一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法

摘要

本发明提出了一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法，包括步骤如下：固定，预处理，透明化处理，封闭液封闭，冻融和一抗孵育，二抗孵育，本发明采用冻融和超声波孵育，增加光学透明剂的渗透率和荧光蛋白兼容性，从而增加荧光图像的分辨率，实现大组织样本的渗透性，从而达到器官的整体免疫标记。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法。

背景技术

免疫荧光技术利用了抗原与抗体高度特异性结合的原理，将某种可测定的物质偶联到抗体或者抗原上，通过检测标记物的有无和含量，对样品中待检抗原或抗体进行定性、定位和定量检测。尤其近三十几年来，免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最快、应用最广的一项技术，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快和便于观察等优点。

针对荧光探针标记的生物组织进行光学成像时，目前已有的物理层析技术主要有两种：一种是光学层析技术，通过光学方法抑制焦面以外的荧光从而提高z向分辨率，光学层析技术的主要限制在于其z向分辨率较低，并且光学层析技术采用点扫描模式，对于多色荧光探针标记的生物组织，扫描时间较长；另一种是机械层析技术，通过将生物组织包埋在树脂中，通过物理切片的方式产生组织薄片，再对组织薄片进行宽场成像，物理层析技术的主要限制在于通过这种方法进行成像的过程中，组织薄片容易丢失，操作复杂，耗时较长，得到的图像，其后期处理及三维配准非常困难，无法用于大体积的生物组织。

荧光标记生物组织，具有如下的优势：发光效率高、稳定不易被淬灭、应用范围广并能够展示更多的神经精细结构。但是现有技术的物理层析技术存在光学透明剂的渗透率低，荧光蛋白兼容性差导致图像分辨率低不能显示组织完整的荧光图像。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种提高光学透明剂的渗透率，形成清晰完整的荧光图像的一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法，步骤如下：

S1，固定，将生物组织采用4％的PFA溶液固定，固定后采用PBS缓冲液清洗2-3次，每次1-2小时；

S2，预处理，固定处理后的生物组织采用体积分数为10％、30％、50％、70％、90％和100％的四氢呋喃溶液进行梯度脱水处理，每个浓度处理1-2小时；

S3，透明化处理，将预处理后的生物组织进行打孔处理，然后加入透明剂，在37℃的条件下，孵育1-2天；

S4，封闭液封闭，在透明化处理后的生物组织中加入封闭液，在37℃摇床浸泡条件下封闭8-12小时，封闭完成后，离心去液体，用PBS溶液清洗3-5次，每次2-3小时；

S5，冻融，封闭处理后的生物组织浸入冷冻保存液中，以0.1-0.5℃/分钟的速度下降至-70～-80℃，保持30分钟后，缓慢解冻至温度10-20℃；

S6，一抗孵育，在超声波反应器中加入用稀释液稀释300-500倍的一抗，然后在37℃、避光、超声波条件下孵育解冻后的生物组织10-15天，孵育结束后用稀释液清洗3-5次，每次8-10小时；

S7，二抗孵育，一抗孵育后，在超声波反应器中加入用稀释液稀释500-800倍的带有荧光染料分子的二抗，在37℃、避光、超声波条件下孵育生物组织5-7天，然后用稀释液清洗2-3次，每次8-10小时，获得荧光标记的生物组织。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3所述透明剂pH值为7.5-8.5，包括质量分数2％-3％的尿素、体积分数为20％-30％的DMSO、质量分数2％-5％的蔗糖、质量分数3％-5％的SDS、质量分数1％-3％的谷胱甘肽和质量分数0.02％-0.05％的叠氮化钠和PBS缓冲液。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S4所述封闭液为PBS缓冲液、tritonx-100和血清。

在以上技术方案的基础上，优选的，PBS缓冲液∶tritonx-100∶血清的体积比为100∶(3-5)∶(2-3)。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S5所述冷冻保存液为甘油和PBS缓冲液，甘油∶PBS缓冲液的体积比为(3-5)∶100。

