一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用

摘要

本发明公开了一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用，所述引物对为RPB2‑F6和RPB2‑R6，引物退火温度为54~57℃，扩增目的片段约900个碱基对，扩增片段应用包括基于Genebank Blast比对的灵芝属真菌鉴定和灵芝分子系统发育学分析。本发明所述引物具有扩增灵芝属真菌的特异性，扩增率高，鉴定准确。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定灵芝属真菌的方法，具体为一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对及其应用。

背景技术

灵芝是中国名贵中药材，又称仙草、瑞草、万年茸等。灵芝在我国有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。灵芝富含灵芝多糖，三萜类，甾醇，氨基酸，蛋白质等600余种成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗辐射等功效，用于治疗癌症，糖尿病，高血压，失眠、厌食症、关节炎、哮喘、支气管炎、胃炎、高胆固醇、红斑狼疮等疾病。《中国药典》将灵芝和紫芝收录其中，认为灵芝是无毒，安全的食品。

灵芝属(

中国灵芝物种多样性丰富，不同的灵芝种类含有的药用成分各异。然而，灵芝种类的鉴定区分非常困难，原因一是灵芝在形态上极为相似，难以根据形态鉴定区分；二是以DNA条形码等分子手段鉴定必须要以高质量的DNA为前提，市售灵芝在保存过程中极易附带其它真菌或者被重寄生真菌污染。无论是栽培灵芝种类的鉴定还是解决市售灵芝种类混杂的问题，提出一个可靠、简便、快速有效的灵芝鉴定方法极为重要。

发明内容

本发明的目的是获得一种鉴定灵芝属真菌的有效方法，利用RPB2蛋白基因的一段DNA序列作为鉴定的条形码，本发明设计了一对扩增RPB2序列的引物，为灵芝属真菌的鉴定提供简便、可靠的方法。

技术方案：一种用于鉴定灵芝属真菌的引物，其特征在于所述引物对及其序列为：

RPB2-F6(RGARACGCAYAAGGAGTTYA)和RPB2-R6(CTRGCACARACWCCYAARAT)。

所述引物在灵芝属真菌鉴定中应用。

所述灵芝真菌鉴定需要主要仪器包括PCR仪，主要试剂包括引物、dNTP、MgSO

所述灵芝鉴定的步骤包括：

⑴ 提取灵芝属真菌的基因组。

⑶ 取PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检

本发明提供了一对扩增RPB2序列的引物，为灵芝属真菌的鉴定提供简便、可靠的方法。

附图说明

图1为实例PCR产物电泳结果；图2为实例鉴定结果。

其中图1M为DNA Maker 5000，1~3为实例PCR扩增灵芝RPB2基因片段电泳检测结果。

其中图2 Blast比对鉴定1~3号为

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种用于鉴定灵芝属真菌的引物对，所述引物对及其序列为：RPB2-F6(RGARACGCAYAAGGAGTTYA)和RPB2-R6(CTRGCACARACWCCYAARAT)。

所述引物在灵芝属真菌鉴定中应用。

所述灵芝真菌鉴定需要主要仪器包括PCR仪，主要试剂包括引物、dNTP、MgSO4、DNA聚合酶、反应缓冲液，主要软件工具包括Bioedit、MEGA。

所述灵芝鉴定的步骤包括：

（1）提取灵芝真菌的基因组。

（2）以步骤⑴提取的基因组为模板，以RPB2-F6和RPB2-R6为扩增引物，进行如下的反应体系配制和反应程序：

（3）取PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检。

（4）PCR产物直接生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

（5）获得序列文件使用Bioedit编辑去头和去尾。

（6） 编辑好的序列使用NCBI的Blast比对功能鉴定灵芝种类。

如图1所示，实例中的PCR产物电泳检测，条带明亮、清晰。

如图2所示，实例中的1~3号样本鉴定为