一种甲状腺乳头状癌生物标记物及其应用

摘要

本发明涉及一种甲状腺乳头状癌的生物标记物及PIM1基因抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用，所述生物标记物为PIM1基因及其表达产物。本发明研究PIM1基因在PTC病理发展过程中的作用，发现PIM1在PTC的发生发展中可能起着重要的致癌作用，并且PIM1与NOX4的表达显著相关，即PIM1在PTC中受NOX4的调控，从而发挥其在氧化损伤中的作用。可见，本发明对PTC的发病机制的理论研究具有重要的意义和价值，并且，本发明中的生物标记物能作为PTC诊断的标记物，从而提高PTC诊断的准确性，为PTC诊断产品的研究提供理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术与肿瘤学领域，尤其涉及一种甲状乳头状癌生物标记物及其应用。

背景技术

甲状腺乳头状癌(PTC)属于甲状腺疾病中的一种，且为甲状腺疾病中比较常见的，约占甲状腺癌的80％左右。甲状腺乳头状癌患病人群多见于儿童或者是年龄在40岁以下的女性患者，同时，甲状腺乳头状癌肿瘤生长较缓慢，可以在甲状腺内局限于数年，但是它也可以从源发部位向腺体其他部分或者是淋巴结转移。

近年来研究发现PIM1是一个癌基因，其在乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、食道癌、肝癌等多种肿瘤中发挥促癌作用。原癌基因PIM1定位在第6号染色体长臂上(6p21.1～p21.31)，其表达产物PIM1蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，PIM1可以通过磷酸化下游的一系列底物发挥其致癌效应。目前已经表明的PIM1的底物包括BAD、Skp-2、 p21AWF、CXCR4、STAT3、Eif4B及RUNX3等，但关于PIM1的作用机制尚未完全阐明。

甲状腺乳头状癌的发病机理是近年来肿瘤学领域研究的重点，例如专利号为ZL201510574162.0(CN105039581B)的中国发明专利《一种女性PTC发病风险相关的SNP 标记及其应用》、申请号为CN 201911348184.X(公开号为CN110982901A)的中国发明专利《用于侵袭性甲状腺乳头状癌诊断的循环环状RNA标志物及应用》、申请号为 CN 201911415563.6(公开号为CN 111079862 A)的中国发明专利《基于深度学习的甲状腺乳头状癌病理图像分类方法》等专利公开的内容。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种甲状乳头状癌的生物标记物。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种PIM1基因抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种甲状腺乳头状癌的生物标记物，其特征在于，所述生物标记物为PIM1基因及其表达产物。

PIM1是一个癌基因(PIM1 Human 5292NM_001243186)，其在乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、食道癌、肝癌等多种肿瘤中发挥促癌作用。原癌基因PIM1定位在第6号染色体长臂上(6p21.1～p21.31)，其表达产物PIM1蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性， PIM1可以通过磷酸化下游的一系列底物发挥其致癌效应。目前已经表明的PIM1的底物包括BAD、Skp-2、p21AWF、CXCR4、STAT3、Eif4B及RUNX3等。

进一步，所述生物标记物为PIM1蛋白，且该PIM1蛋白的表达受NOX4的调控。

进一步，所述PIM1蛋白的表达水平与NOX4蛋白水平正相关。

为进一步解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种PIM1基因抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用。

进一步，所述抑制剂为抗PIM1基因表达的PIM1siRNA，其序列为：

SEQ ID NO.1(5‘-(CAAGAUCUCUUCGACUUCA)dTdT-3’)、

SEQ IDNO.2(5‘-(UGAAGUCGAAGAGAUCUUG)dTdT-3’)。

进一步，所述抑制剂为抗NOX4基因表达的NOX4iRNA，其序列为：

SEQ ID NO.3(5‘-(CAUCUGUUCUUAACCUCAA)dTdT-3’)、

SEQ IDNO.4(5‘-(UUGAGGUUAAGAACAGAUG)dTdT-3’)。

进一步，所述抑制剂为SGI-1776或GLX351322中的至少一种。

本发明的研究发现PIM1在PTC组织中过表达，其表达与淋巴结转移、包膜浸润、肿瘤大小等临床参数显著相关。同时，通过对TCGA数据库中501例PTC患者的分析，结果显示PIM1高表达患者的总生存率(OS)和无进展生存率(DFS)明显低于PIM1低表达患者。可见PIM1的表达与PTC的恶性表型和预后密切相关，PIM1在PTC中起重要作用。

