马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记与应用

摘要

本发明提供一种马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记与应用。所述A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记，包括：上游引物：M10‑8‑F：ATCGGGCTTAACAGACCGC和下游引物：M10‑8‑R：GACTGACCTGCTCTTTTTGGC。本发明以马铃薯普通栽培种Barbara为亲本，与F58050进行杂交，构建回交群体。利用NGS‑BSA技术，结合分子标记开发，获得与马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel标记。本发明利用与马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel标记检测本实验室育种高代系，发现符合率高达65.5％，这说明该标记可以应用于马铃薯抗病毒育种中的辅助选择。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel 分子标记与应用。与马铃薯极端抗性基因Ra连锁的Indel标记位于马铃薯4号染色体，记为 M10-8。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberrosum L.)作为世界上第四大粮食作物，也是我国重要的农业经济作物。随着我国对于马铃薯主粮化部署的推进，粮菜兼用的马铃薯越来越受到大家的重视。但是，在过去的20多年里，马铃薯病毒病和马铃薯病毒引起的种薯退化成为了影响马铃薯生产的重要问题之一。有多达40种以上的病毒和类病毒能够在田间条件下侵染马铃薯，其中我国以马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯S病毒(PVS)等六种病毒以及一种马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的危害最为严重。这些病毒不仅导致植株生理代谢紊乱、活力降低，还造成不同程度的产量和品质的下降。其中PVY和PLRV导致的减产可达40％以上 (聂碧华等，2012；Palukaitis，2012)，而PVA它虽然单独侵染症状较轻、影响较小，但与其他病毒复合侵染时也导致比较严重的减产。

PVA和PVY病毒在细胞水平上侵染马铃薯植株，因而很难使用化学药剂防治，培育抗病品种是最为有效、经济、环保的病毒防治策略。已知的马铃薯寄主抗性主要有两种，分别为极端抗性(extreme resistance，ER)和过敏性抗性(hypersensitive resistance，HR)。极端抗性指的病毒侵染马铃薯后没有任何症状产生，相反的是过敏性抗性指的是病毒侵染马铃薯后产生坏死症状。但是在病毒持续侵染的过程中，过敏性抗性会被病毒克服，但是极端抗性不会。前人报道，控制PVA和PVY的极端抗性基因分别为Ra和Ry。目前关于Ry的报道较多，已经报道的三种主要来源的4个极端抗性(Extreme Resistance，ER)基因，包括来源于Solanum. chacoense的Ry

但是，同样属于Y病毒属的PVA病毒的相关抗性研究相对较少。Valkonen(1997)在部分结薯的野生种和栽培品种中进行了4种马铃薯Y病毒属病毒(TEV，PVY，PVA，PVV) 的抗性鉴定，结果显示野生种S.stoloniferum、S.sucrense以及栽培种King Edward、PentlandDell在接种PVA病毒后，分别在接种叶和顶部叶片上产生过敏性坏死症状，它们可能含有控制过敏性抗性的Na基因，同时，野生种S.ployadenium在摩擦和嫁接接种PVA后均无症状，也检测不到病毒存在，可能含有控制极端抗性的Ra基因(Valkonen，1997)。研究显示，来自S.tuberosum subsp.andigena的马铃薯2x(v-2)7在摩擦接种PVA后无症状，ELISA也检测不到病毒。而嫁接接种后，顶部叶片发生坏死，但仅在有坏死症状的部分检测到低含量的PVA，无症状部分则不含PVA病毒，该材料同时也具有对PVY病毒的极端抗性基因Ry

现有技术存在的问题：目前并没有报道与马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记；目前还没有开发出能够用于马铃薯A病毒极端抗性基因Ra进行分子标记辅助选择的理想标记。ELISA检测技术虽然比较准确，但是需要对材料进行接种后再鉴定抗性，增加了育种周期，耗费大量人力物力财力。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供一种马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel 分子标记与应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1.马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记，其全长序列如下：

上游引物：M10-8-F：ATCGGGCTTAACAGACCGC；

下游引物：M10-8-R：GACTGACCTGCTCTTTTTGGC。

2.马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记的筛选方法，包括：

(1)回交群体构建：亲本Barbara与F58050均为本实验室保存的育种材料。Barbara× F58050的杂交后代BF145对PVA表现抗病，利用BF145与F58050进行回交，构建回交群体BC

