草甘膦抗性基因GR79和GAT的表达载体及应用

摘要

本发明涉及草甘膦抗性基因GR79和GAT的表达载体及应用。本发明提供的对草甘膦具有高耐受性的GR79基因和GAT基因的密码子优化并合成的新的DNA序列，以及利用双基因构建的植物表达载体pCGG，研究结果证明，转入了所述植物表达载体的转基因玉米不同组织中GR79和GAT基因可以正常转录和翻译，苗期叶片中GR79蛋白表达量为733.15‑2203.99ng/g，GAT蛋白表达量为101.56‑345.84ng/g，两蛋白在玉米中具有高表达量。结果表明转GR79和GAT两个基因玉米对靶标除草剂草甘膦具有高抗性，本发明对于利用这两个基因转化植物协同表达培育高抗草甘膦植物及其应用具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及GR79和GAT两个草甘膦抗性基因的表达载体以及在植物耐草甘膦中的组合应用。

背景技术

我国农田的主要杂草超过250种，分布面积达4000多万公顷，其中1000多万公顷农田受害严重。我国平均每年因草害造成作物减产约13％，直接经济损失占农作物总产值的10％～20％，利用化学方法来控制杂草已成为现代农业不可缺少的一部分。

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，凭借其广谱高效、环境友好等优点，现已成为世界上应用最广泛的农药品种。莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。在高等植物体内芳香族氨基酸中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成过程中，5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是关键性的酶之一。EPSPS在莽草酸代谢途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸(S3P)缩合。草甘膦是PEP的竞争类似物，其作用机理就是通过与EPSPS和S3P形成稳定的复合体EPSPS-S3P-草甘膦，竞争性地抑制EPSPS的活性，阻断了莽草酸-3-磷酸转化为5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，使芳香族氨基酸化合物的形成受阻，同时造成莽草酸大量积累，促使类黄酮以及酚类化合物等激素和关键性代谢物失调，打乱了生物正常氮代谢进而导致生物体的的死亡。

但由于除草剂的非选择性特点使其在使用过程中不可避免的会对农作物的生长发育产生影响。20世纪80年代以来，随着生物基因工程技术的迅猛发展以及对植物抗除草剂机理分子水平上的研究进展使得通过转基因技术让农作物获得耐除草剂性状成为可能。1983年第一个除草剂抗性烟草问世，标志着这一领域的研究从探索走向成功，至今已经有多种耐除草剂转基因作物进行商业化种植，如玉米、大豆、棉花、油菜等，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。目前商业化的耐除草剂转基因作物主要采用的有cp4-epsps、mepsps、pat等基因。

GR79和GAT基因是从草甘膦严重污染的土壤细菌宏基因组中分离并克隆。GR79基因编码EPSPS酶，草甘膦不能阻断GR79-EPSPS合酶催化PEP与S3P生成EPSP的反应，使植物芳香族氨基酸和其他化合物合成代谢继续进行，使植物获得抗除草剂能力，保护植物正常生长。GAT基因编码草甘膦-N-乙酰转移酶，草甘膦N-乙酰转移酶为作物抗草甘膦提供了不同于GR79-EPSPS途径的全新作用机制。在草甘膦-N-乙酰转移酶的作用下，乙酰辅酶A作为乙酰基供体，草甘膦分子的次级胺则作为乙酰基的受体，使草甘膦乙酰化失去除草剂活性，使转基因植物获得抗除草剂能力，保护植物正常发育生长。

GR79和GAT基因是创制耐除草剂植物的候选基因，研究者将35S启动子分别连接在GR79基因和GAT基因的前面构建了植物表达载体pGBIGRGAT转化棉花，获得转基因棉花，在T1代检测对草甘膦的耐受性，喷施草甘膦异丙胺盐溶液稀释至1/200(绝对浓度为0.205g/100ml草甘膦异丙胺盐)，喷施量为30升/亩，存活率在84％以上(CN 103981199 B)，在转基因棉花叶片中表现了低草甘膦残留量(Liang et al.Co-expression of GR79 EPSPS andGAT yields herbicide resistant cotton with low glyphosate residues.PlantBiotechnology Journal,2017,15:1622–1629)。

