用于执行羟基酸氧化酶1（HAO1）基因编辑以治疗1型原发性高草酸尿症（PH1）的组合物和方法

摘要

提供了用于在HAO1基因内编辑，例如引入双链断裂的组合物和方法。提供了用于治疗患有1型原发性高草酸尿症(PH1)的受试者的组合物和方法。

说明书

本申请要求于2018年7月31日提交的美国临时专利申请第62/712,904号、于2018年9月28日提交的美国临时专利申请第62/738,936号、于2019年4月15日提交的美国临时专利申请第62/834,328号和于2019年5月1日提交的美国临时专利申请第 62/841,734号的权益，所述美国临时专利申请中的每个美国临时专利申请出于所有目的通过引用并入本文。

1型原发性高草酸尿症(PH1)是以草酸盐的积聚为特征的遗传性病症。在PH1中，在由AGXT基因编码的酶，即丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(AGT或AGT1)中发现的突变。通常，AGT在肝过氧化物酶体中将乙醛酸转化成甘氨酸。在患有PH1的患者中，突变型AGT无法分解乙醛酸，并且乙醛酸及其代谢产物草酸盐的水平增加。人无法使草酸盐氧化，并且患有PH1的患者中的高水平的草酸盐会导致高草酸尿症(尿液中的草酸盐水平异常高)。

在PH1中，过量的草酸盐还可以与钙结合，以在肾和其它器官中形成草酸钙。草酸钙的沉积可能引起草酸钙的广泛沉积(肾钙质沉着症)或形成肾结石和膀胱结石(尿石症)并导致肾损伤。PH1中常见的肾并发症包含尿液中带血(血尿症)、尿路感染、肾损伤和终末期肾病(ESRD)。随着时间的推移，患有PH1的患者的肾可能开始衰竭，并且血液中的草酸盐的水平可能会升高。草酸盐在全身组织中的沉积，例如全身性草酸盐沉着症可能是由于血液草酸盐水平高而发生的，并且可以导致骨、皮肤和眼睛的并发症。患有PH1的患者通常在早年患有肾衰竭，其中肾透析或双肾/肝器官移植是唯一的治疗选项。

羟基酸氧化酶1(HAO1，也被称为乙醇酸氧化酶[GOX或GO])将乙醇酸转化成乙醛酸。已经提出，抑制患有PH1的个体中的HAO1将阻断乙醛酸的形成，并且过量的乙醇酸将通过尿液排出。此假设已经使用敲除动物模型进行了测试，所述敲除动物模型如Salido EC等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》103(48):18249-18254(2006)中所述的那些模型。卢马西兰(lumasiran)(ALN-GO1)，即临床试验中的用于治疗PH1的一种RNAi治疗剂靶向HAO1mRNA，并且在早期临床研究中表明会降低尿草酸盐水平。

通过抑制HAO1来治疗PH1的想法进一步由指示具有HAO1的异常剪接变体的人类受试者患有无症状乙醇酸尿症的数据支持，其中未伴随有明显的肾病理的尿乙醇酸排出增加(参见Frishberg Y等人,《医学遗传学杂志(J Med Genet)》51(8):526-9(2014))。因此，可以通过抑制HAO1的表达来阻断乙醛酸产生并且因此阻断乙醛酸的代谢产物草酸盐产生来治疗PH1。

目前正在研究使用靶向HAO1的小干扰RNA(siRNA)敲低或反义敲低以进行破坏的方法，但虽然关于HAO1表达的短期抑制的结果显示了令人鼓舞的初步数据(参见 Liebow等人,《美国肾脏学会期刊(J Am Soc Nephrol.)》2017年2月；28(2):494-503)，但是需要可以产生对HAO1的长期抑制的治疗。本发明提供了使用CRISPR/Cas系统敲除HAO1基因的组合物和方法，由此减少HAO1蛋白产生并减少患有PH1的受试者中的乙醛酸产生。

因此，提供了以下实施例。在一些实施例中，本发明提供了使用引导RNA与RNA 引导的DNA结合剂(如CRISPR/Cas系统)显著降低或敲除HAO1基因的表达，由此显著降低或消除GO蛋白产生的组合物和方法。通过改变HAO1基因来显著减少或消除 GO蛋白产生可以是长期或永久性治疗。

发明内容

提供了以下实施例。

实施例01一种在HAO1基因内诱导双链断裂(DSB)或单链断裂(SSB)的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸。

实施例02一种减少HAO1基因的表达的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸。

实施例03一种治疗或预防1型原发性高草酸尿症(PH1)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，由此治疗或预防PH1。

实施例04一种治疗或预防由PH1引起的终末期肾病(ESRD)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，由此治疗或预防由PH1引起的(ESRD)。

实施例05一种治疗或预防草酸钙产生和沉积、高草酸尿症、草酸盐沉着症和血尿症中的任何一种的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，由此治疗或预防草酸钙产生和沉积、高草酸尿症、草酸盐沉着症和血尿症中的任何一种。

实施例06一种增加血清乙醇酸浓度的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，由此增加血清乙醇酸浓度。

实施例07一种用于减少受试者的尿液中的草酸盐的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用组合物，其中所述组合物包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸，由此减少受试者的所述尿液中的草酸盐。

实施例08根据前述实施例中任一项所述的方法，其中施用RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸。

实施例09一种组合物，其包括：

a.引导RNA，所述引导RNA包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列；或

iv.包括SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、 113、117、129、145中的任何一个的引导序列；或

v.包括SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个的引导序列；以及任选地

b.RNA引导的DNA结合剂或对RNA引导的DNA结合剂进行编码的核酸。

实施例10一种组合物，其包括短单引导RNA(短-sgRNA)，所述组合物包括：

a.引导序列，所述引导序列包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个引导序列的至少17个、18 个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同；或

iv.SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、113、 117、129、145中的任何一个；或

v.SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个；以及

b.sgRNA的包括发夹区的保守部分，其中所述发夹区缺少至少5-10个核苷酸，并且任选地其中所述短-sgRNA包括5'端修饰和3'端修饰中的一个或多个。

实施例11根据实施例10所述的组合物，其包括SEQ ID NO:202的序列。

实施例12根据实施例10或实施例11所述的组合物，其包括5'端修饰。

实施例13根据实施例10到12中任一项所述的组合物，其中所述短-sgRNA包括 3'端修饰。

实施例14根据实施例10到13中任一项所述的组合物，其中所述短-sgRNA包括 5'端修饰和3'端修饰。

实施例15根据实施例10到14中任一项所述的组合物，其中所述短-sgRNA进一步包括3'尾。

实施例16根据实施例15所述的组合物，其中所述3'尾包括1个、2个、3个、4 个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。

实施例17根据实施例15所述的组合物，其中所述3'尾包括约1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-7个、1-10个、至少1-2个、至少1-3个、至少1-4个、至少1-5个、至少1-7个或至少1-10个。

实施例18根据实施例10到17中任一项所述的组合物，其中所述短-sgRNA不包括3'尾。

实施例19根据实施例10到18中任一项所述的组合物，其包括所述发夹区中的修饰。

实施例20根据实施例10到19中任一项所述的组合物，其包括3'端修饰和所述发夹区中的修饰。

实施例21根据实施例10到20中任一项所述的组合物，其包括3'端修饰、所述发夹区中的修饰以及5'端修饰。

实施例22根据实施例10到21中任一项所述的组合物，其包括5'端修饰和所述发夹区中的修饰。

实施例23根据实施例10到22中任一项所述的组合物，其中所述发夹区缺少至少 5个连续核苷酸。

实施例24根据实施例10到23中任一项所述的组合物，其中所述至少5-10个缺少的核苷酸：

a.处于发夹1内；

b.处于发夹1以及位于发夹1与发夹2之间的“N”内；

c.处于发夹1以及紧接发夹1的3'位的两个核苷酸内；

d.包含发夹1的至少一部分；

e.处于发夹2内；

f.包含发夹2的至少一部分；

g.处于发夹1和发夹2内；

h.包含发夹1的至少一部分并且包含位于发夹1与发夹2之间的“N”；

i.包含发夹2的至少一部分并且包含位于发夹1与发夹2之间的“N”；

j.包含发夹1的至少一部分，包含位于发夹1与发夹2之间的“N”，并且包含发夹2的至少一部分；

k.处于发夹1或发夹2内，任选地包含位于发夹1与发夹2之间的“N”；

l.是连续的；

m.是连续的并且包含位于发夹1与发夹2之间的“N”；

n.是连续的并且跨越发夹1的至少一部分和发夹2的一部分；

o.是连续的并且跨越发夹1的至少一部分以及位于发夹1与发夹2之间的“N”；

p.是连续的并且跨越发夹1的至少一部分和紧接发夹1的3'位的两个核苷酸；

q.由5-10个核苷酸组成；

r.由6-10个核苷酸组成；

s.由5-10个连续核苷酸组成；

t.由6-10个连续核苷酸组成；或

u.由SEQ ID NO:400的核苷酸54-58组成。

实施例25根据实施例10到24中任一项所述的组合物，其包括sgRNA的包括连结区的保守部分，其中所述连结区缺少至少一个核苷酸。

实施例26根据实施例25所述的组合物，其中连结区中缺少的所述核苷酸包括以下中的任何一个或多个：

a.所述连结区中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9或10个核苷酸；

b.所述连结区中的至少或确切地1-2个核苷酸、1-3个核苷酸、1-4个核苷酸、1-5个核苷酸、1-6个核苷酸、1-10个核苷酸或1-15个核苷酸；以及

c.所述连结区中的每个核苷酸。

实施例27一种组合物，其包括经修饰的单引导RNA(sgRNA)，所述组合物包括：

a.引导序列，所述引导序列包括：

i.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个引导序列；或

ii.选自SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个引导序列的至少17个、18 个、19个或20个连续核苷酸；或

iii.与选自SEQ ID NO:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同；或

iv.SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、113、 117、129、145中的任何一个；或

v.SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145中的任何一个；

并且进一步包括：

b.一种或多种选自以下的修饰：

1.一个或多个引导区YA位点处的YA修饰；

2.一个或多个保守区YA位点处的YA修饰；

3.一个或多个引导区YA位点处和一个或多个保守区YA位点处的YA修饰；

4.i)两个或更多个引导区YA位点处的YA修饰；

ii)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及

iii)保守区YA位点1和8中的一个或多个处的YA修饰；或

5.i)一个或多个引导区YA位点处的YA修饰，其中所述引导区YA位点位于从5'末端的5'端开始的核苷酸8处或之后；

ii)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及任选

地：

iii)保守区YA位点1和8中的一个或多个处的YA修饰；或

6.i)一个或多个引导区YA位点处的YA修饰，其中所述引导区YA位点处于所述引导区的3'末端核苷酸的13个核苷酸内；

ii)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及

iii)保守区YA位点1和8中的一个或多个处的YA修饰；或

7.i)5'端修饰和3'端修饰；

ii)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及

iii)保守区YA位点1和8中的一个或多个处的YA修饰；或

8.i)引导区YA位点处的YA修饰，其中所述引导区YA位点的所述修饰包括定位于所述引导区YA位点的5'位的至少一个核苷酸不包括的修饰；

ii)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及

iii)保守区YA位点1和8中的一个或多个处的YA修饰；或

9.i)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及

ii)保守区YA位点1和8处的YA修饰；或

10.i)一个或多个引导区YA位点处的YA修饰，其中所述YA位点位于从5'末端开始的核苷酸8处或之后；

ii)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；以及

iii)H1-1和H2-1中的一个或多个处的修饰；或

11.i)保守区YA位点2、3、4和10中的一个或多个处的YA修饰；ii)保守区 YA位点1、5、6、7、8和9中的一个或多个处的YA修饰；以及iii)H1-1和H2-1 中的一个或多个处的修饰；或

12.i)定位于从5'末端开始的核苷酸6处或之后的一个或多个核苷酸处的修饰，如YA修饰；

ii)一个或多个引导序列YA位点处的YA修饰；

iii)B3、B4和B5中的一个或多个处的修饰，其中B6不包括2'-OMe修饰或

包括除了2'-OMe之外的修饰；

iv)LS10处的修饰，其中LS10包括除了2'-氟之外的修饰；和/或

v)N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10或N11处的修饰；并且

其中以下中的至少一个为真：

i.一个或多个引导区YA位点处的YA修饰；

ii.一个或多个保守区YA位点处的YA修饰；

iii.一个或多个引导区YA位点处和一个或多个保守区YA位点处的YA 修饰；

iv.从5'末端的5'端开始的核苷酸8-11、13、14、17或18中的至少一个不包括2'-氟修饰；

v.从5'末端的5'端开始的核苷酸6-10中的至少一个不包括硫代磷酸酯连接；

vi.B2、B3、B4或B5中的至少一个不包括2'-OMe修饰；

vii.LS1、LS8或LS10中的至少一个不包括2'-OMe修饰；

viii.N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10、N11、N16或N17中的至少一个不包括2'-OMe修饰；

ix.H1-1包括修饰；

x.H2-1包括修饰；或

xi.H1-2、H1-3、H1-4、H1-5、H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H2-1、 H2-2、H2-3、H2-4、H2-5、H2-6、H2-7、H2-8、H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、 H2-13、H2-14或H2-15中的至少一个不包括硫代磷酸酯连接。

实施例28根据实施例27所述的组合物，所述组合物包括SEQ ID NO:450。

实施例29根据实施例9到28中任一项所述的组合物，其用于在细胞或受试者中的HAO1基因内诱导双链断裂(DSB)或单链断裂。

实施例30根据实施例9到28中任一项所述的组合物，其用于减少细胞或受试者中的HAO1基因的表达。

实施例31根据实施例9到28中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防受试者的PH1。

实施例32根据实施例9到28中任一项所述的组合物，其用于增加受试者的血清和/或血浆乙醇酸浓度。

实施例33根据实施例9到28中任一项所述的组合物，其用于减少受试者的尿草酸盐浓度。

实施例34根据实施例9到28中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防器官中的草酸盐产生、草酸钙沉积、高草酸尿症、草酸盐沉着症，包含全身性草酸盐沉着症、血尿症、终末期肾病(ESRD)和/或延缓或减轻对肾或肝移植的需要。

实施例35根据实施例1到8中任一项所述的方法，其进一步包括：

a.在细胞或受试者中的HAO1基因内诱导双链断裂(DSB)；

b.减少细胞或受试者中的HAO1基因的表达；

c.治疗或预防受试者的PH1；

d.增加受试者的血清和/或血浆乙醇酸浓度；

e.减少受试者的尿草酸盐浓度；

f.减少草酸盐产生；

g.减少器官中的草酸钙沉积；

h.减少高草酸尿症；

i.治疗或预防草酸盐沉着症，包含全身性草酸盐沉着症；

j.治疗或预防血尿症；

k.预防终末期肾病(ESRD)；和/或

l.延缓或减轻对肾或肝移植的需要。

实施例36根据实施例1到8或29到35中任一项所述的供使用的方法或组合物，其中所述组合物增加血清和/或血浆乙醇酸水平。

实施例37根据实施例1到8或29到35中任一项所述的供使用的方法或组合物，其中所述组合物引起对HAO1基因进行编辑。

实施例38根据实施例37所述的供使用的方法或组合物，其中所述编辑被计算为编辑的群体的百分比(编辑百分比)。

实施例39根据实施例38所述的供使用的方法或组合物，其中所述编辑百分比介于群体的30％与99％之间。

实施例40根据实施例38所述的供使用的方法或组合物，其中所述编辑百分比介于群体的30％与35％之间、35与40％之间、40与45％之间、45与50％之间、50与55％之间、55与60％之间、60与65％之间、65与70％之间、70与75％之间、75与80％之间、80与85％之间、85与90％之间、90与95％之间或95与99％之间。