步骤S6所述超声波的功率密度为0.1-5.0W/cm2。

步骤S6所述稀释液为PBS缓冲液和吐温20，PBS缓冲液∶吐温20的体积比为100∶(2-5)。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S6所述一抗是anti-mTOR、anti-β-ⅢTubulin、anti-NeuN、anti-Ⅱcollagen抗体中的一种。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S7所述二抗是能够与一抗特异性结合的免疫球蛋白，其携带荧光标记。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述生物组织预处理后还包括对生物组织中的骨组织进行脱钙处理。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述脱钙处理步骤为：生物组织经过脱水处理后，浸入0.01-0.1mol/L的EDTA-Na的溶液中5-8天，然后用PBS溶液2-3次，每次1-2小时。

在以上技术方案的基础上，优选的，生物组织为完整的脑组织、胚胎组织、肾脏组织、脊柱组织、肝脏组织、肠道组织和卵巢组织中的一种。

本发明的一种用于整体组织样本的精准免疫荧光标记方法相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明通过冻融增加细胞渗透性，再通过超声波促进抗体分子的渗透，有效解决光学透明剂的渗透率低，荧光蛋白兼容性差的问题。

(2)本发明标记的小鼠整体组织结构，荧光标记明亮，背景干净，神经元和血管清晰，表明本发明能实现对大尺度生物组织的标记。

(3)本发明经过冻融和超声波处理后，组织结构保持完整，不会发生组织细胞分裂松散和血管、神经元断裂的问题。

(4)本发明可标记完整的脑组织、胚胎组织、肾脏组织、脊柱组织、肝脏组织、肠道组织和卵巢组织。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例一1mm标记的小鼠整体胚胎图；

图2为本发明实施例一200μm标记的胚胎前肢(左)和下肢(右)局部图；

图3为本发明实施例一100μm标记的胚胎脊髓(左)和尾部(右)局部图；

图4为本发明实施例二1mm标记的小鼠整体脑血管图；

图5为本发明实施例二200μm标记的皮层(左)和海马区(右)血管图；

图6为本发明实施例三1mm标记的小鼠脑神经元完整的正面图(上)和侧面图(下)；

图7为本发明实施例三200μm标记的皮层(左)和海马区(右)神经元局部图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例一

样本收集：

S1，首先麻醉动物，选用腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠；

S2，向麻醉后的小鼠心脏依次灌注心脏PBS和4％PFA；

S3，灌注后解剖小鼠，分离小鼠胚胎组织；

S4，用4％PFA在4℃条件下固定胚胎组织，振荡过夜，随后在20-30℃条件下固定1h；

S5，室温下用PBS缓冲液清洗胚胎组织3次，每次30分钟，然后将胚胎组织置于含有PBS缓冲液中，4℃保存。

荧光标记方法如下：

透明剂：pH值为7.5，包括质量分数2％的尿素、体积分数为20％的DMSO、质量分数2％的蔗糖、质量分数3％的SDS、质量分数1％的谷胱甘肽和质量分数0.02％的叠氮化钠和PBS缓冲液。

封闭液：PBS缓冲液、tritonx-100和血清，PBS缓冲液∶tritonx-100∶血清的体积比为100∶3∶2。

冷冻保存液：甘油和PBS缓冲液，甘油∶PBS缓冲液的体积比为3∶100。

超声波的功率密度为0.1-5.0W/cm

稀释液：PBS缓冲液和吐温20，PBS缓冲液∶吐温20的体积比为100∶2。

一抗：anti-mTOR，二抗：能够与一抗特异性结合的免疫球蛋白，其携带荧光标记。

荧光标记步骤如下：

S1，固定，将生物组织采用4％的PFA溶液固定，固定后采用PBS缓冲液清洗2次，每次1小时；

S2，预处理，固定处理后的生物组织采用体积分数为10％、30％、50％、70％、90％和100％的四氢呋喃溶液进行梯度脱水处理，每个浓度处理1小时；生物组织经过脱水处理后，浸入0.01mol/L的EDTA-Na的溶液中5天，然后用PBS溶液2次，每次1小时。