玉米是重要的农作物，目前转基因耐草甘膦玉米多选用的单基因EPSPS酶，Ren等将AM79基因(AM79基因即GR79基因，氨基酸序列相同)利用玉米Ubiquitin启动子连接豌豆RuBP羧化酶小亚基的叶绿体信号肽及AM79基因构建单基因载体转化玉米，获得了耐4倍剂量(3600g/公顷有效成分)的转基因玉米(Ren et al.Overexpression of a modifiedAM79aroA gene in transgenic maize confers high tolerance toglyphosate.Journal of Integrative Agriculture,2015,14(3):414–422)。在培育高抗草甘膦玉米，尤其选用功能不同的耐草甘膦基因，利用单子叶植物高表达的启动子提高外源基因的表达量，可获得田间草甘膦耐受性强的转基因玉米材料，减少田间人工除草的劳动力成本，更适于玉米的机械化种植。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明提供GR79和GAT两个草甘膦抗性基因在耐草甘膦中的组合应用，通过对GR79和GAT基因进行密码子优化并合成新的DNA序列，转入玉米中，实验表明，GR79和GAT基因有较高的蛋白表达量，且协同表达赋予玉米高耐草甘膦效果。

一种表达载体，其含有GR79和GAT两个草甘膦抗性基因，所述GR79基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述表达载体命名为植物表达载体pCGG，其骨架载体为pCAMBIA2300。

所述植物表达载体pCGG其结构如图2所示。

所述植物表达载体pCGG的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种表达载体在植物耐草甘膦中的应用，所述应用为将含编码GR79和GAT蛋白的基因的植物表达载体转化植物中表达GR79和GAT蛋白，使植物具有抗草甘膦的特性。

所述转化的方法为农杆菌介导法。

所述植物为玉米。

本发明对GR79(SEQ ID NO.1)和GAT(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列进行了密码子优化，并通过人工合成的方式合成了新基因GR79(SEQ ID NO.3)和GAT(SEQ ID NO.4)，构建GR79和GAT双价植物表达载体转化玉米，PCR检测阳性的76个双价耐除草剂转基因玉米事件经过田间连续两代的高浓度草甘膦筛选得到47个高抗草甘膦的转化事件。ELISA检测结果表明高抗草甘膦转基因玉米材料中GR79和GAT蛋白都稳定表达。研究结果证明，转入了上述双价植物表达载体的转基因玉米不同组织中GR79和GAT基因可以正常转录和翻译，苗期叶片中GR79蛋白表达量为733.15-2203.99ng/g(鲜重)，GAT蛋白表达量为101.56-345.84ng/g(鲜重)，两蛋白在玉米中具有非常高的表达量。对高抗草甘膦转基因玉米材料在4-5叶期进行田间草甘膦耐受性鉴定，实验结果表明，非转基因玉米喷施中剂量(有效成分900g/公顷)1倍量的草甘膦后，小区植株全部死亡。与转基因玉米未喷施除草剂相比，转基因玉米在喷施草甘膦后，不同处理(1倍、2倍、4倍田间使用中剂量)均未出现受害症状。在喷施中剂量8倍量(有效成分7200g/公顷)的草甘膦后，仍有6个转化事件生长未受影响。这证明获得的双价耐草甘膦转基因玉米具有很高的草甘膦抗性，具有生产应用的前景。田间非靶标除草剂耐受性检测结果表明转GAT和GR79双价耐草甘膦转基因玉米可以用其他类型的除草剂杀灭，不会成为“超级杂草”。此外与同期的研究工作比较发现，单表达GAT蛋白的耐草甘膦转基因玉米筛选得到高抗草甘膦除草剂的转化事件概率明显比双价耐草甘膦转基因玉米的低，而且部分单GAT高抗事件喷施高浓度草甘膦(中剂量4倍量)后前期叶片会出现轻微药害症状，喷施中剂量8倍量的草甘膦后无存活植株。这表明GR79和GAT基因协同表达更能提高玉米的耐草甘膦特性，对于培育具有自主知识产权的高耐草甘膦玉米具有非常重要的意义。

附图说明

图1为植物表达载体pCGAT示意图。

图2为植物表达载体pCGG示意图。

图3为T1代GAT单价转基因玉米中GAT基因(A)以及GAT和GR79双价转基因玉米中GAT基因(B)和GR79基因(C)的PCR检测。

其中M为DNA分子量标准Super Marker；CK+：以质粒pCGG为模板扩增产物；CK-：是以非转基因玉米基因组DNA为模板扩增的产物；0：空白，以水为模板扩增产物；1-9：以T1代转基因玉米基因组DNA为模板扩增产物。

图4为GAT和GR79双价转基因玉米田间草甘膦筛选结果。

其中图A为T1代双价转基因玉米喷洒中剂量2倍量的草甘膦后的结果，图B为T2代双价转基因玉米喷洒中剂量4倍量的草甘膦后的结果；图C为高抗草甘膦的双价转基因玉米喷洒中剂量8倍量的草甘膦后的结果。

