一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种重组SIRPα‑TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用。基于从干预或阻断SIRPα‑CD47相互作用方面入手，针对癌细胞膜和巨噬细胞膜上已知位点及可启动下游凋亡信号通路的经典理论，将TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)和SIRPα两个功能区的氨基酸序列进行重组，构建SIRPα‑TRAIL融合蛋白，目标是阻断SIRPα与CD47的结合，促进巨噬细胞吞噬，同时利用TRAIL竞争癌细胞膜上特异性死亡受体DR4/DR5结合，不仅干预了CD47与SIRPα的结合，又能激活下游凋亡信号级联反应，促进癌细胞凋亡。重组SIRPα‑TRAIL融合蛋白的设计开辟一种新的抗肿瘤治疗策略，是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

癌症的治疗观已经从细胞攻击模式开始向靶向性治疗模式转变。因此，现阶段肿瘤治疗研究的热点就聚焦于治疗靶点的选择和靶向药物的研发。目前，虽然单一治疗方法是一种常见的策略，但癌症的发生是多方面、多因素、多基因靶点调控的复杂事件，临床试验中已经广泛探索了联合治疗方法，它们被认为是治疗癌症的关键。相对于只能阻断一种信号通路的单一靶点抑制剂，联合靶点治疗似乎更有效。所以，单一靶点常见的癌细胞通过其他通路逃逸、发生恶性发展，复发、转移以及耐药现象等问题，在多靶点中得以控制，多靶点治疗将成为攻克癌症新途径。

融合蛋白(Fusion protein，FP)是在人工条件下，有目的的将两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起表达出所需要的蛋白，这种通过基因重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白。FP技术是为获得大量标准FP而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：

步骤1.SIRPα-TRAIL融合蛋白序列设计，查找TRAIL和SIRPα功能序；

步骤2.将获得的基因片段融合；

步骤3.构建带有His标签的pET28(+)-SIRPα-TRAIL的表达质粒；

步骤4.SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立；

步骤5.SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)扩大培养的生长曲线；

步骤6.鉴定SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)诱导成功；

步骤7.SIRPα-TRAIL融合蛋白表达位置鉴定；

步骤8.SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵体的洗涤及溶解；

步骤9.SIRPα-TRAIL融合蛋白的纯化；

步骤10.融合蛋白的复性除盐；

步骤11.冷冻干燥，得到SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末。

作为本发明进一步的方案，步骤4中SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立，具体内容如下：

将提取的pET28(+)-SIRPα-TRAIL质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，转化后的大肠杆菌划线涂抹于固体培养基上，37℃过夜培养后，观察转化结果提示转化成功。

作为本发明进一步的方案，步骤5中SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)扩大培养的生长曲线，具体内容如下：

挑取上述LB固体培养基上的单一菌落，在20ml含KANA的液体培养基中培养6h活化菌种，将活化后的菌液按不同比例加入含KANA的液体培养基中，每隔2h，留取样本，培养10h，用酶标仪测量不同时间点的样品的OD值，绘制生长曲线，6h为菌种的对数生长期。

作为本发明进一步的方案，步骤6中鉴定SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)诱导成功，具体内容如下：

将菌种扩大培养，取诱导前后大肠杆菌样品进行SDS-PAGE电泳，可见诱导后表达量明显增加，证明融合蛋白表达诱导成功。

作为本发明进一步的方案，步骤7中SIRPα-TRAIL融合蛋白表达位置鉴定，具体内容如下：

将活化后的SIRPα-TRAIL in BL21(DE3)菌液取1mL，添加于100mL LB液体培养基中，以上述培养条件培养12h，超声破碎大肠杆菌，取碎菌离心后上清、沉淀样品进行SDS-PAGE电泳，蛋白在沉淀中大量表达，而上清几乎没有表达，证明SIRPα-TRAIL为包涵体表达。

作为本发明进一步的方案，步骤8中SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵体的洗涤及溶解，具体内容如下：

将包涵体蛋白变为有生物活性的蛋白，首先是溶解包涵体，先将包涵体蛋白以2M尿素的缓冲液洗涤，尽可能洗涤除去在蛋白表达过程中包裹于包涵体外部的非目的性杂蛋白，然后利用8M尿素变性液将其溶解，取溶解后样品进行SDS-PAGE电泳，在SIRPα-TRAIL分子量处有蛋白表达，证明成功将包涵体表达变为可溶性表达。