S3，透明化处理，将预处理后的生物组织进行打孔处理，然后加入透明剂，在37℃的条件下，孵育1天；

S4，封闭液封闭，在透明化处理后的生物组织中加入封闭液，在37℃摇床浸泡条件下封闭8小时，封闭完成后，离心去液体，用PBS溶液清洗3次，每次2小时；

S5，冻融，封闭处理后的生物组织浸入冷冻保存液中，以0.1℃/分钟的速度下降至-70℃，保持30分钟后，缓慢解冻至温度10℃；

S6，一抗孵育，在超声波反应器中加入用稀释液稀释300倍的一抗，然后在37℃、避光、超声波条件下孵育解冻后的生物组织10天，孵育结束后用稀释液清洗3次，每次8小时；

S7，二抗孵育，一抗孵育后，在超声波反应器中加入用稀释液稀释500倍的带有荧光染料分子的二抗，在37℃、避光、超声波条件下孵育生物组织5天，然后用稀释液清洗2次，每次8小时，获得荧光标记的生物组织。

将荧光染色胚胎组织置入chamber中使用双光子共聚焦显微镜进行观察荧光染色情况，结果见图1-3。

图1-3所示，胚胎组织整体和局部部分的荧光兼容性好，信号清晰，透明剂的渗透率高，背景干净，图像分辨率高，经过冻融和超声波处理后，组织细胞依然保持完整，未发生破裂或断裂，表明本发明能实现对大尺度生物组织的标记。

实施例二

样本收集：

S1，首先麻醉动物，选用腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠；

S2，向麻醉后的小鼠心脏依次灌注心脏PBS和4％PFA；

S3，灌注后解剖小鼠，分离小鼠脑组织；

S4，用4％PFA在4℃条件下固定脑组织，振荡过夜，随后在20-30℃条件下固定1h；

S5，室温下用PBS缓冲液清洗脑组织3次，每次30分钟，然后将脑组织置于含有PBS缓冲液中，4℃保存。

荧光标记方法如下：

透明剂：pH值为8.5，包括质量分数3％的尿素、体积分数为30％的DMSO、质量分数5％的蔗糖、质量分数5％的SDS、质量分数3％的谷胱甘肽和质量分数0.05％的叠氮化钠和PBS缓冲液。

封闭液：PBS缓冲液、tritonx-100和血清，PBS缓冲液∶tritonx-100∶血清的体积比为100∶5∶3。

冷冻保存液：甘油和PBS缓冲液，甘油∶PBS缓冲液的体积比为5∶100。

超声波的功率密度为5.0W/cm

稀释液：PBS缓冲液和吐温20，PBS缓冲液∶吐温20的体积比为100∶5。

一抗是anti-β-ⅢTubulin，二抗是能够与一抗特异性结合的免疫球蛋白，其携带荧光标记。

荧光标记步骤如下：

S1，固定，将生物组织采用4％的PFA溶液固定，固定后采用PBS缓冲液清洗3次，每次2小时；

S2，预处理，固定处理后的生物组织采用体积分数为10％、30％、50％、70％、90％和100％的四氢呋喃溶液进行梯度脱水处理，每个浓度处理2h；生物组织经过脱水处理后，浸入0.1mol/L的EDTA-Na的溶液中8天，然后用PBS溶液3次，每次2小时。

S3，透明化处理，将预处理后的生物组织进行打孔处理，然后加入透明剂，在37℃的条件下，孵育2天；

S4，封闭液封闭，在透明化处理后的生物组织中加入封闭液，在37℃摇床浸泡条件下封闭12小时，封闭完成后，离心去液体，用PBS溶液清洗5次，每次3小时；

S5，冻融，封闭处理后的生物组织浸入冷冻保存液中，以0.5℃/分钟的速度下降至-80℃，保持30分钟后，缓慢解冻至温度20℃；

S6，一抗孵育，在超声波反应器中加入用稀释液稀释500倍的一抗，然后在37℃、避光、超声波条件下孵育解冻后的生物组织15天，孵育结束后用稀释液清洗5次，每次10小时；

