一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法

摘要

一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法，包括以下步骤：1)谢瓦氏曲霉菌种的活化；2)摇瓶种子悬液的制备；3)液体菌种的制备；4)金花菌发酵茶原液制备的接种；5)金花菌发酵茶原液制备的发酵；6)金花菌发酵茶原液的制备；7)金花菌发酵茶饮的制备。从发酵工艺上改进金花菌的发酵方式，运用纯种液态二次发酵工艺，结合静置‑‑振荡耦合发酵方法，不仅能够解决金花菌发酵茶饮产量少、品类单一的问题，还能解决金花菌发酵茶饮品质参差不齐的问题，更能提高金花菌发酵茶饮的保健作用，克服金花菌发酵茶饮安全高质高效生产的挑战，使得发酵后金花菌的数量(生物量)有所提升，也提升发酵液的质量，更是缩短发酵周期。

说明书

技术领域

本发明涉及金花菌发酵技术领域，尤其涉及一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法。

背景技术

谢瓦氏曲霉是一种在茯砖茶发花工艺中的优势菌种，俗称“金花菌”，是一种益生菌，且对茯砖茶品质的提升有着不可或缺的作用，在金花菌的作用下能够使得茯砖茶产生独特的菌花香及醇厚的味道。因此，金花菌的数量也就成为评价茯砖茶质量的一个标准。

多项研究表明，金花菌在发酵过程中产生的胞外多糖，不仅具有调节胆固醇代谢平衡，维持血脂水平的作用，还具有抑制肿瘤的效果；金花菌发酵还能产生蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶等，这些酶都有利于人体降低体内堆积的脂肪；金花菌发酵液中还存在着能促进胃蛋白酶活性及抑制脂肪酶活性的功能成分，使得金花菌具有明显的降脂减肥的功效。此外，金花菌发酵液中还含有多种活性物质，具有抗氧化、防衰老、抗菌及增强人体免疫活性等功效。

众所周知，喝茶有益健康，茶饮料也被誉为“世界三大饮料之一”。茶饮料中的有机物和矿质元素含有许多具有营养作用和生物活性作用的物质，比如：茶多酚类、茶色素类、氨基酸、茶多糖、有机酸、维生素等物质。

黑茶是金花菌发酵茶，属传统固态发酵范畴，黑茶的制作工艺流程不仅繁琐，而且耗时长，对茶叶的品类及品种也有一定的要求。随着人们对金花菌发酵产物更加深入地研究，金花菌茶对人类的益处被不断发掘出来，人们对高品质金花菌茶的需求也就不断上升，这就对金花菌茶安全高质高效地生产提出了挑战，如何解决这个问题，也将成为未来金花菌发酵应用研究领域的一大趋势。

发明内容

本发明的目的在于解决目前市场上金花菌发酵茶饮的产品少而差的问题，提高金花菌发酵茶饮的保健作用，填补市场上金花菌液体发酵茶饮料的空白，解决长期被生产繁琐，耗时长且具有一定安全风险的固态发酵工艺所制约的产量少、品质参差不齐的问题，提供一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法，从发酵工艺上改进金花菌的发酵方式，运用纯种液态二次发酵工艺，结合静置--振荡耦合发酵方法，不仅能够解决金花菌发酵茶饮产量少、品类单一的问题，还能解决金花菌发酵茶饮品质参差不齐的问题，更能提高金花菌发酵茶饮的保健作用，克服金花菌发酵茶饮安全高质高效生产的挑战，使得发酵后金花菌的数量(生物量)有所提升，也提升发酵液的质量，更是缩短发酵周期。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明以茶汁、果汁或二者结合后的调配液为培养基，经金花菌发酵技术工艺，得到金花菌发酵茶原液，再经调配制得金花菌发酵茶饮，具体制备的技术工艺包括如下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化；

2)摇瓶种子悬液的制备；

3)液体菌种的制备；

4)金花菌发酵茶原液制备的接种；

5)金花菌发酵茶原液制备的发酵；

6)金花菌发酵茶原液的制备；

7)金花菌发酵茶饮的制备。

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化；

在步骤1)中，所述谢瓦氏曲霉菌种的活化为将谢瓦氏曲霉菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于28～32℃的培养箱中活化6～8d。