作为本发明进一步的方案，步骤9中SIRPα-TRAIL融合蛋白的纯化，具体内容如下：

利用Ni柱亲和层析，将8M尿素溶解后的包涵体样品上样，选用不同浓度咪唑缓冲液洗脱Ni层析柱，低浓度的咪唑缓冲液将非目的性杂蛋白洗脱下，高浓度的咪唑缓冲液将SIRPα-TRAIL融合蛋白洗脱下来，将洗脱下的样品进行SDS-PAGE电泳，证明纯化出较为纯净的SIRPα-TRAIL融合蛋白。

作为本发明进一步的方案，步骤10中融合蛋白的复性除盐，具体内容如下：

将第一次Ni柱亲和层析纯化SIRPα-TRAIL融合蛋白加至G25层析柱中，加入缓冲液洗脱层析柱，将样品复性并除去咪唑尿素等，得到浓缩的SIRPα-TRAIL融合蛋白样品，将得到的样品进行SDS-PAGE电泳，分子量36kDa处即为SIRPα-TRAIL融合蛋白。

作为本发明进一步的方案，步骤11中冷冻干燥，具体内容如下：

将过完G25所得的融合蛋白冷冻干燥36小时后，得到SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末。

上述方法构建的重组SIRPα-TRAIL融合蛋白，在双靶点抗肿瘤中的应用。其是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明基于从干预或阻断SIRPα-CD47相互作用方面入手，针对癌细胞膜和巨噬细胞膜上已知位点及可启动下游凋亡信号通路的经典理论，将TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)和SIRPα两个功能区的氨基酸序列进行重组，构建SIRPα-TRAIL融合蛋白，目标是阻断SIRPα与CD47的结合，促进巨噬细胞吞噬，同时利用TRAIL竞争癌细胞膜上特异性死亡受体DR4/DR5结合，不仅干预了CD47与SIRPα的结合，又能激活下游凋亡信号级联反应，促进癌细胞凋亡。重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的设计开辟一种新的抗肿瘤治疗策略，是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。

附图说明

图1为重组SIRPα-TRAIL融合蛋白双重抗肿瘤作用模示图；

图2为SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)扩大培养的生长曲线图；

图3为目的蛋白诱导前后电泳图；

图4为目的蛋白以包涵体的形式表达图；

图5为8M尿素溶解包涵体蛋白图；

图6为Ni亲和柱纯化SIRPα-TRAIL融合蛋白图；

图7为融合蛋白的复性除盐图；

图8为冻干的SIRPα-TRAIL融合蛋白图(其中A为SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末图，B为粉末用ddH

图9为细胞培养诱导分化在光镜下形态图(其中A为单核细胞，B为巨噬细胞)；

图10为采用免疫荧光技术下巨噬细胞吞噬能力图；

图11为CD14、CD36和CD71在单核细胞THP和巨噬细胞表达图；

图12为SIRPα-TRAIL融合蛋白孵育组巨噬细胞吞噬卵巢癌细胞A2780的比例明显高于对照组图；

图13为流式细胞仪分析对照组吞噬率及SIRPα-TRAIL融合蛋白组吞噬率图；

图14为用Western Blot方法对OVCAR3、A2780、SKOV3卵巢癌细胞表面TRAIL受体DR4、DR5的蛋白表达水平进行检测图；

图15为检测出SIRPα-TRAIL融合蛋白和TRAIL在A2780细胞系中的EC50含量图；

图16为对SIRPα-TRAIL融合蛋白处理的A2780细胞进行Hochest33258凋亡染色，SIRPα-TRAIL融合蛋白的浓度20μg/mL，30μg/mL和40μg/mL处理均可见不同程度的癌细胞凋亡图；

图17为电镜下在SIRPα-TRAIL融合蛋白和TRAIL下均可见凋亡细胞核凋亡小体图；

图18为Western Blot方法检测DR4及DR5均有表达图；

图19为Cleaved-caspase8，Cleaved-caspase3，Cleaved-PARP，Bax表达图及抑制凋亡蛋白Bcl-2表达图；

图20为流式细胞术检测，TRAIL组的晚期凋亡以及SIRPα-TRAIL融合蛋白组的晚期凋亡图；

图21为用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理A2780细胞后加入SIRPα-TRAIL融合蛋白作用图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的阐述。