本发明的体外试验中发现两种PTC细胞系(BCPAP和TPC-1)的PIM1水平均显著高于正常甲状腺细胞，并且采用PIM1抑制剂SGI-1776对BCPAP细胞和TPC-1细胞进行处理，表明SGI-1776对两种PTC细胞的增殖和运动能力均有抑制作用，并能诱导细胞凋亡，可见PIM1在PTC的发生发展中起着重要的致癌作用。

PIM1在氧化应激中也起着重要作用，本发明采用SGI-1776处理BCPAP细胞和 TPC-1细胞后，检测到活性氧的产生增加，可见，PIM1可通过调节ROS而参与PTC的发生发展。

进一步，本发明研究发现NOX4在PTC组织中的表达明显高于邻近正常组织。 NOX4的表达水平还与多种临床病理特征相关，其中，晚期T期、淋巴结转移和局部浸润患者中NOX4的表达高于早期T期、无淋巴结转移和非局部浸润患者，进一步表明了 NOX4在PTC中的致癌作用。

此外，通过对TCGA数据库中501例PTC患者的分析，发现PIM1和NOX4的表达显著相关。将501例PTC患者进一步分为原位PTC 493例和转移PTC 8例，PIM1和 NOX4在两组中的表达均显著相关。并且，采用NOX4抑制剂(GLX351322)处理BCPAP 和TPC-1细胞，结果表明，PTC细胞中PIM1表达下调，同时，NOX4 siRNA处理PTC 细胞后也得到同样的结果，此外，组织学结果也显示PIM1与NOX4相关。可知，PIM1 在PTC中受NOX4的调控，从而发挥其在氧化损伤中的作用。

在多种恶性肿瘤中均已经检测到ROS产生的增加，它可以激活致瘤信号。据报道，PIM1激酶可以通过促进NRF2/ARE活性增强引起的抗氧化基因表达来降低细胞ROS水平，从而避免肿瘤细胞死亡。本发明研究发现缺乏PIM1激酶或经PIM1抑制剂处理的细胞可导致致命的ROS积聚，最终导致细胞不耐受和死亡，表明PIM1激酶是细胞氧化还原信号的重要调节因子。本发明中，SGI-1776处理PTC细胞后，ROS的产生增加，表明PIM1可能下调ROS。

肿瘤学数据库显示，甲状腺癌抗氧化酶系统中SOD2和GPX2的表达高于正常甲状腺组织。本发明的免疫组织化学结果表明，SOD2和GPX2在PTCs组织中的表达明显高于正常甲状腺组织。因此，PTC中的SOD2和GPX2可能在ROS的去除中起主要作用。本发明中用PIM1siRNA敲除PTC细胞中的PIM1后，发现SOD2和GPX2表达下调。此外，用NOX4 siRNA敲除PTC细胞中的NOX4后，发现PIM1、SOD2和GPX2 均下调。此外，组织学结果还表明PIM1与SOD2和GPX2相关。可见，PIM1可受NOX4 调控，进而调节SOD2和GPX2，从而避免致命性ROS积聚，导致肿瘤进展。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明研究PIM1基因在PTC病理发展过程中的作用，发现PIM1在PTC的发生发展中可能起着重要的致癌作用，并且PIM1与 NOX4的表达显著相关，即PIM1在PTC中受NOX4的调控，从而发挥其在氧化损伤中的作用。可见，本发明对PTC的发病机制的理论研究具有重要的意义和价值，并且，本发明中的生物标记物能作为PTC诊断的标记物，从而提高PTC诊断的准确性，为PTC 诊断产品的研究提供理论基础，此外，本发明中的PIM1基因抑制剂能为抗甲状腺乳头状癌制剂的研究提供理论基础，进而提高PTC治疗的疗效。