(2)BC

(3)通过对回交群体BC1F所有后代进行对PVA抗性鉴定的结果，在288个单株中挑选抗感各30株，收集这60个单株的DNA。等质量混合后构建2个混池，分别为R池和S 池。将构建好的R池和S池送至诺禾致源公司使用Illumina测序仪进行全基因组测序，每个池均构建350bp文库，读长数为150bp，测序深度为50×(建库类型是动植物全基因组小片段文库(350bp)，测序策略是Hiseq-PE150)。

(4)对测序数据进行分析，获得抗感混池之间的差异Indel，如图1所示。具体分析步骤如下：①使用BWA软件(version0.7015-r1140)的MEM算法将抗感混池的测序数据与参考基因组比对，得到SAM格式的比对结果；②使用samtools软件(version1.3.1)将SAM格式的文件转换成BAM格式；③使用Picard工具(version1.91)中的SortSam对BAM文件中的reads进行排序，得到的BAM文件可以用于统计抗感混池间的Indel差异。

(5)多态性Indel标记筛选：从http://potato.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml上下载PGSC_DM_v4.03基因组序列，搜索4号染色体上Indel位点的DNA序列，选取该位点前后150bp的序列，在 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)上依据默认参数设计引物。总共设计了120对引物，在亲本BF145和F58050之间进行多态性筛选，总共获得20对具有多态性的引物。

(6)利用筛选得到的在亲本BF145和F58050间的多态性引物，对BC1F群体中所有单株进行PCR扩增。PCR反应体系为20μl，具体如下：DNA模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Utaq PCR Mix(2×)10μl，ddH

(7)根据BC

(8)标记M10-8的引物序列如下：F-ATCGGGCTTAACAGACCGC， R-GACTGACCTGCTCTTTTTGGC；产物大小为197bp。

3.马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记的应用，包括：

(1)对实验室58份高代系材料进行PVA接种，ELISA检测其对PVA的抗性。

(2)采取CTAB方法提58份材料DNA。

(3)利用标记M10-8检测58份高代系材料，具体步骤包括：①PCR扩增反应体系为DNA模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Utaq PCR Mix(2×)10μl，，ddH2O 8μl；②反应程序采用Touchdown PCR程序：95℃预变性3min，然后12循环依次经过95℃变性30s、Ta℃(每循环减少0.5℃)1min、72℃延伸1min30s，随后23循环依次经过95℃变性30s、Ta-6℃退火1min、72℃延伸1min30s，最后72℃延伸5min；保存至4℃取出；③利用3％的琼脂糖凝胶进行检测。

(4)结果判定，58份高代系材料中34份对PVA表现极端抗，26份材料对PVA表现极端感。利用标记M10-8对58份高代系材料检测表明，58份材料表型鉴定结果与标记检测结果符合率达65.5％。将表型鉴定结果与标记检测结果进行相关性分析，相关系数为0.278*，在0.05水平上显著相关。上述结果表明该标记与马铃薯对PVA抗性是密切相关的，可以用该标记较好的区分马铃薯高代系对PVA的抗性。

有益效果：

(1)本发明以马铃薯普通栽培种Barbara为亲本，与F58050进行杂交，构建回交群体。利用NGS-BSA技术，结合分子标记开发，获得与马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel 标记，为抗性基因Ra的克隆奠定了基础。

(2)本发明利用与马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel标记检测本实验室育种高代系，发现符合率高达65.5％，这说明该标记可以应用于马铃薯抗病毒育种中的辅助选择。

附图说明

图1BC

图2是抗感池之间的差异Indel在染色体上的分布图；

其中，横坐标表示物理位置，纵坐标表示1Mb内Indel的个数。

图3是遗传连锁图；

其中，左侧数字表示遗传距离，右侧为标记，红色字体是抗病基因，绿色字体与抗病基因遗传距离最近的标记。

图4是9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后的部分结果；

其中，泳道3和泳道26均为Marker，大小依次为1353bp，1078bp，872bp，603bp， 310bp，281bp，271bp，234bp，194bp，118bp，72bp；泳道48为亲本F58050，泳道 49为亲本Barbara，泳道50为BF145。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记全长序列，具体如下：

