一种应用相对电导率筛选辣椒抗白绢病种质材料的方法

摘要

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种应用相对电导率筛选辣椒抗白绢病种质材料的方法，包括以下步骤：(1)分离并纯化辣椒白绢病菌，制备病原菌接种菌饼；(2)培育待鉴定辣椒苗，采用菌饼包埋法进行接种，将病原菌接种于辣椒苗茎基部；(3)接种后日常管理培养5d，取样检测各植株的电导率，计算相对电导率，鉴定不同辣椒材料对辣椒白绢病的抗病性，筛选抗性材料。本发明的鉴定结果摆脱了由于不同辣椒品种自身解离特性的引起的差异性，病害鉴定客观性较强，鉴定方法操作简便，鉴定结果准确可靠，病情判别极具客观性，不易受环境和气候因素影响，结果稳定性好，可操作性强，有利于加快抗病材料的筛选速度和新品种的培育进程。

说明书

技术领域

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种应用相对电导率筛选辣椒抗白绢病种质材料的方法。

背景技术

辣椒白绢病(Pepper Souhtern Blight)是一种辣椒常见的真菌性病害，是由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii.sacc)侵害植株茎基部和根部引起的土传性病害。主要为害茎基部，导致辣椒地上部叶片迅速萎蔫，叶色变黄变淡，整株枯死。该病在我国长江中下游及南方地区以及世界多地区普遍发生，高温高湿地区发病尤为严重，造成辣椒产业产量大大降低。由于辣椒白绢病是土传病害，防治难度较大，仅依靠化学农药完全不足以解决根本问题，种植抗病品种是防治辣椒白绢病最有效的绿色、环保手段。抗病品种的培育需要利用有效的抗病性鉴定方法进行抗性材料的筛选、评价和鉴定。

目前，种植生产过程中对辣椒白绢病病害的抗病性鉴定主要采用田间鉴定，目测法调查发病率，这种方法受地理环境条件的限制，发病不均一、人为判断主观性较大，随意性强，对材料筛选的帮助作用不大。而辣椒受到白绢病病原菌入侵时，细胞膜受到破坏致使细胞内的离子外渗，水分失散，外渗离子的数量可以用电导仪测定出来，电导的强度在一定程度上可以反映细胞膜的损伤程度，间接地反映出植物的抗病能力，但直接用电导百分率来评定辣椒品种的抗病性，无法排除不同辣椒品种间自身解离特性的差异性，实际运用中不准确性较大。因此，建立新的抗性材料筛选鉴定方法显得尤为急迫。

发明内容

针对目前辣椒白绢病抗性鉴定方法限制较多，准确度不高的技术问题，本发明的目的是提供一种应用相对电导率筛选辣椒抗白绢病种质材料的方法，能够快速、客观、准确地对育种材料进行辣椒白绢病抗性鉴定，加快抗病材料的筛选速度和新品种的培育进程。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种应用相对电导率筛选辣椒抗白绢病种质材料的方法，包括以下步骤：

(1)分离并纯化辣椒白绢病菌，制备病原菌接种菌饼；

(2)培育待鉴定辣椒苗，采用菌饼包埋法进行接种，将病原菌接种于辣椒苗茎基部；

(3)接种后日常管理培养5d，取样检测各植株的电导率，计算相对电导率，鉴定不同辣椒材料对辣椒白绢病的抗病性，筛选抗性材料；

植株电导百分率测定具体步骤为：取辣椒苗上部定型叶片，每个样品三份各称取0.2g，分为对照组和处理组，剪成5mm x 5mm的小块，立即投入10ml无离子水试管中，使叶片沉入水中，浸泡7h，期间间歇振荡，浸泡结束后，测定水溶液电导率，然后将材料煮沸20min，冷却置室温后加无离子水补充至10ml，再浸泡过夜，次日再测量电导率；

相对电导率的计算公式为：

电导百分率＝叶片煮沸前外渗液的电导值/叶片煮沸后外渗液的电导值x100％；

相对电导率＝(处理组电导百分率-对照组电导百分率)/对照组电导百分率x100％。

进一步地，步骤(1)的具体过程为：从发病田间采集具有典型症状的病株，挑取菌丝或菌核接种于PDA培养基中，置于28℃的培养箱中暗培养4-5d，选择无杂菌污染、生长状况良好的菌落，挑取白绢病菌菌丝或菌核，接入新的PDA培养基中，然后置入28℃的培养箱中暗培养4-5天，重复2-3次直至无杂菌污染；收集无杂菌污染的菌丝提取DNA进行18S PCR扩增，扩增序列经测序、比对分析，结合形态学鉴定为辣椒白绢病菌后保存至冰箱备用；使用前挑取菌核或菌丝块移至装有PDA培养基的无菌培养皿中央，于28℃恒温培养箱中进行繁殖，将培养4-5d的PDA培养基打孔，制成接种用的白绢病菌菌饼待用。