附图说明

图1为本发明实施例中PIM1在Nthy-Ori-3细胞、BCPAP细胞以及TPC-1细胞中的表达的蛋白印迹图；

图2为本发明实施例中PIM1在Nthy-Ori-3细胞、BCPAP细胞以及TPC-1细胞中的表达的柱状图；

图3为本发明实施例中SGI-1776处理后PIM1在BCPAP细胞以及TPC-1细胞中的表达的蛋白印迹图；

图4为本发明实施例中PIM1siRNA转染后BCPAP细胞以及TPC-1细胞的细胞活力情况；

图5为本发明实施例中TPC-1细胞的细胞活力与SGI-1776剂量关系示意图；

图6为本发明实施例中BCPAP细胞的细胞活力与SGI-1776剂量关系示意图；

图7为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后BCPAP细胞和TPC-1细胞的集落形成试验结果；

图8为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后TPC-1细胞和BCPAP细胞的克隆形成；

图9为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后TPC-1细胞和BCPAP细胞的凋亡率；

图10为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后TPC-1细胞和BCPAP 细胞的创面愈合率；

图11为本发明实施例中PIM1高表达患者和PIM1低表达患者的总生存率；

图12为本发明实施例中PIM1高表达患者和PIM1低表达患者的无进展生存率；

图13为本发明实施例中TCGA数据库分析中PIM1和NOX4的表达的关系；

图14为本发明实施例中TCGA数据库分析中原位PTC和转移PTC中PIM1和 NOX4的表达的关系；

图15为本发明实施例中5μM和10μM的GLX351322处理后BCPAP细胞以及TPC-1 细胞中的PIM1表达的蛋白印迹图；

图16为本发明实施例中5μM和10μM的GLX351322处理后BCPAP细胞中PIM1 表达的柱状图；

图17为本发明实施例中5μM和10μM的GLX351322处理后TPC-1细胞中PIM1 表达的柱状图；

图18为本发明实施例中NOX4敲除后BCPAP细胞以及TPC-1细胞中PIM1、SOD2、GPX2、CDK4和Cyclin D1表达的蛋白印迹图；

图19为本发明实施例中患者PTC组织及邻近正常组织(甲状腺)的免疫组织化学染色电镜图；

图20为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后BCPAP细胞的流式细胞术结果；

图21为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后TPC-1细胞的流式细胞术结果；

图22为本发明实施例中2.5μM和5μM的SGI-1776作用后BCPAP细胞及TPC-1 细胞的流式细胞术结果的柱状图；

图23为本发明实施例中NOX4敲除后TPC-1细胞中PIM1、SOD2、GPX2、CDK4 和CyclinD1表达的柱状图；

图24为发明实施例中NOX4敲除后BCPAP细胞中PIM1、SOD2、GPX2、CDK4 和CyclinD1表达的柱状图；

图25为本发明实施例中PIM1 siRNA转染后TPC-1细胞中SOD2、GPX2、CDK4 和CyclinD1蛋白表达的柱状图；

图26为本发明实施例中PIM1 siRNA转染后BCPAP细胞中SOD2、GPX2、CDK4 和CyclinD1蛋白表达的柱状图；

图27为本发明实施例中PIM1 siRNA转染后BCPAP细胞以及TPC-1细胞中SOD2、GPX2、CDK4和CyclinD1蛋白表达的蛋白印迹图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：细胞培养

Nthy-Ori-3细胞(正常甲状腺细胞系)、BCPAP细胞(突变型乳头状甲状腺癌细胞)和TPC-1细胞(野生型乳头状甲状腺癌细胞)均购自中国科学院上海生物科学研究所中心细胞资源。将Nthy-Ori-3和BCPAP细胞系置于RPMI-1640(Gibco，美国)培养基中，该培养液中加入10％的胎牛血清(Gibco，Carlsad，CA)，放入37℃、5％CO

实施例2：小干扰RNA的转染

设计并获得了NOX4和PIM1 siRNA序列及其阴性对照(中国江苏，百奥迈科生物技术有限公司)，如下所示。用

NOX4 siRNA序列：

正：5‘-(CAUCUGUUCUUAACCUCAA)dTdT-3’，

反：5‘-(UUGAGGUUAAGAACAGAUG)dTdT-3’；

PIM1 siRNA序列：

正：5‘-(CAAGAUCUCUUCGACUUCA)dTdT-3’，

反：5‘-(UGAAGUCGAAGAGAUCUUG)dTdT-3’。

实施例3：SGI-1776处理

将SGI-1776(Selleckchem)溶于DMSO制成浓度为5mmol/L的SGI-1776溶液，将制备的SGI-1776溶液置于-80℃的冰箱中保存备用。