实施例41根据实施例1到8或29到35中任一项所述的供使用的方法或组合物，其中所述组合物减少尿草酸盐浓度。

实施例42根据实施例41所述的供使用的方法或组合物，其中尿草酸盐的减少引起肾中的肾结石和/或肾、肝、膀胱、心脏、皮肤或眼睛中的草酸钙沉积减少。

实施例43根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导序列选自：

a.SEQ ID NO:1-146；

b.SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、113、117、 129、145；以及

c.SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145。

实施例44根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述组合物包括包含以下的sgRNA：

a.SEQ ID NO:151-168中的任何一个；或

b.SEQ ID NO:251-268中的任何一个；或

c.选自SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、113、 117、129、145的引导序列；或

d.选自SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145的引导序列；

实施例45根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中靶序列位于人HAO1基因中的外显子1、3、4、5、6或8中。

实施例46根据实施例45所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中靶序列位于人HAO1基因中的外显子1中。

实施例47根据实施例45所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中靶序列位于人HAO1基因中的外显子3中。

实施例48根据实施例45所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中靶序列位于人HAO1基因中的外显子4中。

实施例49根据实施例45所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中靶序列位于人HAO1基因中的外显子6中。

实施例50根据实施例45所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中靶序列位于人HAO1基因中的外显子8中。

实施例51根据实施例1到50中任一项所述的方法，组合物或组合物，其中所述引导序列与HAO1的正链中的靶序列互补。

实施例52根据实施例1到50中任一项所述的方法，组合物或组合物，其中所述引导序列与HAO1的负链中的靶序列互补。

实施例53根据实施例1到50中任一项所述的方法，组合物或组合物，其中第一引导序列与HAO1基因的正链中的第一靶序列互补，并且其中所述组合物进一步包括与 HAO1基因的负链中的第二靶序列互补的第二引导序列。

实施例54根据前述实施例中任一项所述的方法，组合物或组合物，其中所述引导RNA包括选自SEQ ID No 1-146中的任何一个的引导序列并且进一步包括SEQ ID NO: 200的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:200的核苷酸紧随其3'端处的引导序列。

实施例55根据前述实施例中任一项所述的方法，组合物或组合物，其中所述引导RNA包括选自SEQ ID No 1-146中的任何一个的引导序列并且进一步包括SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203或SEQ ID No:400-450中的任何一个的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203或SEQ ID No:400-450 中的任何一个的核苷酸紧随其3'端处的引导序列。

实施例56根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是单引导(sgRNA)。

实施例57根据实施例56所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述sgRNA包括包含SEQ ID No:4、5、6、8、22、35、38、39、56、73、84、100、105、113、117、 129或145中的任何一个的引导序列。

实施例58根据实施例56所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID No:151-168或251-268中的任何一个。

实施例59根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是根据SEQ ID NO:300的谱式进行修饰的，其中N'共同地为表1的引导序列(SEQ ID No 1-146)中的任何一个。

实施例60根据实施例59所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中SEQ ID NO:300中的每个N为任何天然或非天然核苷酸，其中N'形成所述引导序列，并且所述引导序列将Cas9靶向到HAO1基因。

实施例61根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述sgRNA包括SEQ ID NO:1-146的引导序列和SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202或 SEQ IDNO:203的核苷酸中的任何一个，其中SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202或SEQ ID NO:203的所述核苷酸紧随其3'端处的引导序列。

实施例62根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述sgRNA包括与选自SEQ ID No:1-146的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、 94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列。

实施例63根据实施例62所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述sgRNA包括选自SEQ ID No:8、22、35、39、73、84、100、105、113、145、151-168和251-268 的序列。

实施例64根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA包括至少一个修饰。

实施例65根据实施例64述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述至少一个修饰包含经2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。

实施例66根据实施例63到65中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。

实施例67根据实施例63到66中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。

实施例68根据实施例63到67中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括所述引导RNA的5'端处的前五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。

实施例69根据实施例63到68中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括所述引导RNA的3'端处的最后五个核苷酸中的一个或多个核苷酸处的修饰。

实施例70根据实施例63到69中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括所述引导RNA的前四个核苷酸之间的PS键。

实施例71根据实施例63到70中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括所述引导RNA的最后四个核苷酸之间的PS键。

实施例72根据实施例63到71中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括所述引导RNA的5'端处的前三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。

实施例73根据实施例63到72中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其包括所述引导RNA的3'端处的最后三个核苷酸处的经2'-O-Me修饰的核苷酸。

实施例74根据实施例63到73中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA包括SEQ ID NO:300的经修饰的核苷酸。

实施例75根据实施例1到74中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

实施例76根据实施例1到75中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA与脂质纳米颗粒(LNP)相关。

实施例77根据实施例76所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述LNP 包括阳离子脂质。

实施例78根据实施例77所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述阳离子脂质是十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。

实施例79根据实施例76到78所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述LNP包括中性脂质。

实施例80根据实施例79所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述中性脂质是DSPC。

实施例81根据实施例76到80所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述LNP包括辅助脂质。

实施例82根据实施例81所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述辅助脂质是胆固醇。

实施例83根据实施例76到82所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述LNP包括隐形脂质。

实施例84根据实施例83所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述隐形脂质是PEG2k-DMG。

实施例85根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述组合物进一步包括RNA引导的DNA结合剂。

实施例86根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述组合物进一步包括对RNA引导的DNA结合剂进行编码的mRNA。

实施例87根据实施例85或86所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述RNA引导的DNA结合剂是Cas9。

实施例88根据前述实施例中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述组合物是药物调配物并且进一步包括药学上可接受的载体。

实施例89根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:1。

实施例90根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:2。

实施例91根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:3。

实施例92根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:4。

实施例93根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:5。

实施例94根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:6。

实施例95根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:7。

实施例96根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:8。

实施例97根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:9。

实施例98根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:10。

实施例99根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:11。

实施例100根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:12。

实施例101根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:13。

实施例102根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:14。

实施例103根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:15。

实施例104根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:16。

实施例105根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:17。

实施例106根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:18。

实施例107根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:19。

实施例108根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:20。

实施例109根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:21。

实施例110根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:22。

实施例111根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:23。

实施例112根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:24。

实施例113根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:25。

实施例114根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:26。

实施例115根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:27。

实施例116根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:28。

实施例117根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:29。

实施例118根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:30。

实施例119根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:31。

实施例120根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:32。

实施例121根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:33。

实施例122根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:34。

实施例123根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:35。

实施例124根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:36。

实施例125根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:37。

实施例126根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:38。

实施例127根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:39。

实施例128根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:40。

实施例129根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:41。

实施例130根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:42。

实施例131根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:43。

实施例132根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:44。

实施例133根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:45。

实施例134根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:46。

实施例135根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:47。

实施例136根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:48。

实施例137根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:49。

实施例138根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:50。

实施例139根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:51。

实施例140根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:52。

实施例141根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:53。

实施例142根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:54。

实施例143根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:55。

实施例144根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:56。

实施例145根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:57。

实施例146根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:58。

实施例147根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:59。

实施例148根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:60。

实施例149根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:61。

实施例150根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:62。

实施例151根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:63。

实施例152根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:64。

实施例153根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:65。

实施例154根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:66。

实施例155根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:67。

实施例156根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:68。

实施例157根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:69。

实施例158根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:70。

实施例159根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:71。

实施例160根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:72。

实施例161根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:73。

实施例162根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:74。

实施例163根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:75。

实施例164根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:76。

实施例165根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:77。

实施例166根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:78。

实施例167根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:79。

实施例168根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:80。

实施例169根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:81。

实施例170根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:82。

实施例171根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:83。

实施例172根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:84。

实施例173根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:85。

实施例174根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:86。

实施例175根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:87。

实施例176根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:88。

实施例177根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:89。

实施例178根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:90。

实施例179根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:91。

实施例180根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:92。

实施例181根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:93。

实施例182根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:94。

实施例183根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:95。

实施例184根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:96。

实施例185根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:97。

实施例186根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:98。

实施例187根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:99。

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实施例230根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:142。

实施例231根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:143。

实施例232根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:144。

实施例233根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:145。

实施例234根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:146。

实施例235根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中选自SEQ ID NO:1-146的序列是SEQ ID NO:146。

实施例236根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:251的sgRNA。

实施例237根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:252的sgRNA。

实施例238根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:253的sgRNA。

实施例239根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:254的sgRNA。

实施例240根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:255的sgRNA。

实施例241根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:256的sgRNA。

实施例242根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:257的sgRNA。

实施例243根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:258的sgRNA。

实施例244根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:259的sgRNA。

实施例245根据实施例1到88中任一项所述的供使用的方法、组合物或组合物，其中所述引导RNA是包括SEQ ID NO:260的sgRNA。

实施例246根据实施例1到245中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物以单剂量施用。

实施例247根据实施例1到246中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物施用一次。

实施例248根据实施例246或247中任一项所述的方法或组合物，其中所述单剂量或一次施用：

a.诱导DSB；和/或

b.减少HAO1基因的表达；和/或

c.治疗或预防PH1；和/或

d.治疗或预防由PH1引起的ESRD；和/或

e.治疗或预防草酸钙产生和沉积；和/或

f.治疗或预防高草酸尿症；和/或

g.治疗或预防草酸盐沉着症；和/或

h.治疗或预防血尿症；和/或

i.增加血清乙醇酸浓度；和/或

j.减少尿液中的草酸盐。

实施例249根据实施例248所述的方法或组合物，其中所述单剂量或一次施用在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周内实现a)-j)中的任何一个或多个。

实施例250根据实施例248所述的方法或组合物，其中所述单剂量或一次施用实现持久性效果。

实施例251根据实施例1到250中任一项所述的方法或组合物，其进一步包括实现持久性效果。

实施例252根据实施例251所述的方法或组合物，其中所述持久性效果持续至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少一年或至少5年。

实施例253根据实施例1到252中任一项所述的方法或组合物，其中施用所述组合物引起尿液中的草酸盐治疗上相关的减少。

实施例254根据实施例1到253中任一项所述的方法或组合物，其中施用所述组合物引起尿草酸盐水平在一定治疗范围内。

实施例255根据实施例1到254中任一项所述的方法或组合物，其中施用所述组合物引起草酸盐水平在正常范围的100％、120％或150％内。

实施例256一种根据实施例9到255中任一项所述的组合物或调配物，其用于制备用于治疗患有PH1的人类受试者的药物的用途。

还公开了一种用于制备用于治疗患有PH1的人类受试者的药物的根据前述实施例中任一项所述的组合物或调配物的用途。还公开了用于在治疗PH1中使用或用于在修饰HAO1基因(例如，在其中形成插入缺失或形成移码或无义突变)中使用的前述组合物或调配物中任何一个。

附图说明

图1A-1C示出了PHH中的dgRNA编辑％与HEK293_Cas9(图1A)、HUH7(图1B) 和PCH(图1C)编辑的相关性。

图2示出了对靶向HAO1的某些dgRNA的脱靶分析。

图3示出了对靶向HAO1的某些sgRNA进行的脱靶分析。

图4示出了PHH中靶向HAO1的某些sgRNA的编辑％的剂量应答曲线。

图5示出了PCH中靶向HAO1的某些sgRNA的编辑％的剂量应答曲线。

图6示出了对PHH中经靶向的HAO1修饰的sgRNA(表2中列出)进行的蛋白质印迹(Western Blot)分析。

图7示出了对PCH中经靶向的HAO1修饰的sgRNA(表2中列出)进行的蛋白质印迹分析。

图8示出了来自用经HAO1靶向修饰的sgRNA(表2中列出)处理的PHH的GO 蛋白定量值和插入缺失频率。

图9示出了来自用经HAO1靶向修饰的sgRNA(表2中列出)处理的PCH的GO 蛋白定量和插入缺失频率。

图10示出了小鼠中在体内的各种经修饰的sgRNA(表17中列出)的HAO1编辑百分比。

图11示出了在5周的研究中AGT缺陷型小鼠中在体内用包括经修饰的sgRNA(表 17中列出的G723)的LNP处理后的尿草酸盐水平。

图12示出了在15周的研究中AGT缺陷型小鼠中在体内用包括经修饰的sgRNA的LNP处理后的尿草酸盐水平。

图13示出了在15周的研究中AGT缺陷型小鼠中在体内用包括经修饰的sgRNA的LNP处理后的蛋白质印迹分析。

图14示出了在表20中描绘的编辑水平与蛋白水平之间的相关性。

图15在示例性sgRNA序列(SEQ ID NO:201)中从1到10标记了10个保守区YA 位点。数字25、45、50、56、64、67和83指示YA位点1、5、6、7、8、9和10的嘧啶在sgRNA中的位置，其中引导区指示为(N)x，例如，其中x任选地为20。

图16示出了可能的二级结构中的示例性sgRNA(SEQ ID NO:401；未示出所有修饰)，其中标签指定sgRNA的保守区的单独的核苷酸，包含下部茎区、凸起区、上部茎区、连结区(其核苷酸在5'到3'方向上可以分别称为N1到N18)、发夹1区和发夹2区。发夹1与发夹2之间的核苷酸被标记为n。sgRNA上可以存在引导区，并且所述引导区在此图中指示为在sgRNA的保守区之前的“(N)x”。

具体实施方式

现在将详细参照本发明的某些实施例，在附图中展示所述实施例的实例。尽管将结合所展示的实施例描述本发明，但应当理解，所述实施例并不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本发明旨在涵盖如所附权利要求和所包含的实施例定义的可以包含在本发明内的所有替代方案、修饰和等效物。

在详细描述本发明的教导之前，应理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a/an)”以及“所述(the)”均包含复数指代物。因此，例如，对“缀合物(a conjugate)”的引用包含多个缀合物，并且对“单元(acell)”的引用包含多个单元等。

数值范围包含定义所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测得值和可测量值被理解为近似值。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应当理解，上述的一般描述和详细描述两者均仅是示例性和解释性的，并且不限制本教导。

除非说明书中特别指出，否则说明书中叙述“包括”各个组分的实施例也被考虑是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；说明书中叙述“由各个组分组成”的实施例也被认为是“包括所述组分”或“基本上由所述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各个组分组成”的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“包括所述组分” (这种可互换性不适用于这些术语在权利要求中的使用)。术语“或”以开放性意义使用，也就是说，相当于“和/或”，除非上下文另外明确指示。

本文所使用的章节标题仅仅是出于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制期望的主题。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中限定的任何术语或本说明书的任何其它明确的内容矛盾，则以本说明书为准。虽然结合各个实施例对本发明教导进行了描述，但是本发明教导不旨在受限于此类实施例。相反，本发明教导涵盖各种替代方案、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的。

I.定义

除非另有说明，否则如本文中所使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：

本文中使用“多核苷酸”和“核酸”指代包括核苷或核苷类似物的多聚体化合物，所述核苷或核苷类似物具有沿骨架连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，所述骨架包含常规RNA、DNA、混合的RNA-DNA和其类似物的聚合物。核酸“骨架”可以由多种连接构成，包含以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯连接、肽-核酸键(“肽核酸”或 PNA；PCT号：WO 95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖，或具有取代(例如，2'甲氧基和/或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)，其类似物(例如，经修饰的尿苷，如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其它)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物 (例如，N

“引导RNA”、“gRNA”和简单的“引导”在本文中可互换使用以指代crRNA(也被称为CRISPR RNA)，或crRNA和trRNA的组合(也被称为tracrRNA)。crRNA和trRNA 可以作为单个RNA分子(单引导RNA、sgRNA)或在两个单独的RNA分子(双引导 RNA、dgRNA)中缔合。“引导RNA”或“gRNA”是指每种类型。trRNA可以是天然存在的序列，或与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。

