一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法

摘要

本发明提供了一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到熊胆开明片HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇‑磷酸二氢钠溶液为流动相进行梯度洗脱，建立了熊胆开明片HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对熊胆开明片的质量进行控制。

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法。

背景技术

中成药熊胆开明片由熊胆粉、石决明、菊花、石决明(煅)、枸杞子、泽泻(炙)、龙胆、茺蔚子等8味中草药组成。本品主要功能为清肝泄热，滋阴明目。用于肝胆郁热，阴精不足所致瞳神紧小，青风内障，症见目赤疼痛、羞明流泪、视物模糊、烦躁易怒、口苦咽干；急性虹膜睫状体炎、原发性开角型青光眼见上述症候者。目前所执行标准收载于国家药品标准，标准编号：YBZ02172007，本品质量标准中包括片剂的性状；泽泻、枸杞子和龙胆的薄层鉴别；牛黄熊去氧胆酸的含量测定。其质量标准只控制一味药的定性定量检测方法，难以整体全面的控制产品质量。

中药复方是中医临床用药的主要形式，其质量是临床疗效的关键。如何建立科学合理的、体现中药复方特点的质量控制方法就显得尤为重要，而中药复方质量控制方法一直是中药科研领域热点研究方向之一。如何科学合理选定质量控制的特征有效指标性成分，对中药复方进行有效的质量控制，是建立中药复方质量控制方法的关键所在。

熊胆开明片是依据中国传统中医理论和用药经验，结合中国现代医学研究结果研制而成的中药复方制剂，临床常应用于治疗急性虹膜睫状体炎以及原发性开角型青光眼。该复方制剂由熊胆粉、石决明、煅石决明、菊花、龙胆、枸杞子、泽泻、茺蔚子等八味药组成，其中以熊胆粉为君药，石决明、菊花为臣药，枸杞子等为佐使药。

目前所执行标准收载于国家药品标准，标准编号：YBZ02172007，本品质量标准中包括片剂的性状；泽泻、枸杞子和龙胆的薄层鉴别；牛黄熊去氧胆酸的含量测定。其质量标准只控制一味药的定性定量检测方法，难以整体全面的控制产品质量。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的熊胆开明片HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对熊胆开明片的质量进行控制。

本发明提供了一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，包括：

A)将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，得到待测液；

B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到熊胆开明片HPLC特征图谱；

所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱。

优选的，还包括制备参照物溶液：分别取龙胆苦苷、绿原酸和木犀草苷中的一种或几种，采用甲醇溶解，分别得到参照物溶液；

将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对熊胆开明片HPLC特征图谱的成分进行定性。

优选的，所述流动相A为甲醇，流动相B为0.01mol/L的磷酸二氢钠溶液。

优选的，所述梯度洗脱具体为：

0～5min，流动相A 5％～15％，流动相B 95％～85％；

5～40min，流动相A 15％～15％，流动相B 85％～85％；

40～70min，流动相A 15％～65％，流动相B 85％～35％；

70～100min，流动相A 65％～40％，流动相B 35％～60％；

100～101min，流动相A 40％～5％，流动相B 60％～95％；

101～110min，流动相A 5％～5％，流动相B 95％～95％。

优选的，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；

流动相流速为0.5～1.5mL/min；柱温20℃～40℃，检测波长为190nm～410nm；进样量为5～15μL；理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。

优选的，所述流动相流速为0.7mL/min；柱温25℃，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。

优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对熊胆开明片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的熊胆开明片HPLC标准特征图谱，其中第3号峰为龙胆苦苷峰，第4号峰为绿原酸峰，第8号峰为木犀草苷；对10个特征峰进行归属：1、3号特征峰归属为龙胆药材，2号特征峰归属为熊胆粉药材，4、6、7、8号特征峰归属为菊花药材，5号特征峰归属为泽泻药材，9号特征峰归属为枸杞子药材，10号特征峰归属为茺蔚子药材。

优选的，在所述标准特征图谱中，以龙胆苦苷峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±5％之内，所述规定值分别为：0.57-峰1、0.62-峰2、1.00-峰3、1.20-峰4、1.42-峰5、1.77-峰6、1.88-峰7、2.00-峰8、2.25-峰9、2.42-峰10。

优选的，步骤A)所述甲醇溶解后为超声处理，所述超声处理的时间为20～40min。

优选的，步骤A)所述熊胆开明片的质量g和甲醇的体积mL的比为(0.5～1.5)：(20～70)。

与现有技术相比，本发明提供了一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到熊胆开明片HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相进行梯度洗脱，建立了熊胆开明片HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对熊胆开明片的质量进行控制。