上游引物：M10-8-F：ATCGGGCTTAACAGACCGC；

下游引物：M10-8-R：GACTGACCTGCTCTTTTTGGC。

实施例2

本实施例提供马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记的筛选方法，具体如下：

(1)回交群体构建：如图1所示，亲本Barbara与F58050均为本实验室保存的育种材料。Barbara×F58050的杂交后代BF145对PVA表现抗病，利用BF145与F58050进行回交，构建回交群体BC

(2)BC

(3)通过对回交群体BC

(4)对测序数据进行分析，获得抗感混池之间的差异Indel，如图2所示。具体分析步骤如下：①使用BWA软件(version0.7015-r1140)的MEM算法将抗感混池的测序数据与参考基因组比对，得到SAM格式的比对结果；②使用samtools软件(version1.3.1)将SAM格式的文件转换成BAM格式；③使用Picard工具(version1.91)中的SortSam对BAM文件中的reads进行排序，得到的BAM文件可以用于统计抗感混池间的Indel差异。

(5)多态性Indel标记筛选：从http://potato.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml上下载PGSC_DM_v4.03基因组序列，搜索4号染色体上Indel位点的DNA序列，选取该位点前后150bp的序列，在 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)上依据默认参数设计引物。总共设计了120对引物，在亲本BF145和F58050之间进行多态性筛选，总共获得20对具有多态性的引物。

(6)利用筛选得到的在亲本BF145和F58050间的多态性引物，对BC

(7)根据BC

(8)标记M10-8的引物序列如下：F-ATCGGGCTTAACAGACCGC， R-GACTGACCTGCTCTTTTTGGC；产物大小为197bp。

实施例3

本实施例提供马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记的应用，具体如下：

(1)对实验室58份高代系材料进行PVA接种，ELISA检测其对PVA的抗性。

(2)采取CTAB方法提58份材料DNA。

(3)利用标记M10-8检测58份高代系材料，具体步骤包括：①PCR扩增反应体系为DNA模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Utaq PCR Mix(2×)10μl，， ddH

(4)结果判定，58份高代系材料中34份对PVA表现极端抗，26份材料对PVA表现极端感。如图4所示，利用标记M10-8对58份高代系材料检测表明，58份材料表型鉴定结果与标记检测结果符合率达65.5％。将表型鉴定结果与标记检测结果进行相关性分析，相关系数为0.278

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

参考文献及引用的实验方法：

[1]聂碧华.马铃薯Y病毒新变异株系的克隆鉴定及马铃薯-病毒互作机制研究.华中农业大学博士研究生论文，2018.

[2]白磊，郭华春.马铃薯多抗亲本的分子标记辅助筛查.分子植物育种，2017，15:200-212.

[3]聂碧华，谢从华，聂先舟.马铃薯抗病毒机制研究进展.园艺学报，2012，39:1703-1714.

[4]王晓明，金黎平，尹江.马铃薯抗病毒病育种研究进展.中国马铃薯，2005，19:285-289.

[5]徐建飞，金黎平.马铃薯遗传育种研究:现状与展望.中国农业科学，2017，50:990-1015.

[6]李佳，李明，王芳，叶广继，周云，王舰.RYSC3和Rxsp分子标记在马铃薯抗病育种中的应用.分子植物育种，2017，15:4040-4046.

[7]Palukaitis P.Resistance to viruses of potato and theirvectors.Plant Pathol J，2012，28: 248-258.

[8]Valkonen JPT et al.Resistance to Potato virus Y in Potato.In:Lacomme C，Glais L， Bellstedt D，Dupuis B，Karasev A，Jacquot E.(eds)Potato virusY:biodiversity，pathogenicity， epidemiology and management.Springer，Cham，2017.

[9]Ronde DD，Butterbach P，and elink R.Dominant resistance againstplant viruses.Frontiers in Plant Science，2014，5:307-323.

[10]Valkonen JPT.Novel resistances to four potyviruses in tuber-bearing potato species，and temperature-sensitive expression of hypersensitiveresistance to potato virus Y.Annals of Applied Biology，1997，130:91-104.

[11]

[12]Dellaporta，S.L.，Jonathan，W.，and Hicks，J.B.(1983).A PlantDNAminipreparation: version II.Plant Mol.Biol.Rep.1983.1:19–21。

<110> 华中农业大学

<120> 马铃薯A病毒极端抗性基因Ra连锁的Indel分子标记与应用

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 1

ATCGGGCTTAACAGACCGC

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）

<400> 2

GACTGACCTGCTCTTTTTGGC