用终浓度为2.5μM和5μM的SGI-1776溶液分别处理BCPAP和TPC1细胞24h、48h及72h，并以终浓度为0μM的SGI-1776作为对照组。实验中，培养基中对细胞活力无显著影响的二甲基亚砜的最高浓度为0.05％。

实施例4：细胞增殖试验

采用细胞计数试剂盒(CCK-8)(BestBio，BB-4202-2)检测细胞增殖，具体过程如下：

将BCPAP和TPC-1细胞接种于96孔板中24h后，分别用不同终浓度的SGI-1776 溶液处理BCPAP和TPC-1细胞48h和72h。SGI-1776在BCPAP细胞中的终浓度分别为 1.25μM、2.5μM、5μM和10μM，而在TPC-1细胞中的终浓度分别为1μM、2μM、3μM、 4μM和5μM，试验中均以0μMSGI-1776为对照组。试验结束后弃去原培养基，用含 10％CCK-8的100μl新鲜培养基代替。37℃孵育4h后，用微板仪在450nm波长处测定细胞吸光度，测定过程中至少重复三次。

实施例5：集落形成试验

BCPAP和TPC-1细胞在6孔板中以每孔1000个细胞的密度培养，然后将细胞暴露于2.5μM、5μM或10μM的SGI-1776作用72h。新鲜培养基冲洗后，细胞生长5～7d， 0.5％结晶紫染色(WB0026，中国达文生物科技公司生产)评价菌落生长情况。

实施例6：划痕试验

BCPAP和TPC-1细胞培养于6孔板中，含3％胎牛血清的培养液浓度为80％～90％/孔。接种后24h，用无菌微量移液管尖端划伤创面，然后用含SGI-1776(0μM、2.5μM、 5μM)的培养基冲洗更换。在100×Magnifi阳离子显微镜(IX45-3，日本奥林巴斯)下观察并记录0h、24h、48h和72h的细胞迁移情况，最后在随机选择的三个fi区域中测量划痕区域的距离。

实施例7：细胞内活性氧的测定

为了定量检测细胞内ROS水平，在6孔培养板上培养1×10

实施例8：细胞凋亡分析

1×10

实施例9：GLX351322处理

GLX351322(835598-94-2，MedChemExpress)用二甲亚砜溶解，得到浓度为20mmol/L的MedChemExpress)溶液，并将制备的GLX351322溶液保存在-80℃的冰箱中备用。

用终浓度为5μM或10μM的GLX351322溶液分别处理BCPAP和TPC-1细胞24h 及72h，以终浓度为0μM的GLX351322溶液作为对照组。试验中，培养基中对细胞活力无显著影响的二甲基亚砜的最高浓度为0.05％。

实施例10：TCGA数据库分析

在TCGA(肿瘤基因组图谱)数据库中收集501例PTC患者的PIM1和NOX4的 mRNA表达，采用Kaplan-Meier进行分析。

实施例11：蛋白印迹分析。

收集经过上述实施例中处理或干预的细胞，并将其裂解在含有磷酸酶抑制剂鸡尾酒 (CW2383，CWBIO)和PMSF(T0789，TargetMol)的RIPA裂解缓冲液(G2002， Servicebio)中。根据规范，将裂解产物在12000g的4℃下离心10min以除去碎片。采用BCA蛋白分析试剂盒(P0010，Beyotime)测定所有样品的蛋白质浓度，所有样品在使用前都保存在-30℃的冰箱中。

采用12％SDS-PAGE电泳对每个蛋白质样品进行分离，然后将凝胶上的所有蛋白质样品转移到PVDF膜(PAL，4406TC)上，用含5％脱脂奶粉的TBST(P004E，AURAGENE) 室温封闭膜2h，以防止非特异性结合。印迹与PIM1一抗(工作稀释度1：2000)孵育； NOX4(14347-1-AP，Proteintech，1：500稀释)，SOD2(24127-1-AP，Proteintech，(1： 5000稀释)，GPX2(GTX100292，Genetex，1：1000稀释)，CDK4(ET1612-1，华比奥，1：3000稀释)，Cyclin D1(ET1601-31，华为，1：3000稀释)，以及β-actin(AC004， Abconal，1：5000稀释)，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗(SA009，AURAGENE) 在室温下反应2h。