附图说明

图1是本发明实施例2制备的熊胆开明片HPLC特征图谱；

图2是本发明实施例3制备的熊胆开明片HPLC特征图谱；

图3是本发明实施例4中10批次熊胆开明片的特征图谱及共有模式；

图4是熊胆开明片的HPLC标准对照特征图谱，图中，峰S：3号峰，龙胆苦苷峰。

具体实施方式

本发明提供了一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，包括：

A)将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，得到待测液；

B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到熊胆开明片HPLC特征图谱；

所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱。

本发明提供的一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法首先将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，得到待测液。优选具体为将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，超声处理，放冷，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，即得。

本发明对于所述研磨不进行限定，研磨得到粉末即可。所述甲醇溶解后为超声处理，所述超声处理的时间为20～40min。

其中，所述熊胆开明片的质量g和甲醇的体积mL的比优选为(0.5～1.5)：(20～70)；更优选为(0.8～1.2)：(25～45)。

本发明还包括制备参照物溶液：分别取龙胆苦苷、绿原酸和木犀草苷中的一种或几种，采用甲醇溶解，分别得到参照物溶液。

其中，所述龙胆苦苷的浓度优选为50μg/mL；所述绿原酸的浓度优选为50μg/mL；所述木犀草苷的浓度优选为50μg/mL。

将待测液采用高效液相色谱法测定，得到熊胆开明片HPLC特征图谱。

将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对熊胆开明片HPLC特征图谱的成分进行定性。

本发明所述流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钠溶液；优选为0.01mol/L的磷酸二氢钠溶液；用磷酸调节pH值2.8～3.2；梯度洗脱。

本发明所述梯度洗脱优选具体为：

0～5min，流动相A 5％～15％，流动相B 95％～85％；

5～40min，流动相A 15％～15％，流动相B 85％～85％；

40～70min，流动相A 15％～65％，流动相B 85％～35％；

70～100min，流动相A 65％～40％，流动相B 35％～60％；

100～101min，流动相A 40％～5％，流动相B 60％～95％；

101～110min，流动相A 5％～5％，流动相B 95％～95％。

本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。

本发明所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；

流动相流速优选为0.5～1.5mL/min；更优选为0.7～1.2mL/min；最优选为0.7mL/min。

本发明考察了流速0.5～1.5ml/min下的色谱峰情况，发现色谱峰杂乱且不易分离，经过试验，发现流速0.7ml/min下各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。

本发明柱温优选为20℃～40℃，更优选为25℃～35℃，最优选为25℃。

本发明考察了不同柱温下色谱峰的分离效果。各色谱峰分离较好，峰形较对称，鉴于20℃较难控制，30℃及35℃下不宜于色谱柱寿命，故最优选方案选择柱温为25℃。

本发明检测波长优选为190nm～410nm；更优选为检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。

本发明人发现，在220nm时大极性未知成分响应较强，龙胆苦苷峰响应值低；在370nm时，大部分成分峰面积小，响应值低；在287nm、335nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳，根据相应的出峰情况，很难采用单一的波长呈现，故本发明最优选方案中，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。

本发明进样量为5～15μL；优选为10μL；理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。

本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以指纹图谱控制熊胆开明片的物质群，以龙胆苦苷、绿原酸和木犀草苷对照品对指纹图谱进行定位；并采用双波长，以外标法计算有效成分的含量。不但含量结果准确和识别效果更好，而且能够大大降低检测的成本，实现定性检测。

本发明采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对熊胆开明片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的熊胆开明片HPLC标准特征图谱。其中第3号峰为龙胆苦苷峰，第4号峰为绿原酸峰，第8号峰为木犀草苷。对10个特征峰进行归属：1、3号特征峰归属为龙胆药材，2号特征峰归属为熊胆粉药材，4、6、7、8号特征峰归属为菊花药材，5号特征峰归属为泽泻药材，9号特征峰归属为枸杞子药材，10号特征峰归属为茺蔚子药材。

在所述标准特征图谱中，以龙胆苦苷峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±5％之内，所述规定值分别为：0.57-峰1、0.62-峰2、1.00-峰3、1.20-峰4、1.42-峰5、1.77-峰6、1.88-峰7、2.00-峰8、2.25-峰9、2.42-峰10。

质量判断标准：取熊胆开明片样品，按上述同法操作，得到熊胆开明片特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对熊胆开明片标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。