2)摇瓶种子悬液的制备；

在步骤2)中，所述摇瓶种子悬液的制备方法为：用接种勾勾取4～6块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备；

在步骤3)中，所述液体菌种的制备方法为：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为3％～5％，接种之后在28～32℃的条件下，转速为140～180rpm，持续振荡培养6～8d，得谢瓦氏曲霉二级液体菌种；

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(茶：水为1:80，热萃取所得，茶可为红茶、绿茶、乌龙茶等)，加热至沸腾，维持20～30min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种；

在步骤4)中，所述金花菌发酵茶原液制备的接种为将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为8％～15％；

其中，金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为10～14g茶叶(可为红茶、绿茶、乌龙茶等)，加水1000mL，加热至沸腾，维持5～8min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量可为40～50g的蔗糖，2～4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为105～115℃，10～15min(可按比例添加果汁制取金花菌发酵果汁茶培养基或单独用果汁制备金花菌发酵果汁培养基)。

5)金花菌发酵茶原液制备的发酵过程控制，包括静置--振荡耦合控制、二次发酵补料控制、发酵条件控制；

在步骤5)中，所述静置--振荡耦合控制为在金花菌发酵茶培养基接种后先静置10～16h后，再开始振荡培养；或先振荡培养1d后静置10～16h再开始振荡培养；或静置培养与振荡培养交替培养，交替周期为34～40h，静置培养与振荡培养交替培养时间比例为1:3；

所述二次发酵补料控制为一次发酵4～5d后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的30％～70％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为3～5d；

所述发酵条件控制为培养温度设置在28～32℃，振荡培养转速设置在140～180rpm。

6)金花菌发酵茶原液的制备；

在步骤6)中，所述金花菌发酵茶原液的制备方法为金花菌发酵茶原液制备发酵完成后，开始静置沉降3～5h，然后将沉降后的杂质过滤，收集滤液，得到金花菌发酵茶原液。

7)金花菌发酵茶饮的制备，包括原味金花菌发酵茶饮，果味金花菌发酵茶饮，果汁金花菌发酵茶饮，奶味金花菌发酵茶饮等各风味金花菌发酵茶饮的制备；

在步骤7)中，所述原味金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液70％～85％、六偏磷酸钠0.1％～0.2％、维生素C 0.01％～0.015％、甜菊糖苷0.007％～0.01％，余量为水；

所述果味金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液65％～80％、蔗糖2％～3％，浓缩果汁0.5％～1％、维生素C 0.01％～0.015％、食品用香精0.03％～0.06％，余量为水；

所述果汁金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液60％～75％、蔗糖2％～3％，果汁5％～10％、维生素C 0.01％～0.015％、食品用香精0.03％～0.06％，余量为水；

所述奶味金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液60％～75％、奶粉1.5％～3％、蔗糖1％～2％、维生素C 0.01％～0.015％、食品用香精0.03％～0.06％，余量为水；

除上述所列配方外，与其相类似的金花菌发酵饮料配方皆可视为本发明内容。

相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

1、本发明采用谢瓦氏曲霉液态发酵技术，结合静置--振荡，二次补料发酵等发酵工艺，应用于金花菌发酵茶原液制备上，相较于传统金花菌发酵茶原液的制备，不仅能提升原液的品质，还能增加原液的产量，缩短原液的制备周期。

2、本发明的发酵菌种谢瓦氏曲霉液态发酵技术，不仅能够克服流程繁琐耗时长的问题，还可解决传统自然发酵受茶叶限制导致金花菌发酵茶品类少的问题(本发明可应用于金花菌发酵绿茶、红茶、乌龙茶、白茶等各种茶品类)，且采用液态纯种发酵相较于传统固态自然发酵而言，所产金花菌发酵茶原液的安全性更易得到控制，质量更易得到保障，有利于工业化标准化生产金花菌发酵茶饮品。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合实施例，对本发明做进一步详细说明。该处所描述的具体实施例仅对本发明作进一步解释说明，并不用于限定本发明。以下描述的具体实施方式所涉及到的具体技术特征只要未构成相互冲突便可互相组合。

实施例1

一种谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态静置--振荡耦合二次深层发酵制备原味金花菌发酵茶饮的技术工艺，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(红茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为8％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶原液制备的发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中培养，先静置12h后，再开始振荡培养(振荡培养转速设置在150rpm)，培养时间为5d，此为一次发酵；待第一次发酵培养结束后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的50％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在150rpm。