用TBST清洗后用ECL试剂盒(FD8020，FDbio-Dura ECL Kit)暴露。最后，使用Bio-Rad GelDoc XR进行图像采集和分析，并使用Image J(MD，美国国立卫生研究院)测量密度。

上述实施例的试验结果的统计分析使用IBM SPSS软件(版本22.0，IBM Corp，Armonk，NY)进行统计分析。具体地，采用卡方检验、Fisher精确检验或其对分类变量的推广，体外实验结果用均值±标准差表示，统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，采用Pearson相关分析方法分析肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中mRNAs之间的相关性，生存分析采用Kaplan-Meier法，显著性评价采用对数秩和检验，P<0.05定义为差异有统计学意义。

上述实施例1～实施例11的试验结果如下：

1、SGI-1776对BCPAP和TPC-1细胞PIM1蛋白表达的影响

Western blot分析PIM1在PTC细胞系(BCPAP和TPC-1细胞)和正常甲状腺细胞系(Nthy-Ori-3细胞)中的表达。结果表明，PIM1在BCPAP和TPC-1细胞中的表达水平明显高于在Nthy-Ori-3细胞中的表达水平，如图1和图2所示。经SGI-1776处理后，用Western blot检测BCPAP和TPC-1细胞中PIM1蛋白的表达水平，与对照组相比，暴露于2.5μM或5μM的SGI-1776后，PIM1蛋白水平显著降低，如图3所示，表明SGI-1776 能有效抑制两种细胞中PIM1的表达。

2、SGI-1776对BCPAP和TPC-1细胞增殖、集落形成、迁移和凋亡的影响

将PIM1或对照siRNA转染BCPAP和TPC-1细胞48h后，用CCK-8法检测细胞活力。结果表明，与对照siRNA相比，转染PIM1siRNA的两个细胞的活力都降低了，如图4所示。此外，SGI-1776能以剂量依赖的方式抑制TPC-1和BCPAP细胞的生长，如图5和图6所示。此外，如上所述在2.5μM和5μM(如图3所示)下，SGI-1776处理后PIM1蛋白水平显著降低。因此选择2.5μM SGI-1776和5μMSGI-1776浓度进行后续实验。

克隆形成分析证实，SGI-1776在2.5μM和5μM水平下显著抑制TPC-1和BCPAP 细胞的克隆形成，如图7所示。如图8和图9所示，SGI-1776诱导TPC-1和BCPAP细胞凋亡显著增加，且呈剂量依赖性。此外，采用伤口愈合实验评价SGI-1776对细胞迁移的影响，如图10所示，经2.5μM或5μM的SGI-1776作用24h、48h或72h后，两种细胞系在各个时间点的创面愈合率均明显低于对照组。说明SGI-1776能有效抑制 BCPAP和TPC-1细胞的增殖、集落形成、迁移，促进细胞凋亡。

3、PIM1在TCGA数据库中与NOX4相关

收集501例PTC患者的PIM1和NOX4的mRNA表达，Kaplan-Meier结果显示， PIM1高表达患者的总生存率(OS)和无进展生存率(DFS)均低于PIM1低表达患者，表明 PIM1与PTC患者的预后显著相关，如图11和图12所示。如图13所示，PIM1和NOX4 的表达显著相关，如图14所示，501例PTC中有493例为原位PTC，8例为有转移的 PTC，两组中NOX4和PIM1的表达也呈高度相关。

4、GLX351322处理后BCPAP和TPC-1细胞中NOX4、PIM1、SOD2、GPX2、CDK4 和CyclinD1的表达

为了确定NOX4与PIM1在PTC中的关系，用NOX4抑制剂GLX351322处理两株 PTC细胞后，用Western blot检测PIM1蛋白的变化。结果显示，如图15所示，经5μM 和10μM的GLX351322处理后，两种细胞中PIM1的表达均显著降低。此外，GLX351322 对PIM1的表达具有剂量依赖性，提示PIM1在PTC中受NOX4的调控。半定量分析与上述Western blot结果一致，如图16和图17所示。

如图18所示，NOX4被敲除后，两个细胞中的PIM1、SOD2、GPX2、CDK4和 Cyclin D1表达下调，表明PIM1、SOD2、GPX2、CDK4和CyclinD1蛋白的表达与NOX4 相关。半定量分析进一步验证了SGI-1776可提高BCPAP和TPC-1细胞的ROS水平，如图19所示。