图5为GAT单价耐草甘膦玉米喷洒中剂量4倍量(A)和8倍量(B)的草甘膦后的结果。

图6为8个GAT单价耐草甘膦玉米事件苗期叶片的GAT蛋白表达量。

图7为47个GAT和GR79双价高抗草甘膦玉米事件苗期叶片的GAT(A)和GR79(B)蛋白表达量。

图8为3代GAT和GR79双价高抗草甘膦玉米GG2、GG3和GG4的Southern blot检测图。

其中图A为GAT探针检测结果，图B为GR79探针检测结果。M为DNA分子量标准由7条DNA片段组成，条带大小自上而下分别为23,130bp、9,416bp、6,557bp、4,361bp、2,322bp、2,027bp和564bp；CK+：pCGG质粒/HindIII酶切；CK-：非转基因玉米基因组DNA；Blank：空白对照。

图9为AT和GR79双价耐草甘膦玉米的田间非靶标除草剂耐受性检测。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

下面所涉及的生物材料在本申请人的实验室均有保藏，可以对外发放。

1、GR79和GAT基因的密码子改造和优化

GR79基因是从草甘膦严重污染的土壤细菌宏基因组中分离并克隆的，具有自主知识产权(专利号：ZL 200710177090.1)。GR79基因的编码序列有1338bp，核苷酸序列见SEQID NO.1，其编码的EPSPS酶由445个氨基酸组成。按照植物偏好的密码子对GR79基因的编码序列进行优化，原始GR79基因GC含量45.85％，优化后的GR79基因GC含量为64.56％，优化后的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。GAT基因是通过免培养技术构建草甘膦污染土壤微生物总DNA的基因文库，用功能筛选的方法克隆得到的，具有自主知识产权(专利号：ZL200510086626.X)。GAT基因的编码序列有441bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.2，其编码的草甘膦乙酰转移酶由146个氨基酸组成。按照植物偏好的密码子对GAT基因的编码序列进行优化，原始GAT基因GC含量47.86％，优化后的GAT基因GC含量为63.90％，优化后的核苷酸序列见SEQ ID NO.4。

2、GAT单价、GAT和GR79双价植物表达载体的构建

人工合成优化后的GAT基因和GR79基因，同时在GAT基因上游增加了增强基因表达的OMK序列，在GR79基因上游增加了增强基因表达的OMK序列和玉米叶绿体信号肽序列ZmRuBP。商用载体pCAMBIA2300通过XhoI酶切去掉T-DNA中的nptII基因，将合成的OMK-GAT片段通过无缝克隆的方式连入，构建获得的载体称为pCGAT(载体示意图见图1)，该载体含有单GAT基因。pUC57-UN是一个中间载体，载体中含有一个Ubiquitin启动子和一个NOS终止子(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，合成的OMK-RuBPs-GR79片段通过BamHI和KpnI酶切连入pUC57-UN载体，通过HindIII和EcoRI酶切将GR79表达盒连入pCGAT载体中，构建获得最终载体pCGG(载体示意图见图2)，该载体含有GAT和GR79基因。

3、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米的获得

本发明将载体pCGAT和pCGG通过冻融法分别转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至恢复培养基上培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛选剂的筛选培养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基上见光分化，见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并转移到再生培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培养两周后，待转化苗生长状态良好后转移至温室，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行授粉，并收获果实。

所述培养基：

侵染培养液：N6盐和N6维生素(Chu等，Science Sinica，1975，18:659-668)，1.5mg/L 2,4-D，0.7/L g脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖(pH 5.2)，过滤灭菌，于4℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮(AS)，终浓度为100μM；

共培养培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的AS，300mg/L的半胱氨酸；

恢复培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/LMES，4g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银和200mg/L的羧苄青霉素；

筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂1mM草甘膦；

再生培养基：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶(pH5.8)，高压灭菌。

所述玉米幼胚为新鲜剥离的1.2mm长的幼胚。

所述农杆菌菌液中添加有100μM乙酰丁香酮

4、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米植株PCR检测

采用CTAB法提取转化玉米植株的基因组DNA，按照GAT和GR79优化后的序列设计引物，GAT引物序列：GAT-F1:5'-TCGACGTGAACCCGATCAAC-3'，GAT-R1:5'-TCTGCTCCCTGTAGCCCTCC-3'；GR79引物序列：GR79-F1:5'-TCAGCAGGGCGAGTGGA-3'，GR79-R1:5'-TCGTCGTGCGGGTTCAG-3'。扩增GAT基因获得的目的片段大小为249bp，扩增GR79基因获得的片段大小为831bp；