一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：

步骤1.SIRPα-TRAIL融合蛋白序列设计，查找TRAIL和SIRPα功能序；

SIRPα：

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS；

TRAIL：

RQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG；

步骤2.将获得的基因片段融合；融合蛋白氨基酸序列设计如下：

CATATG*EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSRGDRGDRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG*CTCGAG；

步骤3.构建带有His标签的pET28(+)-SIRPα-TRAIL的表达质粒；

首先设计出融合蛋白的基因表达序列，设计序列如下：The Optimized(forEscherichia coli)sequence of SIRP-TRAIL A 270T 219C 230G 259|GC％:50％|Length:978

CATATGGAGGAAGAGCTGCAAGTTATTCAACCGGACAAAAGCGTGAGTGTTGCCGCTGGTGAGAGCGCAATTCTGCATTGCACCGTGACCAGTCTGATCCCGGTGGGTCCGATTCAGTGGTTTCGTGGTGCTGGTCCGGCCCGCGAACTGATCTATAACCAGAAGGAAGGCCATTTTCCGCGCGTGACCACCGTTAGCGAAAGCACCAAACGTGAAAATATGGATTTCAGCATTAGCATCAGCAATATTACCCCCGCTGATGCCGGCACCTACTATTGCGTGAAGTTCCGTAAGGGCAGCCCGGATACCGAATTTAAAAGCGGTGCCGGTACCGAGCTGAGCGTGCGTGCAAAACCGAGTCGTGGTGATCGCGGTGATCGCCAGCTGGTTCGCAAGATGATTCTGCGCACAAGCGAAGAGACCATCAGCACAGTGCAAGAAAAGCAGCAGAATATTAGCCCGCTGGTTCGCGAACGCGGTCCGCAGCGTGTTGCAGCCCACATTACCGGCACCCGTGGTCGCAGCAATACTTTAAGCAGCCCGAACAGCAAGAACGAAAAAGCTTTAGGTCGCAAGATCAACAGCTGGGAGAGCAGCCGTAGCGGTCATAGCTTTCTGAGCAATTTACATCTGCGCAACGGTGAGCTGGTTATCCATGAGAAAGGCTTTTACTACATTTATAGCCAGACCTATTTTCGTTTTCAAGAAGAGATTAAAGAGAACACCAAAAACGATAAACAGATGGTGCAGTATATTTATAAATATACCAGCTACCCGGATCCGATTCTGCTGATGAAGAGTGCCCGCAACAGTTGCTGGAGCAAAGACGCAGAGTATGGTTTATACAGCATCTACCAAGGTGGCATCTTTGAGCTGAAGGAGAATGACCGCATTTTCGTGAGCGTTACCAATGAGCATTTAATCGACATGGACCATGAAGCCAGCTTTTTCGGTGCATTTTTAGTGGGTTAACTCGAG；

融合蛋白的基因表达序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成含目的片段的重组pET28(+)-SIRPα-TRAIL质粒和含有该重组质粒的穿刺菌，重组质粒测序结果与设计序列一致。

步骤4.SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立；

将提取的pET28(+)-SIRPα-TRAIL质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，转化后的大肠杆菌划线涂抹于固体培养基上，37℃过夜培养后，观察转化结果提示转化成功；

步骤5.SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)扩大培养的生长曲线；

挑取上述LB固体培养基上的单一菌落，在20ml含KANA的液体培养基中培养6h活化菌种，将活化后的菌液按不同比例加入含KANA的液体培养基中，每隔2h，留取样本，培养10h，用酶标仪测量不同时间点的样品的OD值，绘制生长曲线，6h为菌种的对数生长期(如图2)；

步骤6.鉴定SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)诱导成功；

将菌种扩大培养，取诱导前后大肠杆菌样品进行SDS-PAGE电泳，可见诱导后表达量明显增加，证明融合蛋白表达诱导成功(如图3)；

步骤7.SIRPα-TRAIL融合蛋白表达位置鉴定；

将活化后的SIRPα-TRAIL in BL21(DE3)菌液取1mL，添加于100mL LB液体培养基中，以上述培养条件培养12h，超声破碎大肠杆菌，取碎菌离心后上清、沉淀样品进行SDS-PAGE电泳，蛋白在沉淀中大量表达，而上清几乎没有表达，证明SIRPα-TRAIL为包涵体表达(如图4)；