如本文所用的“引导序列”是指在引导RNA内与靶序列互补并且用作将引导RNA 引导到靶序列以通过RNA引导的DNA结合剂进行结合或修饰(例如，切割)的序列。“引导序列”也可以被称为“靶向序列”或“间隔序列”。引导序列的长度可以是20个碱基对，例如，在酿脓链球菌(也就是说，Spy Cas9)和相关的Cas9同源物/直系同源物。较短或较长的序列还可以用作引导，例如，长度为15个、16个、17个、18个、19 个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。例如，在一些实施例中，引导序列包括选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施例中，靶序列例如在基因中或在染色体上，并且与引导序列互补。在一些实施例中，引导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可以为约75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。例如，在一些实施例中，引导序列包括与选自SEQ ID NO:1-146的序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸具有约 75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施例中，引导序列和靶区可以100％互补或相同。在其它实施例中，引导序列和靶区可以含有至少一个不匹配。例如，引导序列和靶序列可以含有1个、2个、3个或4个不匹配，其中靶序列的总长度为至少17个、18个、19个、20个或更多个碱基对。在一些实施例中，引导序列和靶区可以含有1-4个不匹配，其中引导序列包括至少17个、18 个、19个、20个或更多个核苷酸。在一些实施例中，引导序列和靶区可以含有1个、2 个、3个或4个不匹配，其中引导序列包括20个核苷酸。

RNA引导的DNA结合剂的靶序列包含基因组DNA的正链和负链两者(也就是说，给定的序列和序列的反向互补物)，因为RNA引导的DNA结合剂的核酸底物是双链核酸。因此，在引导序列被称为“与靶序列互补”的情况下，应当理解，引导序列可以将引导RNA引导为与靶序列的反向互补物结合。因此，在一些实施例中，在引导序列结合靶序列的反向互补物的情况下，除了引导序列中的U代替T之外，引导序列与靶序列的某些核苷酸(例如，不包含PAM的靶序列)相同。

本文所用的“RNA引导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性是序列特异性的并取决于RNA的序列。示例性RNA引导的DNA结合剂包含Cas切割酶/切口酶及其失活形式(“dCas DNA结合剂”)。本文所用的“Cas核酸酶”，也称为“Cas蛋白”涵盖Cas切割酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。Cas切割酶/切口酶和dCas DNA结合剂包含III 型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基和第2类Cas核酸酶。本文所用的“第2类Cas核酸酶”是具有RNA引导的DNA结合活性的单链多肽。第2类Cas核酸酶包含第2类Cas切割酶/切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，所述切割酶/切口酶进一步具有RNA 引导的DNA切割酶/切口酶活性，以及第2类dCas DNA结合剂，其中切割酶/切口酶活性失活。第2类Cas核酸酶包含例如，Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、 H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白和其修饰。Cpf1蛋白，Zetsche等人,《细胞(Cell)》,163:1-13(2015)，与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche 的Cpf1序列通过引用以其整体并入本文。参见例如，Zetsche，表S1和S3。参见例如， Makarova等人,《自然综述：微生物学(Nat RevMicrobiol)》,13(11):722-36(2015)； Shmakov等人,《分子细胞(Molecular Cell)》,60:385-397(2015)。

本文所用的“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指引导RNA以及RNA引导的DNA结合剂，如Cas核酸酶、例如Cas切割酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如，Cas9)。在一些实施例中，引导RNA将如Cas9等RNA引导的DNA结合剂引导到靶序列，并且引导RNA与靶序列杂交并且所述试剂与靶序列结合；在试剂是切割酶或切口酶的情况下，结合之后可以是切割或切口。

如本文所用，如果第一序列与第二序列的比对表明第二序列的X％或更多的位置整体上与第一序列匹配，则第一序列被认为“包括与第二序列具有至少X％同一性的序列”。例如，序列AAGA包括与序列AAG具有100％同一性的序列，因为比对将给出100％同一性，因为存在与第二序列的所有三个位置的匹配。只要相关核苷酸(如胸苷、尿苷或经修饰的尿苷)具有相同的互补物(例如，胸苷、尿苷或经修饰的尿苷的全部的腺苷；另一个实例是胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者均具有鸟苷或经修饰的鸟苷作为互补物)， RNA与DNA之间的差异(通常是尿苷代替胸苷或反之亦然)以及如经修饰的尿苷等核苷类似物的存在就不会对多核苷酸之间的同一性或互补性差异有贡献。因此，例如，序列5'-AXG(其中X为任何经修饰的尿苷，如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷) 被认为与AUG 100％相同，因为两者与同一序列(5'-CAU)完全互补。示例性的比对算法是本领域众所周知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法和尼德曼-翁施 (Needleman-Wunsch)算法。本领域的技术人员将理解，对于要比对的给定的序列对，适当的算法和参数设置选择是什么；对于长度通常类似并且氨基酸的预期同一性>50％或核苷酸的预期同一性>75％的序列，具有EBI在www.ebi.ac.uk网站服务器上提供的尼德曼-翁施算法的默认设置的尼德曼-翁施算法通常是适当的。

“mRNA”在本文中用于指代非DNA的多核苷酸并且包括可以被翻译成多肽的开放阅读框(也就是说，可以充当用于由核糖体和氨基酰化的tRNA翻译的底物)。mRNA 可以包括包含核糖残基或其类似物(例如，2'-甲氧基核糖残基)的磷酸糖骨架。在一些实施例中，mRNA磷酸-糖骨架的糖基本上由核糖残基、2'-甲氧基核糖残基或其组合组成。

表1和整个申请中示出了可用于本文所述的引导RNA组合物和方法的引导序列。

本文所用的“插入缺失”是指由在靶核酸中的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失的许多核苷酸组成的插入/缺失突变。

本文所用的“敲低”是指特定基因产物(如蛋白质、mRNA或两者)表达的降低。蛋白质的敲低可以通过从所关注的组织或细胞群中检测蛋白质的细胞总量来测量。用于测量mRNA敲低的方法是已知的并且包含对从所关注的组织或细胞群中分离的mRNA 进行测序。在一些实施例中，“敲低”可以是指特定基因产物表达的一些丧失，例如转录的mRNA量的减少或细胞群(包含体内群体，如组织中发现的那些群体)表达的蛋白质量的减少。

本文所用的“敲除”是指细胞中特定蛋白质表达的丧失。敲除可以通过检测细胞、组织或细胞群中的蛋白质的细胞总量来测量。在一些实施例中，本发明的方法“敲除”一个或多个细胞中(例如，包含体内群体的细胞群中，如在组织中发现的那些细胞群中) 的HAO1。在一些实施例中，敲除不是形成例如通过插入缺失产生的突变型HAO1蛋白，而是HAO1蛋白在细胞中表达的完全丧失。本文所用的“HAO1”是指作为HAO1基因的基因产物的羟基酸氧化酶1。人野生型HAO1序列可在NCBI基因编ID：54363； Ensembl:ENSG00000101323处获得。“GOX”和“GOX1”是基因同义词。

“1型原发性高草酸尿症(PH1)”是由于对肝过氧化物酶体丙氨酸-乙醛酸转氨酶(AGT)酶进行编码的AGXT基因突变引起的常染色体隐性病症。AGT将乙醛酸代谢为甘氨酸。AGT活性的缺少，或其对线粒体的错误靶向使乙醛酸氧化成草酸盐，所述草酸盐只能在尿液的排出。高草酸盐水平导致草酸钙结石形成和肾实质损伤，从而导致肾功能逐渐恶化，并且最终导致终末期肾病。因此，PH1的标志是过量草酸盐产生和沉积而在肾和尿道中形成草酸钙晶体。由草酸盐导致的肾损伤是由肾小管毒性、肾中草酸钙沉积以及草酸钙结石引起的尿路梗阻的组合导致的。肾功能受损会加剧疾病，因为过量的草酸盐不再能够有效地排出，从而导致草酸盐在骨骼、眼睛、皮肤和心脏以及其它器官中的积聚和结晶，从导致严重的疾病和死亡。标志是肾功能衰竭和终末期肾病。对于 PH1，没有经批准的药物疗法。

乙醇酸氧化酶(GO)，即AGT上游的肝过氧化物酶体酶是一种用于耗尽患病肝的底物以进行草酸盐合成从而潜在地预防发展PH1的病理学的可能机制。由羟基酸氧化酶(HAO1)基因编码的GO催化乙醇酸氧化为乙醛酸。抑制GO活性应抑制草酸盐产生，同时造成乙醇酸的积聚。与草酸盐不同，乙醇酸是可溶的并且很容易在尿液中排出。因此，在一些实施例中，提供了抑制GO活性的方法，其中一旦被抑制，则抑制草酸盐产生并且增加乙醇酸产生。

草酸盐，即乙醛酸的氧化产物只能在尿液中排出。尿液中高水平的草酸盐(“高草酸尿症”)是PH1的症状。因此，尿液中草酸盐的增加是PH1的症状。草酸盐可以与钙结合形成草酸钙，草酸钙是肾结石和膀胱结石的主要成分。草酸钙在肾和其它组织中的沉积可以导致尿液中带血(血尿症)、尿路感染、肾损伤和终末期肾病。随着时间的推移，血液中的草酸盐水平可能会升高，并且草酸钙可能会在全身的其它器官中沉积(草酸盐沉着症或全身性草酸盐沉着症)。

本文所用的“靶序列”是指靶基因中的与gRNA的引导序列互补的核酸序列。靶序列和引导序列的相互作用引导RNA引导的DNA结合剂在靶序列内结合并潜在地切口或切割(取决于试剂的活性)。

本文所用的“YA位点”是指5'-嘧啶-腺嘌呤-3'二核苷酸。“保守区YA位点”存在于sgRNA的保守区中。“引导区YA位点”存在于sgRNA的引导区中。sgRNA中未经修饰的YA位点可能容易被RNase-A样核酸内切酶(例如，RNase A)切割。在一些实施例中，sgRNA在其保守区中包括约10个YA位点。在一些实施例中，sgRNA在其保守区中包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个YA位点。图 15中指示了示例性保守区YA位点。图15中未示出示例性的引导区YA位点，因为引导区可以是任何序列，包含任何数量的YA位点。在一些实施例中，sgRNA包括图15中所指示的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个YA位点。在一些实施例中，sgRNA在以下位置或其子集处包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、 7个、8个、9个或10个YA位点：LS5-LS6；US3-US4；US9-US10；US12-B3；LS7-LS8； LS12-N1；N6-N7；N14-N15；N17-N18；以及H2-2到H2-3。在一些实施例中，YA位点包括修饰，这意味着YA位点的至少一个核苷酸被修饰。在一些实施例中，YA位点的嘧啶(也被称为嘧啶位置)包括修饰(其包含改变紧接嘧啶的糖的3'位的核苷间连接的修饰)。在一些实施例中，YA位点的腺嘌呤(也被称为腺嘌呤位置)包括修饰(其包含改变紧接腺嘌呤的糖的3'位的核苷间连接的修饰)。在一些实施例中，YA位点的嘧啶位置和腺嘌呤位置包括修饰。

本文所用的“治疗”是指针对受试者的疾病或病症的治疗剂的任何施用或应用，并且包含抑制疾病、阻止其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病或预防疾病的一种或多种症状的复发。例如，对PH1的治疗可以包括减轻PH1的症状。

本文使用的术语“治疗上相关的草酸盐减少”或“治疗范围内的草酸盐水平”意指与基线相比，尿草酸盐排出减少大于30％。参见，Leumann和Hoppe(1999)《肾脏病透析移植(Nephrol Dial Transplant)》14:2556-2558,2557处,第二栏。例如，达到治疗范围内的草酸盐水平意指将尿草酸盐从基线降低大于30％。在一些实施例中，“正常草酸盐水平”或“正常草酸盐范围”介于约80与约122μg草酸盐/毫克肌酸之间。参见， Li等人(2016)《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》1862(2):233-239。在一些实施例中，治疗上相关的草酸盐减少达到低于或在正常水平的200％、150％、 125％、120％、115％、110％、105％或100％内的水平。

术语“约”或“大约”意指如本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这将部分取决于如何测量或确定值。

II.组合物

A.包括引导RNA(gRNA)的组合物

本文提供了可用于例如使用引导RNA与RNA引导的DNA结合剂(例如， CRISPR/Cas系统)在HAO1基因内诱导双链断裂(DSB)的组合物。所述组合物可以向患有或疑似患有PH1的受试者施用。所述组合物可以向尿草酸盐输入增加或血清乙醇酸输出减少的受试者施用。靶向HAO1基因的引导序列如表1中SEQ ID NO:1-146处所示。

表1中在SEQ ID NO:1-146处所示的引导序列中的每个引导序列可以进一步包括另外的核苷酸以例如与在其3'端处的引导序列之后的以下示例性核苷酸序列形成crRNA：在5'到3'朝向上的GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:200)。在sgRNA 的情况下，上述引导序列可以进一步包括另外的核苷酸以例如与引导序列的3'端之后的以下示例性核苷酸序列形成sgRNA：在5'到3'朝向上的 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:201)或 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:203，其是没有四个末端U'的SEQ ID NO:201)。在一些实施例中，SEQ ID NO:201的所述四个末端U'不存在。在一些实施例中，仅存在SEQ ID NO:201的所述四个末端U'中的1个、2个或3个末端。

在一些实施例中，提供了包括如本文所述的引导序列和包括发夹区的“sgRNA的保守部分”的HAO1短单引导RNA(HAO1短-sgRNA)，其中发夹区缺少至少5-10个核苷酸或6-10个核苷酸。在某些实施例中，参考sgRNA的保守部分，例如表2B中的核苷酸H1-1到H2-15，HAO1短单引导RNA的发夹区缺少5-10个核苷酸。在某些实施例中，参考sgRNA的保守部分，例如表2B中的核苷酸H1-1到H1-12，HAO1短单引导RNA 的发夹1区缺少5-10个核苷酸。

表2A中示出了示例性的“sgRNA的保守部分”，其示出了酿脓链球菌(S.pyogene)Cas9(“spyCas9”(也被称为“spCas9”))sgRNA的“保守区”。第一行示出了核苷酸的编号，第二行示出了序列(SEQ ID NO:400)；并且第三行示出了“结构域”。Briner AE 等人,《分子细胞》56:333–339(2014)描述了在本文中指“结构域”的sgRNA的功能结构域，包含负责靶向的“间隔”结构域、“下部茎”结构域、“凸起”结构域、“上部茎”(其可以包含四环)结构域、“连结”结构域以及“发夹1”结构域和“发夹2”结构域。参见Briner等人,第334页，图1A。

表2B提供了本文所用的sgRNA结构域的示意图。在表2B中，区之间的“n”代表核苷酸的可变数量，例如，从0到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20或更多。在一些实施例中，n等于0。在一些实施例中，n等于1。

在一些实施例中，HAO1 sgRNA来自酿脓链球菌Cas9(“spyCas9”)或spyCas9等效物。在一些实施例中，sgRNA不是来自酿脓链球菌(“非spyCas9”)。在一些实施例中， 5-10个核苷酸或6-10个核苷酸是连续的。

在一些实施例中，HAO1短-sgRNA至少缺少如表2A所示的酿脓链球菌Cas9(“spyCas9”)sgRNA的保守部分的核苷酸54-58(AAAAA)。在一些实施例中，HAO1 短-sgRNA是至少缺少与例如通过成对或结构比对确定的spyCas9的保守部分的核苷酸 54-58(AAAAA)相对应的核苷酸的非spyCas9 sgRNA。在一些实施例中，非spyCas9 sgRNA是金黄色葡萄球菌Cas9(“saCas9”)sgRNA。

在一些实施例中，HAO1短-sgRNA至少缺少spyCas9 sgRNA的保守部分的核苷酸54-61(AAAAAGUG)。在一些实施例中，HAO1短-sgRNA至少缺少spyCas9 sgRNA的保守部分的核苷酸53-60(GAAAAAGU)。在一些实施例中，HAO1短-sgRNA缺少spyCas9 sgRNA的保守部分的核苷酸53-60(GAAAAAGU)或核苷酸54-61(AAAAAGUG)或例如通过成对或结构比对确定的非spyCas9 sgRNA的保守部分的对应核苷酸中的4个、 5个、6个、7个或8个核苷酸。