本发明建立了一种中成药“熊胆开明片”的HPLC特征图谱共有模式，标定了10个特征峰，建立的特征图谱比较全面的反应了所含化学成分的种类和数量，避免了熊胆开明片质量控制的单一性和片面性，有利于全面控制产品质量。本发明检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm，进行测定，其出峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，稳定性好，准确可靠。本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高、重现性好等特点，可有效控制熊胆开明片质量。

本发明提供了一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将熊胆开明片研磨，甲醇溶解，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到熊胆开明片HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相进行梯度洗脱，建立了熊胆开明片HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对熊胆开明片的质量进行控制。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种熊胆开明片HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。

实施例1：一种熊胆开明片的HPLC特征图谱构建方法

仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平

试药：龙胆苦苷对照品，液相色谱分析用甲醇为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、熊胆开明片由吉林长白山制药有限责任公司提供。

供试品溶液的制备：取熊胆开明片细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：分别取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含龙胆苦苷50μg的溶液，即得。

1熊胆开明片特征图谱实验条件选择

1.1流动相选择

通过试验并参考有关文献，选择甲醇为主要流动相，实验考察了甲醇-0.2％磷酸及不同的梯度洗脱效果(表1)，最终确定梯度洗脱程序，如表2所示。

表1流动相选择

表2流动相洗脱条件

1.2波长选择

实验采用DAD检测器考察了200～400nm范围的检测情况，重点考察220nm、287nm、335nm、370nm4个波长。在220nm时大极性未知成分响应较强，龙胆苦苷峰响应值低；在370nm时，大部分成分峰面积小，响应值低；在287nm、335nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳，根据相应的出峰情况，故选择检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。

1.3色谱柱柱温选择

实验考察了柱温在20℃、25℃、30℃、35℃下色谱峰的分离效果。各色谱峰分离较好，峰形较对称，鉴于20℃较难控制，30℃及35℃下不宜于色谱柱寿命，故选择柱温为25℃。

1.4流速选择

实验参照文献，考察了传统流速0.9～1.1ml/min下的色谱峰情况，发现色谱峰杂乱且不易分离，故本实验降低了流速，经过试验，发现流速0.7ml/min下各色谱峰分离较其余流速好，峰形较对称，故选择流速0.7ml/min。

1.5提取溶剂选择

实验比较了甲醇、50％甲醇、乙醇各项提取溶剂超声提取的高效液相色谱图差异。乙醇未提取出各类成分，50％甲醇、甲醇所提出的成分相差不大，但甲醇所提取龙胆苦苷含量最高，故在此选择甲醇作为提取溶剂。

1.6提取时间考察

实验比较了甲醇超声提取10min、30min、60min的提取效率，超声10min，提取不充分，图谱重复性不佳，超声30min便能将各成分提取较完全，故选取超声30min对样品进行提取。

最终确定：

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH值2.8～3.2)溶液，梯度洗脱，流速0.7ml/min，柱温25℃，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如表3：

表3

供试品溶液的制备：取熊胆开明片细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：分别取龙胆苦苷对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含龙胆苦苷、绿原酸、木犀草苷50μg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录110分钟色谱图。

1.7方法学考察

精密度试验：取同一份供试品溶液连续进样6次，记录色谱图，比较各特征峰的相对保留时间。结果所有特征峰的相对保留时间的RSD值小于3.0％，表明仪器精密度良好。详细结果如表4：

表4

重复性试验：取同一批(批号：160101)熊胆开明片6份，分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样，记录色谱图。结果所有特征峰的相对保留时间的RSD值小于3.0％，表明方法重复性良好。详细结果如表5：

表5

稳定性试验：取同一份熊胆开明片的供试品溶液，分别在0、4、8、12、18、24小时进样，记录色谱图。结果所有特征峰的相对保留时间的RSD值小于3.0％，表明溶液24小时稳定性良好。详细结果如表6：

表6

实施例2：一种熊胆开明片的HPLC特征图谱构建方法

仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平

试药：龙胆苦苷对照品，液相色谱分析用甲醇为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、熊胆开明片由吉林长白山制药有限责任公司提供。

供试品溶液的制备：取熊胆开明片细粉1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含龙胆苦苷50μg的溶液，即得。

测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH值2.8～3.2)溶液，梯度洗脱，流速0.7ml/min，柱温25℃，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如表7：