进一步地，步骤(2)中用育苗基质培育待鉴定辣椒苗，育苗基质使用前于121℃蒸汽灭菌30min。

进一步地，步骤(2)中培育待鉴定辣椒苗时，先将待鉴定辣椒种子用体积分数为75％的乙醇浸泡5min，灭菌水振荡洗涤2-3次；用质量分数为1％的次氯酸钠溶液消毒8-10min，灭菌水洗涤2-3次；再温水浸种3h后28℃恒温培养箱催芽，最后播种于育苗钵内。

进一步地，步骤(2)中育苗温度为26-29℃。

进一步地，步骤(2)中病原菌接种时期为辣椒苗8-10片真叶完全展平。

进一步地，步骤(2)中菌饼包埋法具体为：将菌饼置于距辣椒苗茎基部1cm处，覆盖0.3-0.5mm育苗基质，接种后喷水至育苗基质湿度饱和，并加盖覆盖物进行保湿处理。

进一步地，步骤(3)中接种后日常管理具体为：辣椒苗先暗培养12h，随后转为白天温度27-29℃，夜间温度25-27℃的环境条件，接种期间保持育苗基质水分含量接近饱和。

进一步地，步骤(3)中抗病性的评价标准为：按相对电导率：0，免疫；＞0且≤10％，高抗；＞10％且≤30％，抗病；＞30％且≤50％，中抗；＞50％且≤70％，感病；＞70％，高感。

调查完毕后，只有当感病对照材料达到其相应感病程度(相对电导率＞50％)时，该批次的抗白绢病鉴定认定为有效。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次提出了一种应用相对电导率筛选辣椒抗白绢病种质材料的方法，本发明的鉴定结果摆脱了由于不同辣椒品种自身解离特性的引起的差异性，病害鉴定客观性较强，鉴定方法操作简便，鉴定结果准确可靠，病情判别极具客观性，不易受环境和气候因素影响，结果稳定性好，可操作性强，有利于提高抗病材料的筛选效率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所使用的材料均可自常规途径购买得到。

实施例1病原菌的分离和鉴定

辣椒白绢病菌株(Sclerotium rolfsii sacc.)是由湖南省长沙市湖南省蔬菜研究所科研示范园辣椒种植基地中采集到的具有典型白绢病症状的发病植株上分离纯化得到的，其症状为：茎基部着生白色绢丝状菌丝，呈辐射状扩散，初呈浅褐色水浸状腐烂，渐变成深褐色，发生后期，茎基部病部凹陷，产生大量褐色油菜籽样小菌核。

其分离纯化过程为：从发病田间采集具有典型症状的病株，在超净台中用消毒镊子挑取3皿菌丝接种于PDA培养基中，置于28℃的培养箱中暗培养4-5d，选择无杂菌污染、生长状况良好的菌落，挑取白绢病菌，菌丝或菌核接入新的PDA培养基中，然后置入28℃的培养箱中暗培养4-5天，重复2-3次直至无杂菌污染，最终的得到纯化的菌丝1皿；

采用聚合美生物科技有限公司的M5 Fungal Genomic DNA kti，提取经纯化后的菌株基因组一个。以提取的菌株基因组为模板，以真菌ITS序列通用引物ITS-F(5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’)和ITS-R(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAA-3’)为扩增引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，10×EasyTaq Buffer 2μL，2.5mMdNTPs 2μL，EasyTaq DNA Polymerase 1μL，加dd H

将扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，当条带较亮，且大小为650-750bp时，说明扩增结果符合预期。随后将条带在这一大小范围内的PCR扩增产物送测序公司测序。为保证测序结果的准确性，每个产物分别用上下游引物进行测序。将上下游测序结果进行拼接，选择完全重复区域，大小为658bp。将测序获得的658bp序列在NCBI网站的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行比对，结果发现扩增获得的菌株与Athelia rolfsii 18S rRNA(GeneBank Number:JX839988.1)基因序列98％一致。Atheliarolfsii中文名为罗氏阿太菌，罗氏阿太菌是半知菌亚门真菌齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii sacc.)的有性态，主要引起作物白绢病，以发病作物茎基部长出白色辐射状菌丝，后期产生褐色油菜籽状小菌核为主要特征。