GAT基因PCR反应体系(20μL)：

GAT基因PCR反应条件：

95℃3min；95℃20s,58℃15s,72℃20s,30cycles；72℃5min；4℃pause。

GR79基因PCR反应体系(20μL)：

GR79基因PCR反应条件：

95℃3min；95℃20s,59.4℃15s,72℃40s,30cycles；72℃5min；4℃pause。

PCR检测结果见图3。

在转GAT和GR79基因的玉米转化中，共获得103株T0代转化植株，经过PCR检测GAT和GR79双阳性转基因玉米植株为76株，阳性率为73.79％；同时获得转GAT单基因46个转化体，PCR检测阳性植株38株，阳性率为82.6％。

5、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米高抗草甘膦事件的筛选

PCR检测GAT和GR79双阳性的76个转化事件T1代材料播种于大田，4叶期喷施草甘膦，草甘膦除草剂施用量为农药登记标签中剂量(有效成分900g/公顷)，存活72个转化事件，无药害94.7％，继续施用2倍中剂量的草甘膦(有效成分1800g/公顷)，用药4周后调查，其中63个转化事件无药害症状(图4中A)。将筛选得到的63个转化事件T2代材料播种，4-5叶期喷施草甘膦，草甘膦除草剂施用量为农药登记标签中剂量(有效成分900g/公顷)的1倍、2倍、4倍，用药4周后调查和记录每个转化事件的成活率、药害症状，其中47个转化事件在4倍中剂量草甘膦喷施无药害症状(图4中B)，为高抗草甘膦材料，占76个阳性转基因材料的61.84％。继续加大筛选浓度，在达到中剂量8倍(有效成分7200g/公顷)时，有6个转化事件生长未受影响(图4中C)。

为了确定双基因组合应用对高耐受草甘膦的作用，对转GAT单基因的转基因玉米进行了草甘膦耐受性实验，经过同样的筛选过程最终得到8个可抗4倍草甘膦转化事件，占38个阳性转基因材料的21.05％。两者相比，转GAT和GR79双价耐草甘膦转基因玉米更易获得高抗草甘膦材料。此外转GAT基因高抗草甘膦的玉米转化事件虽然能够耐受中剂量4倍的草甘膦，但与GAT和GR79双价转基因玉米高抗草甘膦事件相比，部分事件在喷施中剂量4倍的草甘膦后的几天时间内叶片会出现轻微药害症状(图5中A)。转GAT基因玉米在中剂量8倍(有效成分7200g/公顷)草甘膦喷施后无存活植株(图5中B)。

6、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米的ELISA检测

选用GAT酶联免疫定量检测试剂盒(上海佑隆生物科技有限公司，中国)检测转基因玉米中GAT蛋白的表达量。选用AM79 EPSPS酶联免疫定量检测试剂盒(上海佑隆生物科技有限公司，中国)检测转基因玉米中GR79蛋白的表达量(AM79蛋白与GR79蛋白的氨基酸是相同的)。按照试剂盒中的操作说明对8个GAT单价转基因玉米和47个GAT和GR79双价转基因玉米高抗草甘膦事件的苗期叶片进行目的蛋白的定量检测。检测结果表明GAT单价、GAT和GR79双价高抗草甘膦转基因玉米中目的蛋白都表达，其中GAT单价转基因玉米中GAT蛋白表达量为151.57～368.73ng/g(鲜重)(图6)；GAT和GR79双价转基因玉米中GAT蛋白表达量为101.56～345.84ng/g(鲜重)(图7中A)，GR79蛋白表达量为733.15～2203.99ng/g(鲜重)(图7中B)。ELISA检测结果表明GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米中GAT蛋白的表达量差别不大，双价转基因玉米中表达的GR79蛋白使其比GAT单价转基因玉米可以耐受更高浓度的草甘膦。

7、GAT和GR79双价转基因玉米Southern blot检测

选取部分GAT和GR79双价高抗草甘膦转基因玉米事件基因组DNA(50μg)，分别用HindIII和BamHI完全酶切基因组DNA，酶切产物在0.7％(W/V)琼脂糖凝胶上30V过夜电泳后将DNA转移至HyBordTM-N+尼龙膜(GE，英国)上。pCGG载体(HindIII酶切产物，12.4Kb)作为阳性对照，非转基因玉米基因组DNA为阴性对照，水为空白对照。检测探针为GAT基因中的一段249bp序列及GR79基因中的一段831bp序列，通过PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche,德国)制备标记探针。探针扩增引物序列：GAT-probe-F:5'-TCGACGTGAACCCGATCAAC-3'，GAT-probe-R:5'-TCTGCTCCCTGTAGCCCTCC-3'；GR79-probe-F:5'-TCAGCAGGGCGAGTGGA-3'，GR79-probe-R:5'-TCGTCGTGCGGGTTCAG-3'。按照地高辛DNA标记和检测试剂盒II(Roche，德国)的方法进行Southern blot检测，用AI600(GE，美国)自动化学发光成像分析系统进行图像分析，结果见图8。GG2转基因株系是单拷贝插入，GG3和GG4是二个拷贝和三个拷贝的插入。