在一些实施例中，sgRNA包括SEQ ID NO:1-146的引导序列和另外的核苷酸中的任何一个以例如与在其3'端处的引导序列之后的以下示例性核苷酸序列形成crRNA：在5'到3'朝向上的GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:202)。参考以下野生型引导 RNA保守序列，SEQID NO:202缺少8个核苷酸： GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:203)。

表1：HAO1靶向的引导序列和对照引导序列以及染色体坐标

表2：HAO1靶向的crRNA和sgRNA命名和序列

表2A(spyCas9 sgRNA的保守部分；SEQ ID NO:400)

表2B

在一些实施例中，本发明提供了一种包括包含将RNA引导的DNA结合剂(其可以是核酸酶(例如，Cas核酸酶，如Cas9))引导到HAO1中的靶DNA序列的引导序列的一个或多个引导RNA(gRNA)的组合物。gRNA可以包括包含表1中示出的引导序列的crRNA。gRNA可以包括包含表1中示出的引导序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸的crRNA。在一些实施例中，gRNA包括包含与表1中示出的引导序列的至少17个、18个、19个或20个连续核苷酸具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的序列的crRNA。在一些实施例中，gRNA包括包含与表1中示出的引导序列具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列的crRNA。gRNA可以进一步包括trRNA。在本文描述的每个组合物和方法实施例中，crRNA和trRNA可以作为单个RNA(sgRNA)缔合，或可以位于单独的RNA(dgRNA)上。在sgRNA的上下文下，可以例如经磷酸二酯键或其它共价键共价连接crRNA组分和trRNA组分。

在本文所述的组合物、用途和方法实施例中的每个组合物、用途和方法实施例中，引导RNA可以包括两个RNA分子作为“双引导RNA”或“dgRNA”。dgRNA包括第一RNA分子和第二RNA分子，所述第一RNA分子包括包含例如表1中示出的引导序列的crRNA，所述第二RNA分子包括trRNA。第一RNA分子和第二RNA分子可以不共价连接，但可以经crRNA部分与trRNA部分之间的碱基配对形成RNA双链体。

在本文所述的组合物、用途和方法实施例中的每个组合物、用途和方法实施例中，引导RNA可以包括单个RNA分子作为“单引导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可以包括包含表1中示出的与trRNA共价连接的引导序列的crRNA(或其一部分)。sgRNA可以包括表1中示出的引导序列的17个、18个、19个或20个连续核苷酸。在一些实施例中，crRNA和trRNA经连接子共价连接。在一些实施例中，sgRNA经crRNA部分与trRNA 部分之间的碱基配对形成茎环结构。在一些实施例中，crRNA和trRNA经一个或多个非磷酸二酯键的键共价连接。

在一些实施例中，trRNA可以包括源自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列的全部或部分。在一些实施例中，trRNA包括截短的或经修饰的野生型trRNA。trRNA 的长度取决于所使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，trRNA包括或由5个个、6 个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18 个、19个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或 100个以上的核苷酸组成。在一些实施例中，trRNA可以包括某些二级结构，例如一个或多个发夹或茎环结构，或一个或多个凸起结构。

在一些实施例中，本发明提供了一种包括包含SEQ ID NO:1-146中的任何一个的引导序列的一个或多个引导RNA的组合物。

在一些实施例中，本发明提供了一种包括包含SEQ ID NO:151-168或251-268中的任何一个的一个或多个sgRNA的组合物。

在一方面，本发明提供了一种包括包含与SEQ ID NO:1-146的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列的gRNA 的组合物。

在其它实施例中，所述组合物包括至少一个，例如至少两个包括选自SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何两个或更多个引导序列的引导序列的gRNA。在一些实施例中，所述组合物包括至少两个各自包括与SEQ ID NO:1-146的核酸中的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同的引导序列的gRNA。

本发明的引导RNA组合物被设计为识别HAO1基因中的靶序列(例如，与其杂交)。例如，HAO1靶序列可以被提供的包括引导RNA的Cas切割酶识别和切割。在一些实施例中，可以由引导RNA将RNA引导的DNA结合剂(如Cas切割酶)引导到HAO1基因的靶序列，其中引导RNA的引导序列与靶序列杂交，并且RNA引导的DNA结合剂 (如Cas切割酶)切割靶序列。

在一些实施例中，基于HAO1基因内的靶序列确定对所述一个或多个引导RNA的选择。

在不受任何特定理论束缚的情况下，基因的某些区中的突变(例如，由于作为核酸酶介导的DSB的结果而发生的插入缺失导致的移码突变)可能比基因的其它区中的突变更不耐受，因此DSB的位置是可能导致的蛋白质敲低的数量或类型的重要因素。在一些实施例中，与HAO1内的靶序列互补或具有互补性的gRNA用于将RNA引导的DNA 结合剂引导到HAO1基因中的特定位置。在一些实施例中，gRNA被设计为具有与HAO1 的外显子1、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6或外显子8中的靶序列互补或具有互补性的引导序列。

在一些实施例中，引导序列与人HAO1基因中存在的靶序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％相同。在一些实施例中，靶序列可以与引导 RNA的引导序列互补。在一些实施例中，引导RNA的引导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可以至少为约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％。在一些实施例中，gRNA的靶序列和引导序列可以是100％互补或相同的。在其它实施例中，gRNA的靶序列和引导序列可以含有至少一个不匹配。例如，gRNA的靶序列和引导序列可以含有1个、2个、3个或4个不匹配，其中引导序列的总长度为20。在一些实施例中，gRNA的靶序列和引导序列可以含有1-4个不匹配，其中引导序列是 20个核苷酸。

在一些实施例中，本文公开的组合物或调配物包括包含对如本文所述的RNA引导的DNA结合剂(如Cas核酸酶)进行编码的开放阅读框(ORF)的mRNA。在一些实施例中，提供、使用或施用包括对RNA引导的DNA结合剂(如Cas核酸酶)进行编码的ORF的mRNA。

B.经修饰的gRNA和mRNA

在一些实施例中，gRNA经过化学修饰。包括一个或多个经修饰的核苷或核苷酸的gRNA被称为“经修饰的”gRNA或“经化学修饰的”gRNA，以描述一个或多个非天然和/或天然存在的用于替代或除了规范的A、G、C和U残基之外的组分或构型。在一些实施例中，经修饰的gRNA是用非规范核苷或核苷酸合成的，这里称为“经修饰的”。经修饰的核苷和核苷酸可以包含以下中的一种或多种：(i)磷酸二酯骨架连接中的非连接磷酸氧中的一个或两个和/或连接磷酸氧中的一个或多个的改变，例如替代(示例性骨架修饰)；(ii)核糖成分(例如，核糖上的2'羟基)的改变，例如替代；(示例性糖修饰)； (iii)用“脱磷”连接子大规模替代磷酸部分(示例性骨架修饰)；(iv)天然存在的核碱基(包含用非规范的核碱基进行)的修饰或替换(示例性碱基修饰)；(v)核糖磷酸骨架的替代或修饰(示例性骨架修饰)；(vi)寡核苷酸3'端或5'端的修饰，例如末端磷酸基的去除、修饰或替代或部分、帽或连接子的缀合(此类3'或5'帽修饰可以包括糖和/ 或骨架修饰)；和(vii)糖的修饰或替代(示例性糖修饰)。

化学修饰(如以上列出的那些化学修饰)可以组合以提供包括可以具有两个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)的经修饰的gRNA和/或mRNA。例如，经修饰的残基可以具有经修饰的糖和经修饰的核碱基。在一些实施例中，修饰 gRNA的每个碱基，例如所有碱基都具有经修饰的磷酸基，如硫代磷酸酯基。在某些实施例中，gRNA分子的磷酸基中的所有或基本上所有的磷酸基都用硫代磷酸酯基替代。在一些实施例中，经修饰的gRNA包括RNA的5'端处或附近的至少一个经修饰的残基。在一些实施例中，经修饰的gRNA包括RNA的3'端处或附近的至少一个经修饰的残基。

在一些实施例中，gRNA包括一个、两个、三个或更多个经修饰的残基。在一些实施例中，经修饰的gRNA中的至少5％(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少 20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％或100％)的位置是经修饰的核苷或核苷酸。

未经修饰的核酸可能易于被例如细胞内核酸酶或在血清中发现的核酸酶降解。例如，核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的gRNA可以含有一种或多种经修饰的核苷或核苷酸，例如以引入对细胞内或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施例中，在被体内和体外两方面引入到细胞群中，本文所述的经修饰的gRNA 分子可以表现出降低的先天免疫应答。术语“先天免疫应答”包含对外源性核酸的细胞应答，所述外源性核酸包含单链核酸，所述细胞应答涉及细胞因子表达和释放的诱导，特别是干扰素和细胞死亡。

在骨架修饰的一些实施例中，经修饰的残基的磷酸基可以通过用不同的取代基替代氧中的一个或多个氧来修饰。进一步地，经修饰的残基(例如经修饰的核酸中存在的经修饰的残基)可以包含用本文所述的经修饰的磷酸基大规模替代未经修饰的磷酸部分。在一些实施例中，磷酸骨架的骨架修饰可以包含导致不带电荷的连接子或具有不对称电荷分布的带电荷的连接子的改变。

经修饰的磷酸基的实例包含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氢磷酸酯、磷酰胺酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未经修饰的磷酸基中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子基团中的一个替代非桥氧中的一个可以使磷原子手性。立构磷原子可以具有“R”构型(本文为Rp) 或“S”构型(本文为Sp)。骨架还可以通过用氮(桥接的磷酰胺酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替代桥氧(也就是说，连接磷酸酯和核苷的氧) 来修饰。替换可以发生在连接氧处或连接氧中的两个连接氧处。

在某些骨架修饰中，磷酸基可以被不含磷的接头替代。在一些实施例中，带电荷的磷酸基可以被中性部分替代。可以替代磷酸基的部分的实例可以包含但不限于，例如甲基膦酸酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸盐、磺酰胺、硫代甲缩醛化物、甲缩醛化物、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲亚氨基、亚甲基亚肼基(methylenehydrazo)、亚甲基二甲亚肼基 (methylenedimethylhydrazo)和亚甲基氧甲亚氨基。

还可以构建模拟核酸的支架，其中磷酸连接子和核糖被耐核酸酶的核苷或核苷酸替代物替代。此类修饰可以包括骨架修饰和糖修饰。在一些实施例中，核碱基可以被替代骨架拴系。实例可以包含但不限于吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。

经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以包含对糖基的一个或多个修饰，也就是说，糖修饰。例如，2'羟基(OH)可以被修饰，例如被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替代。在一些实施例中，对2'羟基的修饰可以增强核酸的稳定性，因为羟基不再能去质子化以形成2'-醇盐离子。

2'羟基修饰的实例可以包含烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH

“脱氧”2'修饰可以包含氢(也就是说，脱氧核糖，例如部分dsRNA的突出部分)；卤素(例如，溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可以是例如，NH

糖修饰可以包括还可以含有具有与核糖中对应碳的立体化学构型相反的立体化学构型的一个或多个碳的糖基。因此，经修饰的核酸可以包含含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。经修饰的核酸还可以包含无碱基糖。这些无碱基糖也可以进一步在组成糖原子中的一个或多个糖原子处修饰。经修饰的核酸还可以包含一种或多种呈L形式的糖，例如，L-核苷。

本文所述的可以掺入经修饰的核酸中的经修饰的核苷和经修饰的核苷酸可以包含经修饰的碱基，也称为核碱基。核碱基的实例包含但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这些核碱基可以被修饰或完全替代，以提供可以掺入经修饰的核酸中的经修饰的残基。核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施例中，核碱基可以包含例如天然存在的和合成的碱基衍生物。

在采用双引导RNA的实施例中，crRNA和tracr RNA中的每一个都可以含有修饰。此类修饰可以在crRNA和/或tracr RNA的一端或两端处。在包括sgRNA的实施例中，可以化学修饰sgRNA的一端或两端处的一个或多个残基，和/或可以修饰内部核苷，和/ 或可以化学修饰整个sgRNA。某些实施例包括5'端修饰。某些实施例包括3'端修饰。

在一些实施例中，本文公开的引导RNA包括在于2017年12月8日提交的题为“经化学修饰的引导RNA(Chemically Modified Guide RNA)”的WO2018/107028A1中公开的修饰谱式之一，所述文献的内容据此通过引用以其整体并入。在一些实施例中，本文公开的引导RNA包括在US20170114334中公开的结构/修饰谱式之一，所述文献的内容据此通过引用以其整体并入。在一些实施例中，本文公开的引导RNA包括在 WO2017/136794中公开的结构/修饰谱式之一，所述文献的内容据此通过引用以其整体并入。

C.YA修饰

YA位点处的修饰(本文也被称为“YA修饰”)可以是例如通过化学修饰、取代或其它方式进行的核苷间连接的修饰、碱基(嘧啶或腺嘌呤)的修饰，和/或糖的修饰(例如在2'位置，如2'-O-烷基、2'-F、2'-moe、2'-F阿拉伯糖、2'-H(脱氧核糖)等)。在一些实施例中，“YA修饰”是例如通过干扰RNase对YA位点的识别或切割和/或稳定将切割位点的可及性降低到RNase的RNA结构(例如，二级结构)来改变二核苷酸基序的结构以降低RNA核酸内切酶活性的任何修饰。参见Peacock等人,《有机化学期刊(J Org Chem.)》76:7295–7300(2011)；Behlke,《寡核苷酸(Oligonucleotides)》18:305-320 (2008)；Ku等人,《先进药物输送评论(Adv.Drug Delivery Reviews)》,104:16-28(2016)； Ghidini等人,《化学通讯(Chem.Commun.)》,2013,49,9036。Peacock等人,Belhke,Ku 和Ghidini提供适于作为YA修饰的示例性修饰。涵盖本领域的技术人员已知的减少核酸内切酶降解的修饰。影响参与RNase切割的2'羟基的示例性2'核糖修饰是2'-H和2'-O- 烷基，包含2'-O-Me。如YA位点处的双环核糖类似物、UNA和残基的经修饰的核苷间连接等修饰可以是YA修饰。可以稳定RNA结构的示例性碱基修饰是假尿苷和5-甲基胞嘧啶。在一些实施例中，修饰YA位点的至少一个核苷酸。在一些实施例中，YA位点的嘧啶(也被称为“嘧啶位置”)包括修饰(其包含例如在其2'位置处的改变紧接嘧啶的糖的3'位的核苷间连接的修饰、嘧啶碱基的修饰和核糖的修饰)。在一些实施例中， YA位点的腺嘌呤(也被称为“腺嘌呤位置”)包括修饰(其包含改变紧接腺嘌呤的糖的 3'位的核苷间连接的修饰、嘧啶碱基的修饰和例如在其2'位置处的核糖的修饰)。在一些实施例中，YA位点的嘧啶和腺嘌呤包括修饰。在一些实施例中，YA修饰降低RNA核酸内切酶活性。

在一些实施例中，sgRNA包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9 个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或更多个YA位点处的修饰。在一些实施例中，YA位点的嘧啶包括修饰(其包含改变紧接嘧啶的糖的3'位的核苷间连接的修饰)。在一些实施例中，YA位点的腺嘌呤包括修饰(其包含改变紧接腺嘌呤的糖的3'位的核苷间连接的修饰)。在一些实施例中，YA位点的嘧啶和腺嘌呤包括修饰，如糖、碱基或核苷间连接修饰。YA修饰可以是本文所述的修饰类型中的任何类型。在一些实施例中，YA修饰包括硫代磷酸酯、2'-OMe或2'-氟中的一个或多个。在一些实施例中，YA修饰包括包含硫代磷酸酯、2'-OMe或2'-氟中的一个或多个的嘧啶修饰。在一些实施例中，YA修饰包括在含有一个或多个YA位点的RNA双链体区内的双环核糖类似物(例如，LNA、BNA或ENA)。在一些实施例中，YA修饰包括在含有YA位点的RNA 双链体区内的双环核糖类似物(例如，LNA、BNA或ENA)，其中YA修饰远离YA位点。