如图20、图21以及图22所示，SGI-1776与未处理的细胞相比，可显著诱导剂量依赖性的荧光强度增加。此外，如图23和图24所示，提示PIM1抑制剂SGI-1776可提高BCPAP和TPC-1细胞的ROS水平。

5、PIM1 siRNA转染BCPAP和TPC-1细胞后PIM1、SOD2、GPX2、CDK4和Cyclin D1的表达

研究表明PIM1的过表达与肿瘤抵抗ROS积聚密切相关，并促进PTC细胞的进展。此外，在NOX4被击倒后，PIM1和抗氧化蛋白(SOD2和GPX2)的表达下调。通过Western blot检测PIM1 siRNA转染后SOD2、GPX2、CDK4和CyclinD1蛋白的表达，以确定 SOD2和GPX2是否因PIM1的改变而改变。

如图27所示，两种细胞中SOD2、GPX2、CDK4和Cyclin D1的蛋白水平均下调，此外，如图25和图26的半定量分析也进一步验证了该结果。

6、癌组织及癌旁正常组织中PIM1、NOX4、SOD2、GPX2的表达。

选取癌组织和癌旁正常组织进行免疫组织化学分析(由浙江省肿瘤医院采用常规方法处理)，检测PIM1、NOX4、SOD2和GPX2的表达水平，这些蛋白主要在癌和甲状腺组织的胞核和胞浆中表达，如图19所示。癌组织中高表达PIM1、NOX4、SOD2、 GPX2分别为50.8％(61/120)、64.2％(77/120)、57.5％(69/120)、21.7％(26/120)，与癌旁正常组织分别为15.8％(19/120)、3.3％(4/120)、5.8％(7/120)、0.8％(1/120)，差异有统计学意义(P<0.001)，如表1所述，上述各蛋白在癌组织中的表达水平明显高于正常癌旁组。

7、PTC中PIM1、NOX4、SOD2和GPX2的临床病理相关性。

分析PIM1、NOX4、SOD2和GPX2基因表达与PTC各种临床病理特征之间的关系，如表2所述。由表2可见，NOX4的表达与T分期有关，T分期晚期高于T分期早期(P<0.05)，PIM1和NOX4的表达与淋巴结转移有关，有淋巴结转移者PIM1和NOX4 的表达均高于无淋巴结转移者(分别为P<0.001，P<0.05)。PIM1的表达与包膜侵犯有关，有包膜侵犯的患者PIM1的表达高于无包膜侵犯的患者(P<0.05)。

此外，由表2可知，NOX4的表达与局部浸润有关，有局部浸润的患者其表达水平高于无局部浸润的患者(P<0.05)。根据肿瘤大小的不同，PIM1的表达水平差异有统计学意义。

与肿瘤直径大于2cm的患者相比，≤-1在肿瘤直径>2cm的患者中的表达明显增高(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)。然而，值得注意的是，与肿瘤≤>2cm的患者相比，肿瘤>2cm的患者表达NOX4的频率更高(P＝0.051)。SOD2表达水平仅与年龄有关。年轻患者(<55岁)的PIM1表达高于老年患者(≥55岁)(P<0.05)，如表2所述，而 GPX2的表达与各种临床病理特征无明显相关性(P>0.05)。

8、PTC中PIM1与NOX4、SOD2、GPX2的相关性。

PIM1与NOX4、SOD2、GPX2在PTC中表达水平的相关性进行了卡方分析结果如表3所述。由表3可知，PIM1的高表达与氧化还原酶的高表达密切相关，与PIM1表达较低的患者相比，PIM1表达较高的患者NOX4、SOD2和GPX2的表达较高(P<0.05)。

表1 PTC中PIM1、NOX4、SOD2、GPX2癌组织与癌旁正常组织的相关性

表3 PTC中PIM1与NOX4、SOD2与GPX2的相关性

*差异具有统计意义

PIM1是一个癌基因(PIM1 Human 5292NM_001243186)，其在乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、食道癌、肝癌等多种肿瘤中发挥促癌作用。原癌基因PIM1定位在第6号染色体长臂上(6p21.1～p21.31)，其表达产物PIM1蛋白具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性， PIM1可以通过磷酸化下游的一系列底物发挥其致癌效应。目前已经证明的PIM1的底物包括BAD、Skp-2、p21AWF、CXCR4、STAT3、Eif4B及RUNX3等。