8、GAT和GR79双价转基因玉米对非靶标除草剂的耐受性检测

本试验设3种除草剂，分别为玉米田常用的硝磺异丙莠(硝磺草酮3.5％、异丙草胺15％、莠去津15％)，及对玉米敏感的草铵膦(草铵膦有效成分20％)，高效氟吡甲禾灵(有效成分10.8％)。设置4个处理：(1)不喷除草剂；(2)喷施硝磺异丙莠；(3)喷施草铵膦；(4)喷施高效氟吡甲禾灵。喷施剂量为农药登记标签的高剂量。在玉米生长至4～6叶期进行茎叶喷施。分别在用药后1周、2周和4周调查成苗率和药害症状。结果表明在喷施相同剂量的非目标除草剂硝磺异丙莠处理下GAT和GR79双价转基因耐除草剂玉米与和非转基因对照玉米都未有药害症状，植株正常生长；在分别喷施相同剂量的草铵膦、高效氟吡甲禾灵处理下，GAT和GR79双价转基因耐除草剂玉米与和非转基因对照玉米全部死亡(图9)。硝磺异丙莠是玉米田苗后除草剂，对转基因玉米和非转基因玉米都未造成危害，而草铵膦和高效氟吡甲禾灵对玉米有很强的的危害，从转基因生物安全性的角度来看，耐草甘膦玉米对草铵膦和高效氟吡甲禾灵敏感，说明可以用其他除草剂杀灭耐草甘膦玉米，防止耐除草剂玉米徒长，成为“田间超级杂草”。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 草甘膦抗性基因GR79和GAT的表达载体及应用

<141> 2021-04-08

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgtcacatt ctacctctag gtccccatgg tccaaggcta ctgagtacca tgaggcactt 60

gtaacaccaa cctcgaacaa gattaacggt gaaatatttg tacctggctc aaagagctat 120

accaatcgag ctctaatcat tgctgcttta gcagagggga cttctacact taagggaata 180

ttaaagagtg atgattccta ctggtgtatt gatgccttaa ggaggcttgg cattaagatc 240

gaggttgccg aagagacggt caccattcat ggctgtggag gaaaatggcc agttcaatct 300

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<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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aagccactgg tggacgctct cacccagctg ggcggcagga tcgagtacct cacggagcac 480

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ggcaacgtct ccagccagtt cctgtccggc ctcctgatcg cttccccata cgctagcgag 600

gccgtgtcca tcgaggtcat caacggcctc gtgcagccga gctacatcgc gatcaccatc 660

cagctgatgc gcgagttcgg cgccaaggtg gagcacaacg aggactactc cctcttcaag 720

gtctacccca ccggctacca gggcagggac acgatcctgg aggctgacgc tagcacggct 780

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taccacagct accagccaga cgctcgcttc atcgacgtgc tggagcagat gggctgcgag 900

gtcatcaaga acgagtcctt cctggaggtg accggcccaa cgaggctgaa gggcggcttc 960

gaggtcgaca tgaagcccat gtccgaccag gccctcacca tcggcgctct ggctccattc 1020

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atcgccgtca tctgctccag cctccagcag atgggcgtgc aggtcgagga gagggaggac 1140

ggcttcacca tctacccagg ccagccagtg ggcaccacgc tgaacccgca cgacgaccac 1200

cgcaacgcca tggtcttcgg cctcctgggc gtgaaggtcc cgcacatcag gatcgtggac 1260

cccggctgcg tctccaagac gtgcccagcg tacttcgagg agctccagaa gttcggcatc 1320

cacgtggagt acaactga 1338

<210> 4

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgatcgacg tgaacccgat caacgctgag gacacctacg agctcaggca ccgcatcctc 60

aggccaaacc agccaatcga ggcctgcatg ttcgagtccg acctcctgag gggcgctttc 120

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atgtacaaga ggatcgcgtg a 441

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<211> 12401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta 60

ataaacgctc ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt 120

aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt 180

caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 240

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tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa 480

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tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac 960

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gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg 1440

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