在一些实施例中，sgRNA包括引导区YA位点修饰。在一些实施例中，引导区包括 1个、2个、3个、4个、5个或更多个可以包括YA修饰YA位点(“引导区YA位点”)。在一些实施例中，定位于从5'末端的5'端开始的5端、6端、7端、8端、9端或10端处的一个或多个YA位点(其中“5端”等是指引导区的位置5到3'端，也就是说，引导区中的最3'核苷酸)包括YA修饰。在一些实施例中，定位于从5'末端的5'端开始的 5端、6端、7端、8端、9端或10端处的两个或更多个YA位点包括YA修饰。在一些实施例中，定位于从5'末端的5'端开始的5端、6端、7端、8端、9端或10端处的三个或更多个YA位点包括YA修饰。在一些实施例中，定位于从5'末端的5'端开始的5 端、6端、7端、8端、9端或10端处的四个或更多个YA位点包括YA修饰。在一些实施例中，定位于从5'末端的5'端开始的5端、6端、7端、8端、9端或10端处的五个或更多个YA位点包括YA修饰。经修饰的引导区YA位点包括YA修饰。

在一些实施例中，经修饰的引导区YA位点处于引导区的3'末端核苷酸的17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个核苷酸内。例如，如果经修饰的引导区YA位点处于引导区的3'末端核苷酸的10个核苷酸内，并且引导区为20个核苷酸长，则经修饰的引导区YA位点的经修饰的核苷酸定位于位置11-20中的任何位置处。在一些实施例中，YA修饰定位于从引导区的3'末端核苷酸开始的YA位点20个、19个、 18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6 个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸内。在一些实施例中，YA修饰定位于从引导区的3'末端核苷酸开始的20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12 个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸。

在一些实施例中，经修饰的引导区YA位点位于从5'末端的5'端开始的核苷酸4、5、6、7、8、9、10或11处或之后。

在一些实施例中，经修饰的引导区YA位点不是5'端修饰。例如，sgRNA可以包括如本文所述的5'端修饰并且进一步包括经修饰的引导区YA位点。可替代地，sgRNA可以包括未经修饰的5'端和经修饰的引导区YA位点。可替代地，sgRNA可以包括经修饰的5'端和未经修饰的引导区YA位点。

在一些实施例中，经修饰的引导区YA位点包括定位于引导区YA位点的5'位的至少一个核苷酸不包括的修饰。例如，如果核苷酸1-3包括硫代磷酸酯，核苷酸4仅包括2'-OMe修饰，并且核苷酸5是YA位点的嘧啶并包括硫代磷酸酯，则经修饰的引导区 YA位点包括定位于引导区YA位点的5'位的至少一个核苷酸(核苷酸4)不包括的修饰 (硫代磷酸酯)。在另一个实例中，如果核苷酸1-3包括硫代磷酸酯，并且核苷酸4是YA 位点的嘧啶并包括2'-OMe，则经修饰的引导区YA位点包括定位于引导区YA位点的5' 位的至少一个核苷酸(核苷酸1-3中的任何核苷酸)不包括的修饰(2'-OMe)。如果未经修饰的核苷酸定位于经修饰的引导区YA位点的5'处，也总是满足这个条件。

在一些实施例中，经修饰的引导区YA位点包括如上文针对YA位点所述的修饰。

上述概述中阐述了引导区YA位点修饰的另外的实施例。在本公开的其它地方阐述的任何实施例可以与前述实施例中的任何实施例以可行的程度结合。

在一些实施例中，sgRNA包括保守区YA位点修饰。保守区YA位点1-10如图15 所示。在一些实施例中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个保守区YA位点包括修饰。

在一些实施例中，保守区YA位点1、8或1和8包括YA修饰。在一些实施例中，保守区YA位点1、2、3、4和10包括YA修饰。在一些实施例中，YA位点2、3、4、 8和10包括YA修饰。在一些实施例中，保守区YA位点1、2、3和10包括YA修饰。在一些实施例中，YA位点2、3、8和10包括YA修饰。在一些实施例中，YA位点1、 2、3、4、8和10包括YA修饰。在一些实施例中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、 7个或8个另外的保守区YA位点包括YA修饰。

在一些实施例中，保守区YA位点2、3、4和10中的1个、2个、3个或4个位点包括YA修饰。在一些实施例中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个另外的保守区YA位点包括YA修饰。

在一些实施例中，经修饰的保守区YA位点包括如上文针对YA位点所述的修饰。

上述概述中阐述了保守区YA位点修饰的另外的实施例。在本公开的其它地方阐述的任何实施例可以与前述实施例中的任何实施例以可行的程度结合。

在一些实施例中，sgRNA包括下表3中所示的修饰谱式中的任何修饰谱式，其中N是任何天然或非天然的核苷酸，并且其中所有N'都包括如本文表1中所述的HAO1引导序列。表3没有描绘sgRNA的引导序列部分。尽管用N'取代引导的核苷酸，但修饰仍如表3中所示。也就是说，尽管引导的核苷酸替代了“N'”，但核苷酸被修饰，如表3 中所示。

表3：HAO1 sgRNA修饰图。引导序列未示出并且将随附在所述序列在其5'端处。

在一些实施例中，经修饰的sgRNA包括以下序列： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUm AmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAm AmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:300)，其中“N”可以是任何天然或非天然的核苷酸，并且其中所有N'都包括如表1中所述的HAO1引导序列。例如，本文涵盖了SEQ ID NO:300，其中N'被本文在表 1中公开的引导序列(SEQ ID No:1-146)中的任何引导序列替代。

下文所述的修饰中的任何修饰都可以存在于本文所述的gRNA和mRNA中。

术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”可以用于表示已经用2'-O-Me修饰的核苷酸。

2'-O-甲基的修饰可以描绘如下：

已经被示出影响核苷酸糖环的另一个化学修饰是卤素取代。例如，核苷酸糖环上的 2'-氟(2'-F)取代可以增加寡核苷酸结合亲和力和核酸酶稳定性。

在本申请中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”可以用于表示已经被2'-F取代的核苷酸。

2'-F的取代可以描绘如下：

硫代磷酸酯(PS)连接或键是指在磷酸二酯连接中，例如在核苷酸碱基之间的键中，硫取代一个非桥连磷酸氧的键。当硫代磷酸酯用于产生寡核苷酸时，经修饰的寡核苷酸也可以被称为硫寡核苷酸。

“*”可以用于描绘PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可以用于表示通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。

在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”或“mG*”可以用于表示已经被2'-O-Me 取代并通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。

下图示出了S-取代为非桥连磷酸氧，从而生成代替磷酸二酯键的PS键：

无碱基核苷酸是指缺少含氮碱基的那些核苷酸。下图描述了无碱基(也被称为无嘌呤)位点缺少碱基的寡核苷酸：

反向碱基是指具有从正常的5'到3'连接开始(也就是说，5'到5'连接或3'到3'连接) 反向的连接的那些反向碱基。例如：

无碱基核苷酸可以与反向连接进行连接。例如，无碱基核苷酸可以经5'到5'连接与末端5'核苷酸连接，或者无碱基核苷酸可以经3'到3'连接与末端3'核苷酸连接。末端5'或3'核苷酸处的反向无碱基核苷酸也可以被称为反向无碱基端帽。

在一些实施例中，修饰5'末端处的前三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个核苷酸，以及3'末端处的最后三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个核苷酸。在一些实施例中，修饰是2'-O-Me、2'-F、反向无碱基核苷酸、PS键或本领域公知的用于增加稳定性和/或性能的其它核苷酸修饰。

在一些实施例中，5'末端处的前四个核苷酸和3'末端处的最后四个核苷酸用硫代磷酸酯(PS)键连接。

在一些实施例中，5'末端处的前三个核苷酸以及3'末端处的最后三个核苷酸包括经 2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'末端处的前三个核苷酸和3'末端处的最后三个核苷酸包括经2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施例中，5'末端处的前三个核苷酸和3'末端处的最后三个核苷酸包括反向的无碱基核苷酸。

在一些实施例中，引导RNA包括经修饰的sgRNA。在一些实施例中，sgRNA包括 SEQID No:201、202或203中所示的修饰谱式，其中N为任何天然或非天然核苷酸，并且其中所有N'都包括在HAO1中将核酸酶引导到靶序列的引导序列，例如，如表1中所示。

在一些实施例中，引导RNA包括SEQ ID No:151-168或251-268中的任何一个所示的sgRNA。在一些实施例中，引导RNA包括包含SEQ ID No:1-146的引导序列和SEQ ID No:201、202或203的核苷酸中的任何一个的sgRNA，其中SEQ ID No:201、202或 203的核苷酸位于引导序列的3'端上，并且其中sgRNA可以如表3或SEQ ID NO:300 中所示进行修饰。

如上所述，在一些实施例中，本文公开的组合物或调配物包括包含对如本文所述的 RNA引导的DNA结合剂(如Cas核酸酶)进行编码的开放阅读框(ORF)的mRNA。在一些实施例中，提供、使用或施用包括对RNA引导的DNA结合剂(如Cas核酸酶) 进行编码的ORF的mRNA。在一些实施例中，对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的 ORF是“经修饰的RNA引导的DNA结合剂ORF”或简称为“经修饰的ORF”，其被用作指示ORF被修饰的简写。

在一些实施例中，经修饰的ORF可以至少在一个、多个或所有尿苷位置处包括经修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是在5位置处例如用卤素、甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是在1位置处例如用卤素、甲基或乙基修饰的假尿苷。经修饰的尿苷可以是例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-甲氧基尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和N1-甲基- 假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施例中，经修饰的尿苷是5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。

在一些实施例中，本文公开的mRNA包括5'帽，如帽0、帽1或帽2。5'帽通常是通过5'-三磷酸与mRNA的5'到3'链的第一核苷酸(也就是说，第一帽近端核苷酸)的 5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可以被进一步修饰，如下文例如关于ARCA 所讨论的)。在帽0中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖两者两者均包括2'-羟基。在帽1中，mRNA的第一转录核苷酸和第二转录核苷酸的核糖分别包括2'-甲氧基和2'-羟基。在帽2中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖两者均包括2'-甲氧基。例如，参见Katibah等人(2014)《美国国家科学院院刊》 111(33):12025-30；Abbas等人,(2017)《美国国家科学院院刊》114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核mRNA(包含哺乳动物mRNA，如人mRNA)包括帽1或帽2。帽0和其它不同于帽1和帽2的帽结构在如人等哺乳动物中可能是免疫原性的，因为先天免疫系统的组分(如IFIT-1和IFIT-5)将其识别为“非自身”，这可能导致包含I型干扰素的细胞因子水平升高。先天免疫系统的组分，如IFIT-1和IFIT-5还可以与eIF4E 竞争以与除了帽1或帽2之外的帽结合mRNA，从而潜在地抑制mRNA的翻译。

可以共转录地包含帽。例如，ARCA(抗反向帽类似物；赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，目录号：AM8045)是包括与可以在开始时在体外掺入转录物中的鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽类似物。ARCA 产生帽0帽，其中第一个帽近端核苷酸的2'位置是羟基。参见例如，Stepinski等人,(2001) “含有新颖“抗反向”帽类似物7-甲基(3'-O-甲基)GpppG和7-甲基(3'脱氧)GpppG的mRNA 的合成和性质(Synthesis and properties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse'cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG)”,RNA 7:1486-1495。 ARCA结构如下所示。

CleanCap

可替代地，可以在转录后向RNA添加帽。例如，牛痘封端酶可商购(新英格兰生物实验室(New England Biolabs目录号：M2080S)并且具有由其D1亚基提供的RNA 三磷酸酶和尿苷转移酶活性及其D12亚基提供的鸟嘌呤甲基转移酶。如此，所述牛痘封端酶可以在存在S-腺苷甲硫氨酸和GTP的情况下向RNA添加7-甲基鸟嘌呤，以提供帽 0。参见例如Guo,P.和Moss,B.(1990)《美国国家科学院院刊》87,4023-4027；Mao,X. 和Shuman,S.(1994)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269,24472-24479。

在一些实施例中，mRNA进一步包括多腺苷酸化(多A)尾。在一些实施例中，所述多A尾包括至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个腺嘌呤，任选地最多300个腺嘌呤。在一些实施例中，所述多A尾包括95个、96个、 97个、98个、99个或100个腺嘌呤核苷酸。

D.核糖核蛋白复合物

在一些实施例中，涵盖一种包括一个或多个gRNA以及RNA引导的DNA结合剂的组合物，例如核酸酶，如Cas核酸酶，如Cas9，所述一个或多个gRNA包括来自表1 的一个或多个引导序列或来自表2的一个或多个sgRNA。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有也可以被称为双链核酸内切酶活性的切割酶活性。在一些实施例中， RNA引导的DNA结合剂包括Cas核酸酶。Cas9核酸酶的实例包含酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其它原核生物的II型CRISPR系统(参见例如，下一段中的列表)及其经修饰(例如，工程化或突变型)型式中的那些实例。参见，例如US2016/0312198A1；US 2016/0312199A1。Cas核酸酶的其它实例包含III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亚基；以及I型CRISPR系统的级联复合物或其Cas3亚基。在一些实施例中，Cas核酸酶可以来自IIA型、IIB型或IIC型系统。关于各种CRISPR 系统和Cas核酸酶的讨论，参见例如，Makarova等人,《自然综述：微生物学(N

Cas核酸酶可以源自的非限制性示例性物种包含酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌、无害利斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形杆菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿产色链霉菌 (Streptomyces viridochromogenes)、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒化芽孢杆菌(Bacillusselenitireducens)、戟叶鹅绒藤微小杆菌 (Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体 (Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌 (Acetohalobiumarabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌 (Caldicelulosiruptorbecscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸降解菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌 (Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌 (Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌 (Nitrosococcuswatsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、鱼腥藻(nabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、极大节旋藻 (Arthrospira maxima)、最大节螺藻(Arthrospira maxima)、节旋藻(Arthrospirasp.)、林氏藻(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、移动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、巴氏链球菌 (Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseriacinerea)、拉里弯曲杆菌 (Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科细菌 (Lachnospiraceae bacterium)ND2006和深海单细胞蓝细菌(Acaryochloris marina)。

在一些实施例中，Cas核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的 Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西丝菌的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌的Cpf1核酸酶。在一些实施例中，Cas 核酸酶是来自毛螺菌科细菌ND2006的Cpf1核酸酶。在另外的实施例中，Cas核酸酶是来自以下的Cpf1核酸酶：土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、毛螺菌科细菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门细菌(Peregrinibacteria bacterium)、俭菌超门细菌(Parcubacteria bacterium)、丙酸氧化菌(Smithella)、氨基酸球菌(Acidaminococcus)、候选白蚁甲烷枝原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、良吉氏钩端螺旋体(Leptospirainadai)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施例中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。

在一些实施例中，gRNA与RNA引导的DNA结合剂一起被称为核糖核蛋白复合物(RNP)。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂是Cas核酸酶。在一些实施例中， gRNA与Cas核酸酶一起被称为Cas RNP。在一些实施例中，RNP包括I型、II型或III 型组分。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白。在一些实施例中，gRNA与Cas9一起被称为Cas9 RNP。

野生型Cas9有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域切割非靶DNA链，并且HNH结构域切割靶DNA链。在一些实施例中，Cas9蛋白包括多于一个RuvC结构域和/或多于一个HNH结构域。在一些实施例中，Cas9蛋白是野生型Cas9。在组合物、用途和方法实施例中的每一个中，Cas诱导靶DNA中的双链断裂。

在一些实施例中，使用嵌合型Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区被不同蛋白质的部分替代。在一些实施例中，Cas核酸酶结构域可以被来自如Fok1等不同核酸酶的结构域替代。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是经修饰的核酸酶。

在其它实施例中，Cas核酸酶可以来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中， Cas核酸酶可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施例中，Cas核酸酶可以是Cas3蛋白。在一些实施例中，Cas核酸酶可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施例中，Cas核酸酶可以具有RNA切割活性。

