一种异色瓢虫体内ATP含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种异色瓢虫体内ATP含量的测定方法，属于物质检测技术领域。包括：1)对异色瓢虫成虫进行处理，得到试样组织，并检测组织中的ATP含量；2)利用步骤1)得到的试样组织获得异色瓢虫的组织浆液，并收集组织浆液的上清液，作为样品；3)配制ATP标准梯度溶液；4)分别设置空白孔、标准品孔和待测样本孔，将样品的稀释液、标准品、待测样本分别加入到对应的酶标板孔；5)每孔加入酶标抗体，振荡混匀，反应一段时间后再每孔加入TMB显色剂，进行显色；测定每孔的吸光度；6)根据ATP各浓度梯度标准液浓度测定得到的OD值，以ATP含量标准浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制ATP标准曲线；7)待测样本的ATP含量计算。

说明书

技术领域

本发明涉及物质检测技术领域，具体地说，涉及一种异色瓢虫体内ATP含量的测定方法。

背景技术

腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷)，化学式为C

ATP的元素组成为：C、H、O、N、P，分子简式A-P～P～P，式中的A表示腺苷，T表示三个(英文的triple的开头字母T)，P代表磷酸基团，“-”表示普通的磷酸键，“～”代表一种特殊的化学键，称为高能磷酸键(能量大于29.32kJ/mol的磷酸键称为高能磷酸键)。它有2个高能磷酸键，1个普通磷酸键。

ATP作为一种高能磷酸化合物，在细胞中，它能与ADP的相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应。生成ATP的途径主要有两条：一条是植物体内含有叶绿体的细胞，在光合作用的光反应阶段生成ATP；另一条是所有活细胞都能通过细胞呼吸生成ATP。

另外，ATP作为一种辅酶，有改善机体代谢的作用，可参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸、核苷酸等代谢过程。它同时又是体内能量的主要来源，为吸收、分泌、肌肉收缩以及进行生化合成反应等过程提供所需要的能量。常用于心肌病、肝炎、进行性肌萎缩、神经性耳聋等疾病的治疗。

同时，ATP是昆虫体能量代谢的重要产物和细胞代谢可利用能量的携带者，作为最重要的能量分子，其参与生物体内蛋白质、脂肪的生化合成、吸收等反应。并且在细胞的各种生理、病理过程中也起着关键的作用。通常，ATP含量的下降，会导致细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP含量的上调受高葡萄糖刺激。一般情况下，ATP含量的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时ATP含量的下降与线粒体的膜电位下降同时发生。

异色瓢虫Harmoniaaxyridis(Pallas)，属鞘翅目(Coleoptera)，瓢虫科(Coccinellidae)，是各种作物、蔬菜及牧草田蚜虫等害虫的重要捕食性天敌。因此在昆虫中被研究比较多。通过检测异色瓢虫体内的ATP含量可以研究昆虫的能量代谢情况。

ATP检测法的灵敏度和准确度受到很多因素的强烈影响，因此，要得到准确而又能重复。目前ATP含量检测的方法存在一些不足，比如实验操作时间长，精度低，操作繁琐，耗时长，所用组织量较高，选用适当的测定方法将对研究者和生产者起到事半功倍的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种异色瓢虫体内ATP含量的测定方法，可提高检测效率。

为了实现上述目的，本发明提供的异色瓢虫体内ATP含量的测定方法包括以下步骤：

1)对异色瓢虫成虫进行处理，得到试样组织，并检测组织中的ATP含量；

2)利用步骤1)得到的试样组织获得异色瓢虫的组织浆液，并收集组织浆液的上清液，作为样品；

3)配制ATP标准梯度溶液；

4)分别设置空白孔、标准品孔和待测样本孔，将样品的稀释液、标准品、待测样本分别加入到对应的酶标板孔；

5)每孔加入酶标抗体，振荡混匀，反应一段时间后再每孔加入TMB显色剂，进行显色；然后加入终止液终止反应；随后再测定每孔的吸光度；

6)根据ATP各浓度梯度标准液浓度测定得到的OD值，以ATP含量标准液浓度为横坐标，以标准OD值与空白OD值的差值为纵坐标绘制ATP浓度标准曲线并得到公式；

7)待测样本的ATP含量计算方式如下，

根据绘制的标准曲线公式，计算出待测样本OD值与空白OD值差值对应的横坐标ATP的浓度，待测样本ATP浓度＝曲线上对应ATP浓度×稀释倍数/待测样本蛋白浓度。

上述技术方案中，采用优化酶标法测定异色瓢虫ATP含量，提高检测效率。该方法可通过超声细胞破碎仪，选择合适的超声破碎条件，处理异色瓢虫细胞组织，然后利用酶标法，选择合适的展开剂和显色剂，定量定性检测出ATP含量。