本发明的研究发现PIM1在PTC组织中过表达，其表达与淋巴结转移、包膜浸润、肿瘤大小等临床参数显著相关。同时，通过对TCGA数据库中501例PTC患者的分析，结果显示PIM1高表达患者的总生存率(OS)和无进展生存率(DFS)明显低于PIM1低表达患者。可见PIM1的表达与PTC的恶性表型和预后密切相关，PIM1在PTC中起重要作用。

本发明的体外试验中发现两种PTC细胞系(BCPAP和TPC-1)的PIM1水平均显著高于正常甲状腺细胞，并且采用PIM1抑制剂SGI-1776对BCPAP细胞和TPC-1细胞进行处理，表明SGI-1776对两种PTC细胞的增殖和运动能力均有抑制作用，并能诱导细胞凋亡，可见PIM1在PTC的发生发展中起着重要的致癌作用。

PIM1在氧化应激中也起着重要作用，本发明采用SGI-1776处理BCPAP细胞和 TPC-1细胞后，检测到活性氧的产生增加，可见，PIM1可通过调节ROS而参与PTC的发生发展。

进一步，本发明研究发现NOX4在PTC组织中的表达明显高于邻近正常组织。NOX4的表达水平还与多种临床病理特征相关，其中，晚期T期、淋巴结转移和局部浸润患者中NOX4的表达高于早期T期、无淋巴结转移和非局部浸润患者，进一步表明了NOX4 在PTC中的致癌作用。

此外，通过对TCGA数据库中501例PTC患者的分析，发现PIM1和NOX4的表达显著相关。将501例PTC患者进一步分为原位PTC 493例和转移PTC 8例，PIM1和NOX4在两组中的表达均显著相关。并且，采用NOX4抑制剂(GLX351322)处理BCPAP 和TPC-1细胞，结果表明，PTC细胞中PIM1表达下调，同时，NOX4 siRNA处理PTC 细胞后也得到同样的结果，此外，组织学结果也显示PIM1与NOX4相关。可知，PIM1 在PTC中受NOX4的调控，从而发挥其在氧化损伤中的作用。

在多种恶性肿瘤中均已经检测到ROS产生的增加，它可以激活致瘤信号。据报道，PIM1激酶可以通过促进NRF2/ARE活性增强引起的抗氧化基因表达来降低细胞ROS水平，从而避免肿瘤细胞死亡。本发明研究发现缺乏PIM1激酶或经PIM1抑制剂处理的细胞可导致致命的ROS积聚，最终导致细胞不耐受和死亡，表明PIM1激酶是细胞氧化还原信号的重要调节因子。本发明中，SGI-1776处理PTC细胞后，ROS的产生增加，表明PIM1可能下调ROS。

肿瘤学数据库显示，甲状腺癌抗氧化酶系统中SOD2和GPX2的表达高于正常甲状腺组织。本发明的免疫组织化学结果表明，SOD2和GPX2在PTCs组织中的表达明显高于正常甲状腺组织。因此，PTC中的SOD2和GPX2可能在ROS的去除中起主要作用。本发明中用PIM1siRNA敲除PTC细胞中的PIM1后，发现SOD2和GPX2表达下调。此外，用NOX4 siRNA敲除PTC细胞中的NOX4后，发现PIM1、SOD2和GPX2 均下调。此外，组织学结果还表明PIM1与SOD2和GPX2相关。可见，PIM1可受NOX4 调控，进而调节SOD2和GPX2，从而避免致命性ROS积聚，导致肿瘤进展。

本发明中的PIM1作为甲状腺乳头状癌的生物标记物可应用于甲状腺乳头状癌检测试剂盒、甲状腺乳头状癌靶向药物等各种甲状腺乳头状癌诊断及治疗产品中。

序列表

<110> 浙江省肿瘤医院

<120> 一种甲状腺乳头状癌的生物标记物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagaucucu ucgacuuca 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ugaagucgaa gagaucuug 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caucuguucu uaaccucaa 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uugagguuaa gaacagaug 19