在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，也就是说，可以切割一条DNA链以产生单链断裂，也被称为“切口”。在一些实施例中，RNA引导的 DNA结合剂包括Cas切口酶。切口酶是在dsDNA中产生切口的酶，也就是说，切割DNA 双螺旋的一条链而不是另一条链。在一些实施例中，Cas切口酶是Cas核酸酶(例如，上文讨论的Cas核酸酶)的型式，其中核酸内切酶活性位点例如通过催化结构域中的一种或多种改变(例如，点突变)而失活。参见例如，美国专利第8,889,356号有关Cas 切口酶和示例性催化结构域改变的讨论。在一些实施例中，Cas切口酶(如Cas9切口酶) 具有失活的RuvC或HNH结构域。

在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂被修饰为仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，可以修饰试剂蛋白，使得核酸酶结构域之一发生突变或完全或部分缺失，以降低其核酸切割活性。在一些实施例中，使用具有降低活性的RuvC结构域的切口酶。在一些实施例中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施例中，使用具有降低活性的HNH结构域的切口酶。在一些实施例中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。

在一些实施例中，Cas蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施例中，Cas核酸酶可以包括RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包含D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如，Zetsche等人,(2015)《细胞》10月22:163(3):759-771。在一些实施例中，Cas核酸酶可以包括HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。 HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包含E762A、H840A、N863A、H983A 和D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如，Zetsche等人,(2015)。另外的示例性氨基酸取代包含D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西丝菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。

在一些实施例中，结合分别与靶序列的有义链和反义链互补的一对引导RNA提供对切口酶进行编码的mRNA。在此实施例中，引导RNA将切口酶引导到靶序列并且通过在靶序列的相反链上产生切口(也就是说，双切口)引入DSB。在一些实施例中，使用双切口可以改善特异性并减少脱靶效应。在一些实施例中，切口酶与两个单独的靶向 DNA的相反链的引导RNA一起使用以在靶DNA中产生双切口。在一些实施例中，切口酶与两个单独的被选择成非常接近的引导RNA一起使用以在靶DNA中产生双切口。

在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂缺少切割酶和切口酶活性。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包括dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，但基本上缺少催化(切割酶/切口酶)活性。在一些实施例中，dCas多肽是dCas9 多肽。在一些实施例中，缺少切割酶和切口酶活性的RNA引导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽是Cas核酸酶(例如，上文讨论的Cas核酸酶)的型式，其中所述核酸酶的核酸内切酶活性位点例如通过其催化结构域中的一种或多种改变(例如，点突变)而失活。参见例如，US 2014/0186958 A1；US2015/0166980 A1。

在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂包括一个或多个异源功能性结构域(例如，是或包括融合多肽)。

在一些实施例中，异源功能性结构域可以促进RNA引导的DNA结合剂运输到细胞核中。例如，异源功能性结构域可以是核定位信号(NLS)。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与1-10个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与1-5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与一个NLS 融合。当使用一个NLS时，NLS可以连接在RNA引导的DNA结合剂序列的N末端或C末端处。所述NLS还可以插在RNA引导的DNA结合剂序列中。在其它实施例中， RNA引导的DNA结合剂可以与多于一个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA 结合剂可以与2个、3个、4个或5个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA 结合剂可以与两个NLS融合。在某些情况下，所述两个NLS可以是相同的(例如，两个SV40 NLS)或不同的。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂与羧基末端处连接的两个SV40NLS序列融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与两个 NLS融合，一个在N末端处连接并且一个在C末端处连接。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以与3个NLS融合。在一些实施例中，RNA引导的DNA结合剂可以不与NLS融合。在一些实施例中，NLS可以是单分序列，例如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO:600)或PKKKRRV(SEQ ID NO:601)。在一些实施例中，NLS可以是二分序列，如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:602)。在具体实施例中，单个PKKKRKV(SEQ ID NO:600)NLS可以在RNA引导的DNA结合剂的C 末端处连接。在融合位点处任选地包含一个或多个连接子。

在一些实施例中，异源功能性结构域能够修饰RNA引导的DNA结合剂的细胞内半衰期。在一些实施例中，可以增加RNA引导的DNA结合剂的半衰期。在一些实施例中，可以减少RNA引导的DNA结合剂的半衰期。在一些实施例中，异源功能性结构域能够增加RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能性结构域能够减少 RNA引导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施例中，异源功能性结构域可以充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施例中，蛋白质降解可以由蛋白水解酶介导，所述蛋白水解酶例如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶。在一些实施例中，异源功能性结构域可以包括PEST序列。在一些实施例中，可以通过添加泛素或多泛素链来修饰RNA引导的 DNA结合剂。在一些实施例中，泛素可以是泛素样蛋白(UBL)。泛素样蛋白的非限制性实例包含小泛素样修饰物(SUMO)、泛素交叉反应型蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰物-1(URM1)、神经元前体细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母中也称为Rub1)、人白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8) 和-12(ATG12)、Fau泛素样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰物-1(UFM1)和泛素样蛋白-5(UBL5)。

在一些实施例中，异源功能性结构域可以是标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包含荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施例中，标志物结构域可以是荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包含绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、祖母绿、Azami绿、单体Azami绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、柠檬黄、Venus、YPet、PhiYFP、 ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、石青、mKalamal、GFPuv、天蓝色、 T-天蓝色(T-sapphire))、青色荧光蛋白(例如，ECFP、蔚蓝色(Cerulean)、CyPet、 AmCyan1、Midoriishi-青色)、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed 单体、mCherry、mRFP1、DsRed-表达、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-Tandem、HcRed1、 AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(例如，mOrange、 mKO、Kusabira-橙色、单体Kusabira-橙色、mTangerine、tdTomato)或任何其它合适的荧光蛋白。在其它实施例中，标志物结构域可以是纯化标签和/或表位标签。非限制性示例性标签包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白 (MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、多(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、 AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、多His和钙调蛋白。非限制性示例性报告基因包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶、荧光素酶或荧光蛋白。

在另外的实施例中，异源功能性结构域可以将RNA引导的DNA结合剂靶向特定细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施例中，异源功能性结构域可以将RNA引导的DNA结合剂靶向线粒体。

在另外的实施例中，异源功能性结构域可以是效应结构域。当将RNA引导的DNA 结合剂引导到其靶序列时，例如，当通过gRNA将Cas核酸酶引导到靶序列时，效应结构域可以修饰或影响靶序列。在一些实施例中，效应结构域可以选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如，非Cas核酸酶结构域)、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域。在一些实施例中，异源功能性结构域是核酸酶，如FokI核酸酶。参见例如美国专利第9,023,649号。在一些实施例中，异源功能性结构域是转录活化剂或阻遏物。参见例如Qi等人,“改变CRISPR用途作为用于基因表达的序列特异性控制的RNA引导的平台(RepurposingCRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of geneexpression)”，《细胞》152:1173-83(2013)；Perez-Pinera 等人,“通过基于CRISPR-Cas9的转录因子的RNA引导的基因激活(RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-basedtranscription factors)”《自然方法(Nat.Methods)》 10:973-6(2013)；Mali等人,“用于靶特异性筛选的CAS9转录激活因子和用于合作基因组工程的配对切口酶(CAS9transcriptional activators for target specificity screening and pairednickases for cooperative genome engineering)”,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》31:833-8(2013)；Gilbert等人,“真核生物中CRISPR介导的模块化RNA引导的转录调节(CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription ineukaryotes)”,《细胞》154:442-51(2013)。如此，RNA引导的DNA结合剂基本上成为可以使用引导RNA 引导以结合期望的靶序列的转录因子。

E.测定gRNA的功效

在一些实施例中，当与形成RNP的其它成分一起递送或表达时，测定gRNA的功效。在一些实施例中，gRNA蛋白与RNA引导的DNA结合剂(如Cas蛋白，例如，Cas9) 一起表达。在一些实施例中，gRNA被递送到已经稳定表达RNA引导的DNA核酸酶(如 Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的细胞系或在所述细胞系中表达。在一些实施例中，将gRNA作为RNP的一部分递送到细胞。在一些实施例中，将gRNA 以及对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶) 进行编码的mRNA一起递送到细胞。

如本文所述，使用本文公开的RNA引导的DNA核酸酶和引导RNA可以导致DNA 中的双链断裂，这可以在通过细胞机制进行修复时产生插入/缺失(插入缺失(indel)) 突变形式的错误。许多由于插入缺失造成的突变改变开放阅读框或引入提前终止密码子，并且因此产生非功能性蛋白。

在一些实施例中，基于体外模型确定特定gRNA的功效。在一些实施例中，体外模型是稳定表达Cas9的HEK293细胞(HEK293_Cas9)。在一些实施例中，体外模型是 HUH7人肝癌细胞。在一些实施例中，体外模型是HepG2细胞。在一些实施例中，体外模型是原代人肝细胞。在一些实施例中，体外模型是原代食蟹猴肝细胞。关于使用原代人肝细胞，可以使用可商购的原代人肝细胞以在实验之间提供更大的一致性。在一些实施例中，例如通过分析来自用Cas9 mRNA和引导RNA在体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA来测定缺失或插入在体外模型中(例如，在原代人肝细胞中)发生的脱靶位点的数量。在一些实施例中，此类测定包括分析来自用Cas9 mRNA、引导RNA和供体寡核苷酸在体外转染的原代人肝细胞的基因组DNA。以下工作实例中提供了用于此类测定的示例性程序。

在一些实施例中，对于gRNA选择过程，跨多个体外细胞模型测定特定gRNA的功效。在一些实施例中，执行数据与所选gRNA的细胞系比较。在一些实施例中，执行跨多个细胞模型中的交叉筛选。

在一些实施例中，基于体内模型确定特定gRNA的功效。在一些实施例中，体内模型是啮齿动物模型。在一些实施例中，啮齿动物模型是表达Hao1基因的小鼠。在一些实施例中，啮齿动物模型是表达人HAO1基因的小鼠。在一些实施例中，体内模型是非人灵长类动物，例如食蟹猴。

在一些实施例中，引导RNA的功效是通过HAO1的编辑百分比来测量的。在一些实施例中，将HAO1的编辑百分比与实现HAO1蛋白的敲低所必需的编辑百分比进行比较，所述蛋白例如在体外模型的情况下来自全细胞裂解物或在体内模型的情况下的组织中。

在一些实施例中，通过靶细胞类型的基因组内的脱靶序列处的插入缺失的数量和/ 或频率测量引导RNA的功效。在一些实施例中，提供了在细胞群中和/或相对于靶位点处插入缺失产生的频率以非常低的频率(例如，<5％)在脱靶位点处产生插入缺失的有效的引导RNA。因此，本公开提供了在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出脱靶插入缺失形成或在细胞群中和/或相对于靶位点处插入缺失产生的频率产生<5％的脱靶插入缺失形成的频率的引导RNA。在一些实施例中，本公开提供了在靶细胞类型(例如，肝细胞)中不表现出任何脱靶插入缺失形成的引导RNA。在一些实施例中，提供了在例如通过本文所述的一种或多种方法评估的少于5个脱靶位点处产生插入缺失的引导 RNA。在一些实施例中，提供了在例如通过本文所述的一种或多种方法评估的少于或等于4个、3个、2个或1个脱靶位点处产生插入缺失的引导RNA。在一些实施例中，一个或多个脱靶位点不出现在靶细胞(例如，肝细胞)基因组中的蛋白质编码区中。

在一些实施例中，检测基因编辑事件(如在靶DNA中形成插入/缺失(“插入缺失”)突变和同源性定向修复(HDR)事件)利用使用标记引物进行的线性扩增并使标记的扩增产物分离(本文此后称为“LAM-PCR”，或“线性扩增(LA)”方法)。

在一些实施例中，通过测量样品如体液(例如血清、血浆、血液或尿液)中乙醇酸的水平和/或草酸盐的水平来测量引导RNA的功效。在一些实施例中，通过测量血清或血浆中乙醇酸的水平和/或尿液中草酸盐的水平来测量引导RNA的功效。血清或血浆中乙醇酸的水平的增加和/或尿液中草酸盐的水平的降低表示存在有效的引导RNA。在一些实施例中，将尿草酸盐减少到0.7毫摩尔/24小时/1.73平方米以下。在一些实施例中，使用利用细胞培养基或血清或血浆的酶联免疫吸附测定(ELISA)测定来测量乙醇酸和草酸盐的水平。在一些实施例中，在用于测量编辑的相同体外或体内系统或模型中测量乙醇酸和草酸盐的水平。在一些实施例中，在细胞(例如原代人肝细胞)中测量乙醇酸和草酸盐的水平。在一些实施例中，在HUH7细胞中测量乙醇酸和草酸盐的水平。在一些实施例中，在HepG2细胞中测量乙醇酸和草酸盐的水平。

III.治疗方法

本文公开的gRNA和相关方法和组合物可用于治疗和预防PH1并预防PH1的症状。在一些实施例中，本文公开的gRNA可用于治疗和预防草酸钙产生、器官中的草酸钙沉积、高草酸尿症、草酸盐沉着症，包含全身性草酸盐沉着症以及血尿症。在一些实施例中，本文公开的gRNA可用于延缓或缓解对肾或肝移植的需要。在一些实施例中，本文公开的gRNA可用于预防终末期肾病(ESRD)。施用本文公开的gRNA将增加血清或血浆乙醇酸并减少草酸盐产生或积聚，使得在尿液中排出更少的草酸盐。因此，在一个方面，可以通过测量血清或血浆乙醇酸来评估治疗/预防的有效性，其中乙醇酸水平的增加指示有效性。在一些实施例中，可以通过测量样品中的草酸盐(如尿草酸盐)来评估治疗/预防的有效性，其中尿草酸盐的减少指示有效性。

健康受试者的尿液中的正常每日草酸盐排出量在每24小时10-40mg之间的范围内，而超过每24小时40-45mg的浓度被认为是临床高草酸尿症(参见例如，Bhasin等人,《世界肾脏学杂志(World J Nephrol)》,2015年5月6日；4(2):235-244)。因此，在一些实施例中，施用本文公开的gRNA和组合物可用于降低草酸盐的水平，使得受试者不再表现出与临床高草酸尿症相关的尿草酸盐水平。在一些实施例中，施用本文公开的gRNA 和组合物在24小时期间内将受试者的尿草酸盐减少到小于40mg。在一些实施例中，施用本文公开的gRNA和组合物在24小时期间内将受试者的尿草酸盐减少到小于35、小于30、小于25、小于20、小于15或小于10mg。

在一些实施例中，本文所述的gRNA、组合物或药物调配物中的任何一种或多种用于制备用于治疗或预防受试者的疾病或病症的药物。在一些实施例中，治疗和/或预防是用药物/组合物的单剂量(例如，一次性治疗)完成的。在一些实施例中，疾病或病症是 PH1。

在一些实施例中，本发明包括一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文所述的gRNA、组合物或药物调配物中的任何一种或多种。在一些实施例中，疾病或病症是PH1。在一些实施例中，本文所述的gRNA、组合物或药物调配物以单剂量施用，例如一次施用。在一些实施例中，单剂量实现持久的治疗和/或预防。在一些实施例中，所述方法实现持久的治疗和/或预防。本文所用的持久的治疗和/或预防包含延长至少以下时间的治疗和/或预防：i)3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、 10周、11周、12周、13周、14周或15周；ii)1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、 30个月或36个月；或iii)1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10 年。在一些实施例中，在受试者的生命期间，本文所述的单剂量的gRNA、组合物或药物调配物足以治疗和/或预防本文所述的适应症中的任何适应症。

在一些实施例中，本发明包括修饰(例如，产生双链断裂)靶DNA的方法或用途，所述方法或用途包括施用或递送本文所述的gRNA、组合物或药物调配物中的任何一种或多种。在一些实施例中，靶DNA是HAO1基因。在一些实施例中，靶DNA位于HAO1 基因的外显子中。在一些实施例中，靶DNA位于HAO1基因的外显子1、2、3、4、5、 6、7或8中。