步骤8.SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵体的洗涤及溶解；

将包涵体蛋白变为有生物活性的蛋白，首先是溶解包涵体，先将包涵体蛋白以2M尿素的缓冲液洗涤，尽可能洗涤除去在蛋白表达过程中包裹于包涵体外部的非目的性杂蛋白，然后利用8M尿素变性液将其溶解，取溶解后样品进行SDS-PAGE电泳，在SIRPα-TRAIL分子量处有蛋白表达，证明成功将包涵体表达变为可溶性表达(如图5)；

步骤9.SIRPα-TRAIL融合蛋白的纯化；

利用Ni柱亲和层析，将8M尿素溶解后的包涵体样品上样，选用不同浓度咪唑缓冲液洗脱Ni层析柱，低浓度的咪唑缓冲液将非目的性杂蛋白洗脱下，高浓度的咪唑缓冲液将SIRPα-TRAIL融合蛋白洗脱下来，将洗脱下的样品进行SDS-PAGE电泳，证明纯化出较为纯净的SIRPα-TRAIL融合蛋白(如图6)；

步骤10.融合蛋白的复性除盐；

将第一次Ni柱亲和层析纯化SIRPα-TRAIL融合蛋白加至G25层析柱中，加入缓冲液洗脱层析柱，将样品复性并除去咪唑尿素等，得到浓缩的SIRPα-TRAIL融合蛋白样品，将得到的样品进行SDS-PAGE电泳，分子量36kDa处即为SIRPα-TRAIL融合蛋白(如图7)；

步骤11.冷冻干燥；

将过完G25所得的融合蛋白冷冻干燥36小时后，得到SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末(如图8A)。粉末用ddH

一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白促吞噬功能的鉴定方法，包括如下步骤：将1×10

一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白促凋亡功能的鉴定方法，包括如下步骤：首先用Western Blot方法对OVCAR3、A2780、SKOV3卵巢癌细胞表面TRAIL受体DR4、DR5的蛋白表达水平进行检测，发现A2780的DR4、DR5表达明显高于OVAR3和SKOV3(如图14)，选用A2780细胞进行后续实验；

不同浓度SIRPα-TRAIL融合蛋白和TRAIL处理A2780细胞系24h，CCK8测OD值，结果显示，SIRPα-TRAIL融合蛋白与TRAIL具有类似的抑制卵巢癌细胞增殖的生物学活性，并检测出SIRPα-TRAIL融合蛋白和TRAIL在A2780细胞系中的EC50分别是34.3μg/mL和197.9ng/mL(如图15)，对SIRPα-TRAIL融合蛋白处理的A2780细胞进行Hochest33258凋亡染色，SIRPα-TRAIL融合蛋白的浓度20μg/mL，30μg/mL和40μg/mL处理均可见不同程度的癌细胞凋亡(如图16)，电镜下在SIRPα-TRAIL融合蛋白和TRAIL下均可见凋亡细胞核凋亡小体(如图17)，WesternBlot方法检测DR4及DR5均有表达，Cleaved-caspase8，Cleaved-caspase3，Cleaved-PARP，Bax表达明显增高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达降低(如图18、19)，流式细胞术检测，TRAIL组的晚期凋亡为11.04％，SIRPα-TRAIL融合蛋白组的晚期凋亡15.61％，表明SIRPα-TRAIL融合蛋白促卵巢癌凋亡能力比TRAIL单独作用强(如图20)，用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理A2780细胞2h后加入SIRPα-TRAIL融合蛋白作用24h，发现加入凋亡抑制剂组与SIRPα-TRAIL融合蛋白组相比凋亡蛋白Cleaved-caspase3，Cleaved-PARP表达明显被抑制(如图21)。

上述方法构建的重组SIRPα-TRAIL融合蛋白，在双靶点抗肿瘤中的应用。其是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。本发明基于从干预或阻断SIRPα-CD47相互作用方面入手，针对癌细胞膜和巨噬细胞膜上已知位点及可启动下游凋亡信号通路的经典理论，将TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)和SIRPα两个功能区的氨基酸序列进行重组，构建SIRPα-TRAIL融合蛋白，目标是阻断SIRPα与CD47的结合，促进巨噬细胞吞噬，同时利用TRAIL竞争癌细胞膜上特异性死亡受体DR4/DR5结合，不仅干预了CD47与SIRPα的结合，又能激活下游凋亡信号级联反应，促进癌细胞凋亡(如图1所示)。重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的设计开辟一种新的抗肿瘤治疗策略，是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。

以上所述为本发明较佳实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。