S7，二抗孵育，一抗孵育后，在超声波反应器中加入用稀释液稀释800倍的带有荧光染料分子的二抗，在37℃、避光、超声波条件下孵育生物组织7天，然后用稀释液清洗3次，每次10小时，获得荧光标记的生物组织。

将荧光染色脑组织置入chamber中使用双光子共聚焦显微镜进行观察荧光染色情况，结果见图4-5。图4-5所示，脑组织整体和局部血管的的荧光兼容性好，背景干净，透明剂的渗透率高，图像分辨率高，标记明亮，皮层和海马区血管清晰，背景干净，经过冻融和超声波处理后，血管依然保持完整，未发生破裂和变形，表明本发明能实现对大尺度生物组织的标记。

实施例三

样本收集：

S1，首先麻醉动物，选用腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠；

S2，向麻醉后的小鼠心脏依次灌注心脏PBS和4％PFA；

S3，灌注后解剖小鼠，分离小鼠脑组织；

S4，用4％PFA在4℃条件下固定脑组织，振荡过夜，随后在20-30℃条件下固定1h；

S5，室温下用PBS缓冲液清洗脑组织3次，每次30分钟，然后将脑组织置于含有PBS缓冲液中，4℃保存。

荧光标记方法如下：

透明剂：pH值为8，包括质量分数2.5％的尿素、体积分数为25％的DMSO、质量分数3％的蔗糖、质量分数4％的SDS、质量分数2％的谷胱甘肽和质量分数0.03％的叠氮化钠和PBS缓冲液。

封闭液：PBS缓冲液、tritonx-100和血清，PBS缓冲液∶tritonx-100∶血清的体积比为100∶4∶2。

冷冻保存液：甘油和PBS缓冲液，甘油∶PBS缓冲液的体积比为4∶100。

超声波的功率密度为2.0W/cm

稀释液：PBS缓冲液和吐温20，PBS缓冲液∶吐温20的体积比为100∶3。

一抗是anti-NeuN，二抗是能够与一抗特异性结合的免疫球蛋白，其携带荧光标记。

荧光标记步骤如下：

S1，固定，将生物组织采用4％的PFA溶液固定，固定后采用PBS缓冲液清洗2次，每次1.5小时；

S2，预处理，固定处理后的生物组织采用体积分数为10％、30％、50％、70％、90％和100％的四氢呋喃溶液进行梯度脱水处理，每个浓度处理1.5小时；生物组织经过脱水处理后，浸入0.07mol/L的EDTA-Na的溶液中7天，然后用PBS溶液2次，每次1.5小时。

S3，透明化处理，将预处理后的生物组织进行打孔处理，然后加入透明剂，在37℃的条件下，孵育1.5天；

S4，封闭液封闭，在透明化处理后的生物组织中加入封闭液，在37℃摇床浸泡条件下封闭10小时，封闭完成后，离心去液体，用PBS溶液清洗4次，每次2.5小时；

S5，冻融，封闭处理后的生物组织浸入冷冻保存液中，以0.3℃/分钟的速度下降至-75℃，保持30分钟后，缓慢解冻至温度15℃；

S6，一抗孵育，在超声波反应器中加入用稀释液稀释400倍的一抗，然后在37℃、避光、超声波条件下孵育解冻后的生物组织13天，孵育结束后用稀释液清洗4次，每次8小时；

S7，二抗孵育，一抗孵育后，在超声波反应器中加入用稀释液稀释700倍的带有荧光染料分子的二抗，在37℃、避光、超声波条件下孵育生物组织6天，然后用稀释液清洗2次，每次9小时，获得荧光标记的生物组织。

将荧光染色脑组织置入chamber中使用双光子共聚焦显微镜进行观察荧光染色情况，结果见图6-7。图6-7所示，脑组织整体和局部神经元结构部分的荧光兼容性好，荧光标记明亮，透明剂的渗透率高，皮层和海马区神经元形态饱满，纤维突出清晰，背景干净，经过冻融和超声波处理后，神经元依然保持完整，未发生断裂，表明本发明能实现对大尺度生物组织的标记。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。