在一些实施例中，本发明包括用于调节靶基因的方法或用途，所述方法或用途包括施用或递送本文所述的gRNA、组合物或药物调配物中的任何一种或多种。在一些实施例中，调节是对HAO1靶基因进行编辑。在一些实施例中，调节是由HAO1靶基因编码的蛋白质表达的变化。

在一些实施例中，所述方法或用途导致基因编辑。在一些实施例中，所述方法或用途导致靶HAO1基因内的双链断裂。在一些实施例中，所述方法或用途导致在DSB的非同源端连接期间形成插入缺失突变。在一些实施例中，所述方法或用途导致靶HAO1 基因中核苷酸的插入或缺失。在一些实施例中，靶HAO1基因中核苷酸的插入或缺失导致造成非功能性蛋白的移码突变或提前终止密码子。在一些实施例中靶HAO1基因中核苷酸的插入或缺失导致靶基因表达的敲低或消除。在一些实施例中，所述方法或用途包括DSB的同源性定向修复。

在一些实施例中，所述方法或用途导致HAO1基因调节。在一些实施例中，HAO1 基因调节是基因表达的降低。在一些实施例中，所述方法或用途导致由靶基因编码的蛋白质表达的降低。

在一些实施例中，提供了一种在HAO1基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括施用包括包含SEQ ID NO:1-146的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No: 151-168或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列的gRNA以在HAO1基因中诱导DSB。引导RNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶 (例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，提供了一种修饰HAO1基因的方法，所述方法包括施用包括包含SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或 251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQ IDNO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168 或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的gRNA以修饰HAO1基因。引导RNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，提供了一种治疗或预防PH1的方法，所述方法包括施用包括包含SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或 251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA的组合物。在一些实施例中，施用包括SEQ IDNO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168 或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的gRNA以治疗或预防PH1。引导RNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，提供了一种减少或消除草酸钙产生和/或沉积的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA。引导RNA可以与RNA 引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如 Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，提供了一种治疗或预防高草酸尿症的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168 或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA。引导RNA可以与RNA引导的 DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，提供了一种治疗或预防包含全身性草酸盐沉着症的草酸盐沉着症的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA。引导RNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，提供了一种治疗或预防血尿症的方法，所述方法包括施用包括SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或 251-268的sgRNA中的任何一个或多个的引导RNA。引导RNA可以与RNA引导的DNA 核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶 (例如，Cas9))进行编码的mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的gRNA以降低尿液中的草酸盐水平。gRNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如， Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的mRNA 或载体一起施用。

在一些实施例中，施用包括SEQ ID NO:1-146的引导序列中的任何一个或多个引导序列或SEQ ID No:151-168或251-268的sgRNA中的任何一个或多个的gRNA以增加血清或血浆中的血清乙醇酸。gRNA可以与RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))或对RNA引导的DNA核酸酶(如Cas核酸酶(例如，Cas9))进行编码的 mRNA或载体一起施用。

在一些实施例中，包括表1的引导序列的gRNA与RNA引导的DNA核酸酶(如 Cas核酸酶)一起诱导DSB，并且修复期间的非同源端连接(NHEJ)导致HAO1基因的突变。在一些实施例中，NHEJ导致一个或多个核苷酸的缺失或插入，这在HAO1基因中诱导移码或无义突变。

在一些实施例中，施用本发明的引导RNA(例如，在本文提供的组合物中)增加了受试者的乙醇酸的水平(例如，血清或血浆水平)，并且因此预防草酸盐积聚。

在一些实施例中，增加血清乙醇酸导致尿草酸盐减少。在一些实施例中，减少尿草酸盐减少或消除器官中草酸钙的形成和沉积。

在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是牛、猪、猴、羊、狗、猫、鱼或家禽。

在一些实施例中，提供了包括表1中的引导序列中的任何一个或多个引导序列或来自表2的一个或多个sgRNA(例如，在本文提供的组合物中)的引导RNA的用途以制备用于治疗患有PH1的人类受试者的药物。

在一些实施例中，静脉内施用引导RNA、组合物和调配物。在一些实施例中，将引导RNA、组合物和调配物施用到肝循环中。

在一些实施例中，单次施用包括本文提供的引导RNA的组合物足以敲低突变型蛋白的表达。在其它实施例中，多于一次施用包括本文提供的引导RNA的组合物可能有益于最大化治疗效果。

在一些实施例中，治疗减缓或停止PH1疾病进展。

在一些实施例中，治疗减缓或停止终末期肾病(ESRD)的进展。在一些实施例中，治疗减缓或停止对肾和/或肝移植的需要。在一些实施例中，治疗导致PH1症状变化的改善、稳定或减缓。

A.组合疗法

在一些实施例中，本发明包括组合疗法，所述组合疗法包括包含表1中(例如，本文提供的组合物中)公开的引导序列中的任何一个或多个引导序列的gRNA中的任何一个以及适于缓解如上所述的PH1及其症状的另外的疗法。

在一些实施例中，PH1的另外的疗法是维生素B6、水合、肾透析或肝或肾移植。在一些实施例中，另外的疗法是卢马西兰(lumasiran)(ALN-GO1；阿里拉姆制药公司(Alnylam))。

在一些实施例中，组合疗法包括包含表1中公开的引导序列中的任何一个或多个引导序列的gRNA以及靶向HAO1的siRNA中的任何一个。在一些实施例中，siRNA是能够进一步减少或消除野生型或突变型HAO1表达的任何siRNA。在一些实施例中， siRNA是药物卢马西兰(ALN-GO1；阿里拉姆制药公司)。在一些实施例中，在包括表 1中(例如，在本文提供的组合物中)公开的引导序列中的任何一个或多个引导序列的 gRNA中的任何一个之后施用siRNA。在一些实施例中，在用本文提供的gRNA组合物中的任何组合物治疗后，定期施用siRNA。

在一些实施例中，组合疗法包括包含表1中(例如，在本文提供的组合物中)公开的引导序列中的任何一个或多个引导序列的gRNA以及靶向HAO1的反义核苷酸中的任何一个。在一些实施例中，反义核苷酸是能够进一步减少或消除HAO1表达的任何反义核苷酸。在一些实施例中，在包括表1中(例如，在本文提供的组合物中)公开的引导序列中的任何一个或多个引导序列的gRNA中的任何一个之后施用反义核苷酸。在一些实施例中，在用本文提供的gRNA组合物中的任何gRNA组合物治疗后，定期施用反义核苷酸。

B.递送gRNA组合物

脂质纳米颗粒(LNP)是众所周知的用于递送核苷酸和蛋白货物的方式并且可以用于递送本文公开的引导RNA、组合物或药物调配物。在一些实施例中，LNP递送核酸、蛋白质或与蛋白质一起的核酸。

在一些实施例中，本发明包括一种用于将本文公开的gRNA中的任何一个递送到受试者的方法，其中gRNA与LNP相关。在一些实施例中，gRNA/LNP还与Cas9或对Cas9 进行编码的mRNA相关。

在一些实施例中，本发明包括一种包括公开的gRNA和LNP中的任何一个的组合物。在一些实施例中，组合物进一步包括Cas9或对Cas9进行编码的mRNA。

在一些实施例中，LNP包括阳离子脂质。在一些实施例中，LNP包括十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基) 甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯或另一种可电离脂质。参见例如 WO/2017/173054的脂质和其中描述的参考文献。在一些实施例中，LNP包括阳离子脂胺与RNA磷酸盐的约4.5、5.0、5.5、6.0或6.5的摩尔比(N:P)。在一些实施例中，术语阳离子和可电离在LNP脂质的上下文中是可互换的，例如，其中根据pH，可电离脂质是阳离子的。

在一些实施例中，与本文公开的gRNA相关的LNP用于制备用于治疗疾病或病症的药物。

电穿孔是众所周知的用于递送货物的方法，并且可以使用任何电穿孔方法来递送本文公开的gRNA中的任何一种。在一些实施例中，电穿孔可以用于递送本文公开的gRNA 和Cas9或对Cas9进行编码的mRNA中的任何一个。

在一些实施例中，本发明包括一种用于将本文公开的gRNA中的任何一个递送到离体细胞的方法，其中gRNA与LNP相关或与LNP无关。在一些实施例中，gRNA/LNP 或gRNA还与Cas9或对Cas9进行编码的mRNA相关。

在一些实施例中，本文所述的单独或在一种或多种载体上编码的引导RNA组合物在脂质纳米颗粒中调配或经脂质纳米颗粒施用；参见例如于2017年3月30日提交并于 2017年5月10日出版的题为“用于CRISPR/CAS组分的脂质纳米颗粒调配物(LIPID NANOPARTICLEFORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS)”的 WO/2017/173054，所述文献的内容据此通过引用以其整体并入。

在某些实施例中，本发明包括对包括本文描述的引导序列中的任何一个或多个引导序列的引导RNA中的任何一个进行编码的DNA或RNA载体。在一些实施例中，除了引导RNA序列，载体还进一步包括不对引导RNA进行编码的核酸。不对引导RNA进行编码的核酸包含但不限于启动子、增强子、调节序列和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的核酸，所述核酸酶可以是如Cas9等核酸酶。在一些实施例中，载体包括对 crRNA、trRNA或crRNA和trRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，载体包括对sgRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列和对RNA引导的DNA核酸酶进行编码的mRNA，所述核酸酶可以是Cas核酸酶，如Cas9或Cpf1。在一些实施例中，载体包括对crRNA进行编码的一个或多个核苷酸序列、trRNA以及对RNA引导的 DNA核酸酶进行编码的mRNA，所述核酸酶可以是Cas蛋白，如Cas9。在一个实施例中，Cas9来自酿脓链球菌(也就是说，Spy Cas9)。在一些实施例中，对crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可以是sgRNA)进行编码的核苷酸序列包括或由两侧是来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或部分的引导序列组成。包括或由crRNA、 trRNA或crRNA和trRNA组成的核酸可以进一步包括载体序列，其中载体序列包括或由与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起的非天然发现的核酸组成。

此描述和示例性实施例不应被视为限制。出于本说明书和所附权利要求的目的，除非另外说明，否则表示量、百分比或比例的所有数量和本说明书和权利要求书中使用的其它数值在所有情况下应理解为被术语“约”修饰到其尚未如此修饰的程度。因此，除非相反指出，否则以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据寻求获得的期望性质而改变。至少，并且并非试图将等效原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数量并且通过应用常规的舍入技术来解释。

注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包含复数指代物，除非明确和确切地限于一个指代物。本文所使用的术语“包含(include)”和其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项的列举并不排除可以被替代或添加到所列项的其它相似项。

实例

提供了以下实例以说明某些公开的实施例并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

实例1——材料和方法

核酸酶mRNA的体外转录(“IVT”)

使用线性化质粒DNA模板和T

用于转录实例中使用的Cas9 mRNA的序列包括SEQ ID NO:500或SEQ ID NO: 501。

SEQ ID NO:500:

ATGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGG GCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAA CACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCG GCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCG GCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGG TCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAG AAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGA AAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGG CCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTT CCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCA ACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCG TCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAAC CTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGC TCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGC GAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCAC AAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAA TCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCG CCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCG CTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAA GAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGT TCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCT GAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCC ACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTAC CCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCC GTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAA AATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCT TCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGA GAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACT GACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAG AACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTC AAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAAT CAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGA AGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGA AGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCT TAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCC GGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAAC AGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACT TCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCA CAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTC GCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTG AAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAA CCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAA GAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACA CGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATG TACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATC GTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGC GACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGA TGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTT GACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATT CATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCT TGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTG AAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTT TTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACG CTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGT ACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGA AATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAA GACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTA ACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCG CAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCG GCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCA CGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCG CATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAA ATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGA ACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATC ATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCT GGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTAC GTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGAT AACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCAT CGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACA AAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAG AACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTAC TTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCG ACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGAT

SEQ ID NO:501:

GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGC AGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATC GGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCA AGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGAT CGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAG AACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAA ATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGA AAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAAC ATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAA GAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTG GCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGA CAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGT TCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGC AAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAA AAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGA ACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGA CACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCA GACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCT GAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGA TACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGC TGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGG ATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCC TGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCT GCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTG GGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGG ACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGA CCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAG CTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTG CCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGT CAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGC TGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGA GTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCAT CAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATC GTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGA CATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATAC ACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGA GCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTT CATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCAC AGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAG CCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTC AAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAA ACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCG AAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAA CACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGAC ATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCA CATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAA GAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCA AGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAG AAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAA GGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTC GCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGA TCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAA GGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACG CATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAA AGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAA GAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCA TGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACC GCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGA CTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAG ACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACA GCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATT CGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGA AAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAA GAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGA AGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAA ACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAAC TGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAG CTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACA AGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATC CTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACA AGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTG GGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACAC AAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTG TACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCG AAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCG TTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTC TTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG

脂质纳米颗粒(LNP)调配物

通常，脂质纳米颗粒组分以不同的摩尔比溶解在100％乙醇中。将RNA货物(例如，Cas9 mRNA和sgRNA)溶解在25mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 5.0中，从而RNA 货物的浓度为大约0.45mg/mL。实例2-4中使用的LNP含有分别以以下摩尔比的可电离脂质(十八烷基-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、胆固醇、DSPC 和PEG2k-DMG：50:38:9:3。用以下调配LNP：脂胺与RNA磷酸盐的摩尔比为约6(N:P)，并且gRNA与mRNA的重量比为1:1。实例2-4中使用的LNP含有源自SEQ ID NO:501 的Cas9 mRNA。

使用利用乙醇中的脂质与两个体积的RNA溶液和一个体积的水的冲击射流混合的交叉流技术制备LNP。通过混合交叉将乙醇中的脂质与所述两个体积的RNA溶液混合。通过内联三通将第四水流与交叉的出口流混合(参见WO 2016010840图2)。将LNP在室温下保持

人HAO1引导设计和具有食蟹猴同源引导设计的人HAO1

使用人参考基因组(例如，hg38)和用户定义的所关注基因组区(例如，HAO1蛋白质编码外显子)在计算机上进行初始引导选择，以鉴别所关注区中的PAM。对于每个经鉴别的PAM，执行分析并报告统计数据。基于本领域已知的许多标准(例如，GC含量、预测的靶上活性和潜在的脱靶活性)，进一步选择gRNA分子并对其进行排序。

针对靶向外显子1、2、3、4、5、6、7和8内的蛋白质编码区的HAO1(ENSG00000101323)设计共计146个引导RNA。以上提供了引导和对应基因组坐标(表 1)。引导RNA中的七十二个引导RNA与食蟹猴HAO1具有100％的同源性。

Cas9(mRNA/蛋白质)和引导RNA体外递送

组成性地表达Spy Cas9(“HEK293_Cas9”)的人胚胎肾腺癌细胞系HEK293在补充有10％胎牛血清和500μg/ml G418的DMEM培养基中培养。转染前20小时，将细胞以 10,000个细胞/孔的浓度铺板在96孔板中(转染时约70％汇合)。根据制造商的方案，用脂质体RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)转染细胞。用含有单独的引导(25nM)、trRNA(25nM)、脂质体RNAiMAX(0.3微升/孔)和OptiMem的脂质体转染细胞。

人肝细胞癌细胞系HUH7(日本研究生物资源细胞库收藏(Japanese Collectionof Research Bioresources Cell Bank)，目录JCRB0403)在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。转染前20小时，将细胞以15,000个细胞/孔的浓度铺板在96孔板中(转染时约70％汇合)。根据制造商的方案，用脂质体MessengerMAX(赛默飞世尔科技公司，目录LMRNA003)转染细胞。用含有Spy Cas9 mRNA(100ng；SEQ ID No:500)、 MessengerMAX(0.3微升/孔)和OptiMem，随后用含有单独的引导(25nM)、示踪剂 RNA(25nM)、MessengerMAX(0.3微升/孔)和OptiMem的单独的脂质体依次转染细胞。