6)金花菌发酵茶原液的制备：金花菌发酵茶原液制备发酵完成后，开始静置沉降4h，然后将沉降后的杂质过滤，收集滤液，得到金花菌发酵茶原液。

7)原味金花菌发酵茶饮的制备：

原味金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液80％、六偏磷酸钠0.15％、维生素C 0.012％、甜菊糖苷0.008％，余量为水；

实施例2

一种谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态静置--振荡耦合二次深层发酵制备果味金花菌发酵茶饮的技术工艺，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于32℃的培养箱中活化8d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取6块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为4％，接种之后在32℃，转速为180rpm，持续培养8d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持30min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为15％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为14g乌龙茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持8min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为50g的蔗糖，2g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为115℃，13min。

5)金花菌发酵茶原液制备的发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在32℃的振荡培养箱中培养，先振荡培养(振荡培养转速设置在180rpm)1d后静置16h，再开始振荡培养，培养时间为6d，此为一次发酵；待第一次发酵培养结束后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的70％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在180rpm。

6)金花菌发酵茶原液的制备：金花菌发酵茶原液制备发酵完成后，开始静置沉降5h，然后将沉降后的杂质过滤，收集滤液，得到金花菌发酵茶原液。

7)果味金花菌发酵茶饮的制备：

果味金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液70％、蔗糖3％，浓缩果汁0.5％、维生素C 0.015％、食品用香精0.06％，余量为水；

实施例3

一种谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态静置--振荡耦合二次深层发酵制备果汁金花菌发酵茶饮的技术工艺，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于28℃的培养箱中活化6d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取4块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在28℃，转速为140rpm，持续培养6d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(绿茶1:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持25min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为10g绿茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持5min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为45g的蔗糖，3g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为105℃，15min(可按比例添加果汁制取金花菌发酵果汁茶培养基或单独用果汁制备金花菌发酵果汁培养基)。

5)金花菌发酵茶原液制备的发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在28℃的振荡培养箱中培养，静置培养与振荡培养(振荡培养转速设置在140rpm)交替培养，交替周期为40h，静置培养与振荡培养交替培养时间比例为1:3，总培养时间为6d，此为一次发酵；待第一次发酵培养结束后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的60％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在140rpm。

6)金花菌发酵茶原液的制备：金花菌发酵茶原液制备发酵完成后，开始静置沉降3h，然后将沉降后的杂质过滤，收集滤液，得到金花菌发酵茶原液。

7)果汁金花菌发酵茶饮的制备：

果汁金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液65％、蔗糖2％，果汁7％、维生素C 0.013％、食品用香精0.04％，余量为水；

实施例4

一种谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态静置--振荡耦合二次深层发酵制备奶味金花菌发酵茶饮的技术工艺，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于29℃的培养箱中活化8d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取6块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为3.5％，接种之后在29℃，转速为160rpm，持续培养8d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(红茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持26min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为11％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为11g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持7min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为47g的蔗糖，3.2g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为107℃，13min。

5)金花菌发酵茶原液制备的发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在29℃的振荡培养箱中培养，静置培养与振荡培养(振荡培养转速设置在160rpm)交替培养，交替周期为36h，静置培养与振荡培养交替培养时间比例为1:3，此为一次发酵，发酵时间为5d；待第一次发酵培养结束后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的55％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在160rpm。

6)金花菌发酵茶原液的制备：金花菌发酵茶原液制备发酵完成后，开始静置沉降3h，然后将沉降后的杂质过滤，收集滤液，得到金花菌发酵茶原液。

7)奶味金花菌发酵茶饮的制备：

奶味金花菌发酵茶饮的质量百分比组成为：金花菌发酵茶原液65％、奶粉2％、蔗糖1.5％、维生素C 0.012％、食品用香精0.05％，余量为水。

实施例5

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中培养，先静置12h后，再开始振荡培养(振荡培养转速设置在150rpm)，培养时间为6d。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

实施例6

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中培养，静置培养与振荡培养(振荡培养转速设置在150rpm)交替培养，交替周期为40h，静置培养与振荡培养交替培养时间比例为1:3，总培养时间为6d。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

实施例7

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中培养，先振荡培养(振荡培养转速设置在150rpm)1d后静置16h，再开始振荡培养，培养时间为6d。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