将分离鉴定后的病原菌依据使用时间的长短分别进行保存，短期频繁的用于室内抗病性鉴定时用PDA平板培养基保存于4℃的冰箱中；长期保存菌株时将菌丝加入已灭菌的脱脂牛奶中制成菌丝悬浮液，经冷冻干燥、抽真空后保存于Ampoule管中，置于-20℃或-80℃冰箱中。

实施例2辣椒白绢病抗病性鉴定

(1)进行辣椒白绢病菌扩繁，制备病原菌接种菌饼

1.PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基的配制：马铃薯葡萄糖琼脂粉40.1g，用蒸馏水补足1L，121℃，灭菌20分钟。灭菌后，待培养基温度在60-80℃时，摇匀，在无菌操作台中倒成平板。

2.将实施例1中分离保存的病原菌备用，使用时将纯化好的菌株用直径为5mm圆形打孔器打孔，制成菌饼，在倒好的PDA培养基中间放一菌饼，培养皿直径为80mm，之后放在28℃的恒温培养箱中暗培养5d，直至菌丝接近长满整个培养皿。

3.将培养5d的PDA培养基用5mm×5mm的打孔器打孔，制作成接种用的白绢病菌菌饼待用。

(2)辣椒幼苗准备与接种

1.鉴定材料育苗：待鉴定的辣椒种子用75％的乙醇消毒5min，装袋，无菌水振荡洗涤2-3次；再用浓度为1％的次氯酸钠溶液温水浸种8-10min，用灭菌水冲洗干净后置于28℃的恒温培养箱中催芽，露白后播种于育苗钵内。育苗基质为营养基质、蛭石(或细沙)以3:1的比例混合，并经高温蒸汽灭菌(121℃，30min)，在人工智能温室里育苗，人工智能温室的温度控制在28℃左右。幼苗应生长健壮、大小一致。

2.试验设计：设茄门(Qiemen)甜椒为感病品种，鉴定材料顺次排列，将供试菌株在PDA培养基上培养4d，用打孔器(d＝5mm)从菌落边缘打取菌饼，用镊子将菌饼接种在离植株1cm的土壤里，用土包埋处理，每份材料处理组10株，对照组10株。

3.接种时期：8-10片真叶完全展平期，大约为播种后50d。

4.菌饼包埋接种法：将菌饼置于距辣椒茎基部1cm处，覆盖0.3-0.5mm育苗基质，接种后用喷壶均匀喷水，直至育苗基质湿度饱和。

5.管理：接种后用透明塑料罩盖上保湿处理，放在人工智能温室，先暗培养12h，后16h/8h白天黑夜交替，白天温度26-29℃，晚上25-27℃，接种期间保持育苗基质水分含量接近饱和。

(3)抗病性指标的测定与群体抗性指标的评价

1.取样调查：于接种后第5天取样。

2.相对电导率测定：取幼苗上部定型叶片，每个样品三份各称取0.2g，分为对照组和处理组，剪成5mm x 5mm的小块，立即投入10ml无离子水试管中，用真空抽气泵使叶片沉入水中，浸泡7h，期间间歇振荡，浸泡结束后，用DDS-11A型电导仪测定水溶液电导率，然后将材料煮沸20min，冷却置室温后加无离子水补充到原容量(10ml)，再浸泡过夜，次日再测量电导率。

3.计算方法

相对电导率计算公式为：

电导百分率＝叶片煮沸前外渗液的电导值/叶片煮沸后外渗液的电导值x100％；

相对电导率＝(处理组电导百分率-对照组电导百分率)/对照组电导百分率x100％。

4.抗病性群体评价划分

根据鉴定材料3次重复的相对电导率(G)平均值确定其抗性水平，划分标准见下表。

5.鉴定结果有效性判断

调查完毕后，只有当感病对照材料达到其相应感病程度(G＞50)时，该批次的抗白绢病鉴定认定为有效。

实验例

以实施例2的鉴定方法对23份育种材料进行了抗病性室内接种鉴定。鉴定结果如下表所示，结果表明，鉴定的23个材料(品种)中，尚未发现免疫材料，1份高抗材料，12份抗病材料，2份中抗材料，3份感病材料，5份高感材料。本实验例鉴定的材料(品种)与种植在病圃和以及大田中的发病率较为一致，表明此种鉴定方法在可控环境下、接种效率高，鉴定结果准确可靠，可用于辣椒抗白绢病的抗病育种。