表7

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各15μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“熊胆开明片”HPLC特征图谱。如图1所示。图1是本发明实施例2制备的熊胆开明片HPLC特征图谱；

实施例3：一种熊胆开明片的HPLC特征图谱构建方法

仪器：戴安U-3000型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平

试药：龙胆苦苷对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品，液相色谱分析用甲醇为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、熊胆开明片由吉林长白山制药有限责任公司提供。

供试品溶液的制备：取熊胆开明片细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：分别取龙胆苦苷对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含龙胆苦苷、绿原酸、木犀草苷50μg的溶液，即得。

测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH值2.8～3.2)溶液，梯度洗脱，流速0.7ml/min，柱温25℃，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如表8：

表8

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得“熊胆开明片”HPLC特征图谱。如图2所示。

实施例4：熊胆开明片的HPLC特征图谱的测定

仪器：岛津2010c高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平

试药：龙胆苦苷对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品，液相色谱分析用甲醇为色谱纯、其余试剂为分析纯、水为超纯水、熊胆开明片(批号分别为：190101、190102、190103、191201、191202、191203、200101、200102、200103、201001)由吉林长白山制药有限责任公司提供。

供试品溶液的制备：取熊胆开明片细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液的制备：分别取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含龙胆苦苷50μg的溶液，即得。

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH值2.8～3.2)溶液，梯度洗脱，流速0.7ml/min，柱温25℃，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如表9：

表9

测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。

特征图谱测定

采用上述方法测定10个批次的熊胆开明片，记录特征图谱，比较相对保留时间，结果10批熊胆开明片相对保留时间RSD值小于3.0％，详细结果如下：

表10

将在拟定色谱条件下记录的10批制剂色谱图转换成数值数据导出后，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2012版(国家药典委员会)进行数据导入、匹配、校正(图3)，生成能够综合反映所有样品指纹特征信息的对照特征图谱即熊胆开明片的HPLC标准对照特征图谱(图4)。通过与对照特征图谱比较，计算各批次制剂相似度。详细结果如表11：

表11

本实验对熊胆开明片进行了特征图谱研究，比较10批样品的相对保留时间，结果10批熊胆开明片相对保留时间RSD值小于3.0％。并采用相似度软件对色谱峰数据进行评价，建立了熊胆开明片的HPLC标准对照特征图谱，结果表明，各批次制剂峰群的整体图貌基本一致，确定了10个共有峰，相似度均在0.9以上。

实施例5：一种熊胆开明片的HPLC特征图谱构建方法

仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪，MS205DU型分析天平

试药：龙胆苦苷对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品，液相色谱分析用甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水，熊胆开明片样品及熊胆粉药材、菊花药材、枸杞子药材、泽泻药材、龙胆药材、茺蔚子药材均由吉林长白山制药有限责任公司提供。

供试品溶液的制备：取熊胆开明片细粉1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

熊胆粉药材溶液制备：取处方折算药材量的熊胆粉，按照供试品处理方法制备样品，得熊胆粉药材溶液。

菊花药材制备：取处方折算药材量的菊花，按照供试品处理方法制备样品，得菊花药材溶液。

枸杞子药材制备：取处方折算药材量的枸杞子，按照供试品处理方法制备样品，得枸杞子药材溶液。

泽泻药材制备：取处方折算药材量的泽泻，按照供试品处理方法制备样品，得泽泻药材溶液。

龙胆药材制备：取处方折算药材量的龙胆，按照供试品处理方法制备样品，得龙胆药材溶液。

茺蔚子药材制备：取处方折算药材量的茺蔚子，按照供试品处理方法制备样品，得茺蔚子药材溶液。

参照物溶液的制备：分别取龙胆苦苷对照品、绿原酸对照品、木犀草苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含龙胆苦苷、绿原酸、木犀草苷50μg的溶液，即得。

测定：色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH值2.8～3.2)溶液，梯度洗脱，流速0.7ml/min，柱温25℃，检测波长起始为287nm，到70分钟时调整为335nm。梯度洗脱程序的体积比浓度配置如表12：

表12

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，确立部分特征峰归属、供试品与药材的关系：

参照峰为3号峰为龙胆苦苷峰；4号峰为绿原酸峰；8号峰为木犀草苷。对10个特征峰进行归属：1、3号特征峰归属为龙胆药材，2号特征峰归属为熊胆粉药材，4、6、7、8号特征峰归属为菊花药材，5号特征峰归属为泽泻药材，9号特征峰归属为枸杞子药材，10号特征峰归属为茺蔚子药材。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。