其中，步骤1)中，将异色瓢虫成虫用生理盐水浸泡3～5min，涡旋清洗后剪掉硬翅、膜翅和头部，得到试样组织。

步骤2)中，称量试样组织10mg，生理盐水洗涤3次，加入90μL磷酸缓冲液研磨，随后用超声细胞破碎仪处理，破碎条件为100～500W，每个样品循环破碎30min，破碎期间每隔10min换水加冰，获得异色瓢虫的组织浆液。

步骤2)中，通过在4℃的环境下，3500r/min离心15min，得到上清液。

步骤3)中配制ATP标准梯度溶液包括：

制备浓度为100μg/mL ATP标准储备液；

制备浓度为1μg/mL ATP标准中间液；

制备浓度为10ng/mL ATP标准工作液；

制备浓度为0.0～0.8ng/mL的ATP梯度溶液。

步骤3)中，ATP标准液梯度浓度依次是0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ng/mL的ATP梯度标准液。

步骤1)中，通过所测定的异色瓢虫ATP含量超过1.0ng/mL时，将步骤2)中异色瓢虫样品提取进行稀释，再进行步骤3)；当异色瓢虫体ATP含量低于0.1ng/mL时，重新提取昆虫样品或增加昆虫样品质量。

步骤5)包括：

5-1)加酶标抗体，每孔加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，37℃避光环境中反应30min；然后加入洗涤液洗涤3次，拍干；

5-2)显色，每孔加入TMB显色剂100μL/孔，置于37℃避光显色15min

5-3)终止，每孔短时间内加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，终止反应；

5-4)测定，630nm波长测定每孔的吸光度，测定保证在加终止液15min以内进行。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

本发明减少了昆虫组织用量，一定程度上提高了ATP含量测定的效率；

本发明大幅度降低了因外界ATP的存在所导致的误差；

本发明为昆虫的大规模生产繁殖提供了相关技术；同时为制定增效物质营养指标提供科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例中ATP含量标准曲线图；

图2为本发明实施例中ATP含量的部分数据结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

实施例

参见图1，本实施例中供试昆虫为异色瓢虫雌性成虫，人工气候室条件为温度为(25±1)℃，相对湿度为(70±5)％，光周期为14L:10D的人工气候室。保持清洁干净，通风良好。取36只异色瓢虫，饲喂配制的人工饲料Diet1、Diet2和Diet3，饲喂48h后取样，作为待测样品。

异色瓢虫体内ATP含量的测定方法包括以下步骤：

S100，试样处理

将异色瓢虫雌性成虫用生理盐水浸泡3-5min，涡旋清洗后剪掉硬翅、膜翅和头部，检测剩下的组织中ATP的含量。

S200，制备胞浆ATP溶液

准确称取步骤S100中组织重量10mg，用生理盐水洗涤3次后加90μL的磷酸缓冲液研磨，制备10％的匀浆液，100～500W超声波破碎，每个样品循环破碎30min，破碎期间每隔10min换水加冰，获得异色瓢虫组织浆液。

S300，收集ATP溶液

收集步骤S200制得的异色瓢虫组织浆液的上清液，即4℃，涡旋混匀1min，3500r/min离心15min，上清液即为所制备的胞浆ATP溶液，上清液的获取应确保纯净，无杂质。

S400，配制ATP标准梯度溶液

制备浓度为100μg/mL ATP标准储备液；

制备浓度为1μg/mL ATP标准中间液；

制备浓度为10ng/mL ATP标准工作液；

制备浓度为0.0-0.8ng/mL的ATP梯度溶液；

S500，酶标法检测ATP

酶标仪预热30min以上，调节波长到630nm，蒸馏水调零。将经过步骤S300得到的胞浆ATP溶液，加入显色剂显色，再通过下述方法测得ATP的浓度：

加样，分别设置空白孔、标准品孔和待测样本孔，将50μL的样品稀释液(空白对照)、标准品、待测样品加入到对应的酶标板孔。

加酶标抗体，每孔加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，37℃避光环境中反应30min。然后加入洗涤液洗涤3次，拍干。

显色，每孔加入TMB显色剂100μL/孔，置于37℃避光显色15min。

终止，每孔短时间内加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，终止反应。

测定，630nm波长测定每孔的吸光度(OD值)，测定保证在加终止液15min以内进行。

S600，建立ATP测定标准曲线

根据ATP各浓度梯度标准液浓度测定得到的OD值，以ATP含量标准液浓度为横坐标，以标准OD值与空白OD值的差值为纵坐标绘制标准曲线并得到公式。其中ATP含量标准曲线如图1所示。

S700，ATP含量计算

根据绘制的标准曲线公式，计算出待测样本OD值与空白OD值差值对应的横坐标ATP的浓度。用蛋白试剂盒测定蛋白浓度，各昆虫样品的ATP含量通过下列公式计算：

待测样本ATP浓度＝曲线上对应ATP浓度×稀释倍数/待测样本蛋白浓度。

样本浓度超过线性范围时，用生理盐水将样本稀释，测定结果乘以稀释倍数。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的5％。

图2是本实施例中待测样品所测得的OD值，其中，列1～3与列4～6为3个点样重复，行A～D与行E～H为取样4个生物学重复。