将原代人肝细胞(PHH)(Gibco，批号Hu8249和Hu8298)和原代食蟹猴肝细胞(PCH)(Gibco，批号Cy367)解冻并重悬于具有补充剂的肝细胞解冻培养基中(Gibco，目录CM7500)，然后进行离心。丢弃上清液，并且将沉淀的细胞重悬于肝细胞平板培养基加补充剂包(英杰公司(Invitrogen)，目录A1217601和CM3000)中。对细胞进行计数并将其以对于PHH为33,000个细胞/孔和对于PCH为50,000个细胞/孔的浓度铺板在涂有生物涂层胶原I的96孔板(赛默飞世尔科技公司，目录877272)上。使平板细胞在37℃和5％CO

对于利用dgRNA进行的研究，通过将等量的药剂混合并在95℃下温育2分钟并冷却到室温来对单独的crRNA和trRNA进行预退火。将由预退火的crRNA和trRNA组成的双引导(dgRNA)与Spy Cas9蛋白一起温育，以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。根据制造商的方案，用脂质体RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司，目录13778150)转染细胞。用含有Spy Cas9(10nM)、单独的引导(10nM)、示踪剂RNA(10nM)、脂质体 RNAiMAX(1.0微升/孔)和OptiMem的RNP转染细胞。

如下文进一步描述的，还用LNP处理原代人肝细胞和食蟹猴肝细胞。在用LNP处理之前，将细胞在37℃，5％CO

基因组DNA分离

转染后24、48、72或96小时收获HEK293_Cas9、HUH7、PHH和PCH转染的细胞。根据制造商的方案，使用50微升/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目录 QE09050)从96孔板中的每个孔中提取gDNA。如本文所述，使所有的DNA样品经受 PCR和后续NGS分析。

下一代测序(“NGS”)和靶上切割效率分析

为了定量地测定基因组中靶位置的编辑效率，利用深度测序来鉴别通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。在所关注的基因(例如，HAO1)内的靶位点周围设计PCR引物，并扩增所关注的基因组区。引物序列设计是按照所述领域的标准进行的。

根据制造商的方案(依诺米那(Illumina))执行另外的PCR以添加化学物质进行测序。在依诺米那MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段后，将读段与人参考基因组(例如，hg38)进行比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与所关注的靶区重叠的读段，并且计算野生型读段数相对于含有插入或缺失(“插入缺失”)的读段数。

将编辑百分比(例如，“编辑效率”或“编辑百分比”)定义为具有插入或缺失(“插入缺失”)的序列读段的总数占序列读段的总数(包含野生型)。

通过定量PCR进行的HAO1转录物分析

如实例3中进一步描述的，用利用来自表2的经修饰的选择引导调配的LNP处理原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞。将LNP在37℃下在含有3％的食蟹猴血清培养基(塔卡拉(Takara)，目录Y20020)中温育10分钟。在温育后，将LNP添加到人肝细胞或食蟹猴肝细胞中。在处理后二十一天，去除培养基，并向细胞中添加50微升/孔的TripleE (Gibco，目录12563-029)，然后使细胞在37℃下温育10分钟。向细胞中添加50微升/ 孔的培养基以淬灭TripleE并使细胞从板中解除关联。然后将细胞以2,000rpm离心沉淀，并从样品中抽吸上清液。为了分离mRNA，使用凯杰公司(Qiagen)RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司，目录74106)。根据制造商的方案完成RNeasy迷你试剂盒程序。使用纳米滴8000(赛默飞世尔科技公司，目录ND-

执行定量PCR以评估HAO1转录物水平。Taqman RNA到Ct 1步试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录4392938)用于产生PCR反应。根据制造商的方案完成反应设置。靶向HAO1的定量PCR探针(赛默飞世尔科技公司，目录4351372，转录物UniGene ID Hs01023324_g1)和18S(赛默飞世尔科技公司，目录4319413E)在PCR反应中使用。使用StepOnePlus实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司，目录4376600)根据制造商的方案执行实时PCR反应和转录物定量。

通过蛋白质印迹进行的分析乙醇酸氧化酶(GO)蛋白

用利用如实例3中进一步描述的来自表2的选择引导调配的LNP处理原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞。将LNP在37℃下在含有3％的食蟹猴血清培养基(塔卡拉 (Takara)，目录Y20020)中温育10分钟。在温育后，将LNP添加到人肝细胞或食蟹猴肝细胞中。转染后二十一天，去除培养基，并用50微升/孔RIPA缓冲液(波士顿生物制品公司(Boston BioProducts)，目录BP-115)加新添加的由完整的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛(Sigma)，目录11697498001)、1mM DTT和250U/ml苯并酶(EMD密理博公司(EMD Millipore)，目录71206-3)组成的蛋白酶抑制剂混合物使细胞裂解。将细胞在冰上保持30分钟，此时添加NaCl(最终浓度为1M)。将细胞裂解物充分混合并在冰上保留30分钟。将全细胞提取物(“WCE”)转移到PCR板并离心以使碎片沉淀。使用布拉德福德测定(布拉德福德(Bio-Rad)，目录500-0001)评估裂解物的蛋白质含量。根据制造商的方案完成布拉德福德测定程序。在使用前将提取物储存在-20℃下。

用使用如实例4中进一步描述的选择引导调配的LNP处理AGT缺陷型小鼠。从处理后的小鼠中收获肝，并且将60mg部分用于蛋白质提取。将样品放置在珠管中(MP 生物医学(MP Biomedical)，目录6925-500)并用600微升/样品的RIPA缓冲液(波斯顿生物制品公司，目录BP-115)加新添加的由完整的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛，目录116974500)组成的蛋白酶抑制剂混合物使细胞裂解并以5.0米/秒进行均质化。然后将样品在4℃下以14,000RPM离心10分钟并将液体转移到新的管中。以14,000RPM 执行最后离心持续10分钟，并使用如上所述的布拉德福测定对样品进行定量。

执行蛋白质印迹来评估GO蛋白水平。使裂解物与莱姆利(Laemmli)缓冲液混合并在95℃变性10分钟。根据制造商的方案，使用NuPage系统在4-12％Bis-Tris凝胶(赛默飞世尔科技公司，目录NP0323BOX)上运行蛋白质印迹，随后湿转移到0.45μm硝酸纤维素膜(布拉德福德，目录1620115)上。在转移之后，用水彻底冲洗膜并用丽春红S溶液(波士顿生物制品公司，目录ST-180)染色以确认完成和均匀转移。在室温下，在实验室摇杆上使用含

实例2——筛选和引导鉴定

多个细胞类型中HAO1引导的交叉筛选

将靶向人HAO1的引导和与食蟹猴同源的那些引导转染到HEK293_Cas9和HUH7 细胞系以及如实例1中所述的原代人肝细胞和食蟹猴肝细胞中。对包括跨每种细胞类型的每个引导序列的crRNA测定编辑百分比。以下列出了所有四种细胞系中表1中的引导序列的筛选数据(表7B-10)。

表7B示出了组成性地过度表达Spy Cas9蛋白的人肾腺癌细胞系HEK293_Cas9中的HAO1和对照物dgRNA(表7A)的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的三份样品的平均值和标准偏差。

表7A：对照物非HAO1引导

表8示出了在人肝细胞癌细胞系HUH7中用Spy Cas9 mRNA共转移的测试HAO1 和对照物dgRNA(表7A)的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％。N＝1。

表8：递送到HUH7细胞的crRNA的HAO1编辑数据

表9示出了在原代人肝细胞中用Spy Cas9蛋白共转移的测试HAO1和对照物dgRNA(表7A)的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。N＝3。

表10示出了在原代食蟹猴肝细胞中用Spy Cas9蛋白共转移的测试HAO1 dgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。N＝3。

通过比较PHH与细胞类型中的每种细胞类型之间的每个引导的编辑效率来计算相关性(图1)。

基于原代人肝细胞编辑数据，进一步评估引导序列的子集。此子集在表11中提供，其中再现了来自原代人肝细胞筛选的对应编辑数据。

HAO1引导的脱靶分析

使用基于寡核苷酸插入的测定(参见例如Tsai等人,《自然-生物技术(NatureBiotechnology)》.33,187–197；2015)测定通过靶向HAO1的Cas9切割的潜在的脱靶基因组位点。如上所述，在HEK293-Cas9细胞中筛选表11中的17个dgRNA(和三个具有已知脱靶谱式的对照引导)，并且在图2中绘制了脱靶结果。所述测定鉴别了一些 dgRNA的潜在脱靶位点并鉴别了不具有可检测的脱靶的其它位点。没有或具有很少的所鉴别的潜在脱靶位点的经修饰引导作为sgRNA合成以进行另外的分析(表2)。

另外，使用生化法(参见例如Cameron等人,《自然-方法(Nature Methods)》.6,600-606；2017)测定通过靶向HAO1的Cas9切割的潜在的脱靶基因组位点。如上所述，使用HEK293基因组DNA筛选表2中的10个经修饰的sgRNA(和三个具有已知脱靶谱式的对照引导)，并且在图3中绘制潜在脱靶结果。所述测定鉴别一些sgRNA的潜在脱靶位点。

用于验证潜在脱靶位点的靶向测序

用于检测潜在脱靶细胞的HEK293_Cas9细胞组成性地过度表达Cas9，从而导致与各种细胞类型的瞬时递送范例相比，潜在脱靶“击中”的数量更高。进一步地，生化测定通常会过度表示潜在脱靶位点的数量，因为所述测定利用了不受细胞环境影响的纯化高分子量基因组DNA，并且依赖于所使用的Cas9 RNP的剂量。因此，可以使用对所鉴别的潜在脱靶位点进行靶向测序来验证通过这些方法鉴别的潜在脱靶位点。

在一种方法中，用包括所关注的Cas9 mRNA和sgRNA(例如，具有用于评估的潜在脱靶位点的sgRNA)的LNP处理原代肝细胞。然后对原代肝细胞进行裂解，并且使用侧接于一个或多个潜在脱靶位点的引物产生用于NGS分析的扩增子。鉴别一定水平的插入缺失可以验证潜在脱靶位点，而缺少在潜在的脱靶位点处发现的插入缺失可能指示HEK293_Cas9细胞测定或生化测定中的假阳性。

在原代人肝细胞和食蟹猴肝细胞中交叉筛选含有Spy Cas9 mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒(LNP)调配物

在剂量应答测定中，在原代人肝细胞和原代食蟹猴肝细胞上测试了靶向人HAO1的经修饰的sgRNA和相匹配的食蟹猴sgRNA序列的脂质纳米颗粒(LNP)调配物。如实例1所述，调配LNP。如实例1所述，对原代人肝细胞和食蟹猴肝细胞进行铺板。在用 LNP处理之前，将两种细胞系在37℃，5％CO

表12示出了在原代人肝细胞中经LNP用Spy Cas9以14.7nM递送的测试HAO1 sgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。这些样品一式三份产生。

表13示出了在原代食蟹猴肝细胞中经LNP用Spy Cas9以14.7nM递送的测试HAO1sgRNA的编辑％、插入(Ins)％和缺失(Del)％的平均值和标准偏差。这些样品一式三份产生。

实例3.表型分析

对HAO1转录物进行的定量PCR分析

用使用从表2中的经修饰的sgRNA调配的LNP(如实例1所述)处理原代人肝细胞。如实例1所述，调配LNP。转染后二十一天，收获细胞并使RNA分离，并且如实例1所述，通过定量PCR对RNA进行分析。

分析RNA一式三份，以减少使用根据StepOnePlus实时PCR系统测定的Ct值计算的HAO1 mRNA。计算将每个样品内18S的Ct值与HAO1的值进行比较的比率。在将比率归一化到阴性对照物后，测定HAO1 mRNA的减少百分比。表14中提供了HAO1 mRNA减少％的数据。

对细胞内乙醇酸氧化酶进行蛋白质印迹分析

转染后二十一天，还收获了来自HAO1的定量PCR分析的细胞的一部分，并且制备全细胞提取物(WCE)，并使所述全细胞提取物经受如实例1所述的通过蛋白质印迹的分析。

如本文所述，还收集并处理了细胞的一部分以进行NGS测序。表15中提供了这些细胞的编辑数据。

通过蛋白质印迹分析WCE以减少GO蛋白。全长GO蛋白有370个氨基酸，并且预测分子量为41kD。在蛋白质印迹的对照通道(未经处理的细胞)中观察到此分子量的带(图6和7)。

使用Licor Odyssey图像工作室5.2版软件计算GO蛋白的减少百分比。使用粘着斑蛋白作为加载对照物，并与GO同时探测。计算将每个样品内粘着斑蛋白的密度测定值与涵盖GO带的总区的密度测定值进行比较的比率。在将比率归一化到阴性对照通道后，测定GO蛋白的减少百分比。表16中示出了结果，并且图8和图9中描绘了结果。

实例4.在患有PH1的小鼠模型中体内编辑Hao1

野生型和AGT缺陷型小鼠(Agxt

在调配LNP之前，与实例2中对靶向gRNA的人和食蟹猴HAO1的描述类似，对靶向鼠Hao1的dgRNA的编辑效率进行筛选。在鉴别活性dgRNA之后，合成一组较小的经修饰的sgRNA以用于体内的另外的评估。

根据体重对动物进行称重和分组，以制备基于组平均重量的给药溶液。以每只动物 0.2mL的量(每千克体重大约10mL)经侧尾静脉给药含有靶向鼠Hao1的经修饰的 sgRNA的LNP(参见下表17)。如实例1所述，调配LNP。治疗后一周，对野生型小鼠进行安乐死，并且收集肝组织以用于DNA提取和鼠Hao1的编辑分析。如下图10和表 17中所示，在治疗的小鼠中观察到剂量依赖性编辑水平。

在建立了LNP可以在体内编辑小鼠Hao1基因之后，以2mpk的剂量向AGT缺陷型小鼠施用含有G723的LNP(n＝4)。这些小鼠被关在代谢笼中，并在不同时间点收集尿液以获取草酸盐水平，例如，如Liebow等人,《美国肾脏病学会杂志(J Am Soc Nephrol.)》2017年2月；28(2):494-503中所述。表18示出了AGT缺陷型小鼠的编辑结果。实现的编辑％平均值(n＝4)为79.85，标准偏差为5.91。如图11所示，治疗后一周尿草酸盐水平降低，并且此降低水平持续到给药后至少5周，此时研究终止。表19 中示出了图11中描绘的数据。在对照组(注射PBS)动物(n＝3)中未观察到减少(未示出数据)。

表17.野生型小鼠模型编辑

*＝PS连接；“m”＝2'-O-Me核苷酸

表18.Agxt1

表19.Agxt1

在证明在LNP治疗后长达5周，AGT缺陷型小鼠中尿草酸盐持续减少之后，执行另外的研究以在给药后跟踪尿草酸盐长达15周以0.3mpk(n＝4)和1mpk(n＝4)的剂量向AGT缺陷型小鼠施用含有G723的LNP。这些小鼠被关在代谢笼中，并在不同时间点收集尿液以获取草酸盐水平，如上所述。表20示出了在15周的研究中AGT缺陷型小鼠的编辑结果。以0.3mpk剂量实现的编辑％平均值为75.8，标准偏差为2.6。以1mpk 剂量实现的编辑％平均值为72.75，标准偏差为12.50。如图12所示，治疗后尿草酸盐水平降低，并且此降低水平持续到给药后至少15周，此时研究终止。表21中示出了图12 中描绘的数据。在对照组(注射PBS)动物(n＝3)中未观察到减少(未示出数据)。如实例1中所述，处理来自经处理的小鼠的肝样品，并在蛋白质印迹上运行。使用如上所述的Licor Odyssey图像工作室5.2版软件计算GO蛋白的减少百分比并在表20中显示所述减少百分比。蛋白质印迹图像如图13中显示。图14示出了R

表20.Agxt

表21.Agxt1