例1相同。

对比例5

对比例5提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：将萝卜硫素替换为维生素C，其余均和对比例1相同。

对比例6

对比例6提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：省去L-茶氨酸，其余均和对比例1相同。

对比例7

对比例7提供一种维持羊膜间充质干细胞活性的保存液，和实施例1的区别为：省去L-茶氨酸，调整L-苯丙氨酸的用量为13份，其余均和实施例1相同。

将实施例1至4和对比例1至7的保存液分别在保存0h、24h和48h时取样，采用台盼蓝染色法用Countstar细胞计数仪进行计数，统计细胞活率，结果如表1所示。

表1

由表1可以看出实施例1至4的保存液在保存48h后细胞的活率还高于90％，远远高于对比例1至7的保存液。对比例1的保存液中省去了绿豆蛋白后羊膜间充质干在保存48h后细胞的活率仅为32.57％，对比例2中将绿豆蛋白替换为白蛋白，细胞活率相比对比例1有一定的提高达到64.74％，但是和实施例1中添加绿豆蛋白的91.57％相比下降显著，说明本发明的保存液中添加的绿豆蛋白和内啡肽及萝卜硫素协同为细胞提供保护作用，延长保存时间，提高细胞活率，将绿豆蛋白替换为白蛋白后对细胞的保护作用下降，进而使细胞的活率大大降低。

对比例3和对比例4中分别省去了和绿豆蛋白复配使用的内啡肽和萝卜硫素，对比例5中将萝卜硫素替换为维生素C，在4℃保存48小时后细胞的活率和实施例1至4相比下降显著。

对比例6和对比例7中分别省去了L-茶氨酸，或者省去L-茶氨酸调整L-苯丙氨酸的用量，所得的保存液在应用时细胞的活率仍下降显著，说明本发明通过添加L-茶氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸为细胞提供能量，和绿豆蛋白、内啡肽、萝卜硫素为细胞提供保护，延长细胞的保存时间，提高细胞活率。

综上，本发明提供的保存液添加绿豆蛋白、内啡肽及萝卜硫素协同为细胞提供保护作用，和保存液中为细胞提供能量的氨基酸以及维持细胞外渗透压的氯化钠溶液共同发挥作用，羊膜间充质干细胞在4-10℃保存48h后细胞的活率大于90％，为羊膜间充质干细胞的运输和保存提供保障，并且本发明的保存液不含外源性血清和动物蛋白等，成分明确，使用安全。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。