实施例8

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中培养，先静置12h后，再开始振荡培养(振荡培养转速设置在150rpm)，培养时间为6d，待一次发酵培养结束后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的50％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在150rpm。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

实施例9

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中培养，静置培养与振荡培养(振荡培养转速设置在150rpm)交替培养，交替周期为40h，静置培养与振荡培养交替培养时间比例为1:3，总培养时间为6d，待一次发酵培养结束后，进行补料操作，补料所用培养基为金花菌发酵茶培养基，补料培养基体积为一次发酵总体积的60％，补料完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在150rpm。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

对比例1

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中振荡培养，振荡培养转速设置在150rpm，培养时间为6d。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

对比例2

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中振荡培养，振荡培养转速设置在150rpm，培养时间为6d，待一次发酵培养结束后，进行补无菌水操作，补无菌水体积为一次发酵总体积的50％，补水完成后再进行二次振荡发酵，振荡发酵时间为4d，振荡培养转速设置在150rpm。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

对比例3

一种提高谢瓦氏曲霉(金花菌)纯种液态发酵生物量的方法，具体包括以下步骤：

1)谢瓦氏曲霉菌种的活化：将保存的谢瓦氏曲霉斜面菌种转接到含有PDA培养基的平板上，置于30℃的培养箱中活化7d。

2)摇瓶种子悬液的制备：用接种勾勾取5块0.5cm

其中，所述种子液培养基为PDA液体培养基，灭菌温度为121℃，20min。

3)液体菌种的制备：将谢瓦氏曲霉(金花菌)种子悬液(一级液体菌种)接种于含有液体菌种培养基的三角瓶中，接种量为5％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。

其中，所述液体菌种培养基的制备方法为称取洗净去皮马铃薯200g，切成碎块放入锅中，加茶汁1000mL(乌龙茶:水为1:80，热萃取所得)，加热至沸腾，维持20min，两层纱布过滤，再在滤液中加蔗糖20g，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为121℃，20min。

4)金花菌发酵茶原液制备的接种：将步骤3)中所得金花菌二级液体菌种接种于含有金花菌发酵茶培养基的三角瓶中，接种量为10％；

其中，所述金花菌发酵茶培养基的制备方法为称取重量可为12g红茶茶叶，加水1000mL，加热至沸腾，维持6min，两层纱布过滤，再在滤液中加入重量为40g的蔗糖，4g的黄豆饼浸粉，充分溶解后，补蒸馏水至1000mL，该培养基的灭菌温度为110℃，10min。

5)金花菌发酵茶发酵过程控制：将接种过金花菌菌种的培养液放置于培养温度设置在30℃的振荡培养箱中振荡培养，振荡培养转速设置在150rpm，培养时间为10d。

6)金花菌生物量的测定：使用抽滤机进行真空抽滤，将金花菌发酵茶培养液过滤于滤纸上，得菌丝体，100～105℃烘至质量恒定，测定结果见表1。

表1

本发明采用谢瓦氏曲霉液态发酵技术，不仅能够克服流程繁琐耗时长的问题，而且对茶叶的品类及品种无要求，能够实现用金花菌发酵绿茶、红茶、乌龙茶等不同茶叶品类及品种的，获得不同类型的金花菌发酵茶饮，这对金花菌茶的品类扩充及金花菌茶的推广具有一定的实践意义。

本发明中，谢瓦氏曲霉(金花菌)菌丝体为较小的圆球状，相较食用菌菌球较难培养大，若长期振荡培养不利于菌丝体的生长，不利于微生物的繁殖，采用静置--振荡耦合发酵技术，在振荡一段时间后，给菌丝体一个静置的环境，有利于菌丝体生长伸长，再继续振荡，使得菌丝体从菌球中脱落下来，继续发酵培养，脱落的菌丝体又可生长为菌球，使得金花菌与培养基的接触面增大，有利于金花菌对培养基中养分的利用。

本发明在液体发酵中采用二次发酵技术，二次发酵能使得发酵料发酵更充分，菌种活性更强，菌体数量更多，得到的发酵产物及活性物质也更多，而且能够缩短发酵时间，具有一次发酵难以比拟的优势，通过二次发酵技术提高生物量和代谢产物量，以此来提高工业生产效率，缩短生产周期，节约生产成本。