共培养装置及共培养方法

摘要

本发明的共培养装置具备:第1主体部，具有第1薄膜、第1流路与第2流路，所述第1薄膜包含用于培养细胞的第1主面以及与第1主面为相反侧的第2主面，所述第1流路的一部分由第1主面划分且供第1培养基流动，第2流路的一部分由第2主面划分且供溶解氧浓度比第1培养基高的第2培养基流动；氧浓度调整部，用于调整供给至第1流路的第1培养基的溶解氧浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种共培养装置及共培养方法。

背景技术

以调查药物动态、药物代谢等为目的而模拟了肠内环境等的器件的开发正日益推进。在国际公开第2018/079793号中，公开了在厌氧腔内配置将肠管上皮细胞播种在多孔质膜上的器件，模拟肠内环境的系统。

发明内容

然而，在调查药物动态、药物代谢等的基础上发现，例如即使在小肠内也有靠近大肠的一侧和远离大肠的一侧的氧浓度也不同。在包括国际公开第2018/079793号的现有技术中，没有设想到通过1个系统来模拟氧浓度不同的环境。

本发明提供一种可以模拟氧浓度不同的环境的共培养装置及共培养方法。

本发明的共培养装置具备:第1主体部，具有第1薄膜、第1流路和第2流路，所述第1薄膜包含用于培养细胞的第1主面及与第1主面为相反侧的第2主面，所述第1流路的一部分由第1主面划分且供第1培养基流动，所述第2流路的一部分由第2主面划分且供溶解氧浓度比第1培养基高的第2培养基流动；氧浓度调整部，用于调整供给至第1流路的第1培养基的溶解氧浓度。

本发明的共培养方法具备：调整第1培养基的溶解氧浓度的工序；使调整了溶解氧浓度后的第1培养基在一部分由培养有细胞的第1薄膜的第1主面划分的第1流路中流动的工序；使溶解氧浓度比第1培养基高的第2培养基在一部分由位于第1主面的相反侧的第1薄膜的第2主面划分的第2流路流动，并且从第2培养基经由第1薄膜向第1流路侧供给氧的工序。

根据与附图相关联地进行理解的、与该发明有关的以下详细内容，来明确该发明的上述内容以及其他的目的、特征、方案以及优点。

附图说明

图1是共培养装置100的示意性的剖视图。

图2是第1主体部10的分解立体图。

图3是第1实施方式的共培养方法的工序图。

图4是共培养装置200的示意性的剖视图。

具体实施方式

参考附图对实施方式的详细内容进行说明。在以下的图中，对相同或者等同的部分赋予相同的参照附图标记，不再反复重复的说明。

(第1实施方式)

下面，对第1实施方式的共培养装置(以下，称作“共培养装置100”)的构成进行说明。

图1是共培养装置100的示意性的剖视图。如图1所示，共培养装置100具有第1主体部10和氧浓度调整部20。

第1主体部10在其内部具有第1流路11、第2流路12和第1薄膜13。第1培养基在第1流路11中流动。第2培养基在第2流路12中流动。

第1薄膜13具有第1主面13a和第2主面13b。在第1主面13a中培养有细胞。该细胞例如是在第1主面13a中形成紧密连接(tight junction)的肠管上皮细胞。该细胞的具体例为Caco-2细胞。第1薄膜13例如是聚碳酸酯制的径迹蚀刻膜。第1薄膜13例如也可以是胶原vitrigel膜。第1薄膜13可在第1主面13a中培养细胞，且只要是使氧透过的薄膜就没有特别限定。第2主面13b在第1主面13a的相反侧。

第1流路11的一部分由第1主面13a划分。第2流路12的一部分由第2主面13b划分。

第1培养基也可以包含菌。第1培养基中包含的菌例如是大肠菌等肠内菌。但是，第1培养基中包含的菌并不限于此。第1培养基可以包含菌以外的成分来代替菌，也可以同时包含菌和菌以外的成分。第2培养基的溶解氧浓度比第1培养基的溶解氧浓度高。

图2是第1主体部10的分解立体图。如图2所示，第1主体部10例如由第1片材14a以及第2片材14b、第1玻璃板15a以及第2玻璃板15b、第1薄膜13构成。

第1片材14a以及第2片材14b互相贴合。在第1片材14a形成有槽14aa和孔14ab。槽14aa形成在第1片材14a的与贴合至第2片材14b的面为相反侧的面。孔14ab在厚度方向上贯通第1片材14a。槽14aa与孔14ab连接。

在第2片材14b形成有槽14ba和孔14bb。槽14ba形成在第2片材14b的与贴合至第1片材14的面为相反侧的面。孔14bb在厚度方向上贯通第2片材14b。孔14bb形成在与孔14ab重叠的位置。槽14ba与孔14bb连接。第1薄膜13被第1片材14a和第2片材14b夹住。

互相贴合的第1片材14a以及第2片材14b由第1玻璃板15a以及第2玻璃板15b夹住。第1玻璃板15a贴合在第1片材14a的与贴合至第2片材14b的面为相反侧的面。第2玻璃板15b贴合至第2片材14b的与贴合至第1片材14a的面为相反侧的面。

第1片材14a和第2片材14b的贴合、第1片材14a和第1玻璃板15a的贴合以及第2片材14b和第2玻璃板15b的贴合例如通过在表面由氧等离子体活性化的状态下压接来进行。

由第1薄膜13、槽14aa、孔14ab以及第1玻璃板15a划分出的空间成为第1流路，由第1薄膜13、槽14ba、孔14bb以及第2玻璃板15b划分出的空间成为第2流路12。

在第1玻璃板15a形成有在厚度方向上贯通第1玻璃板15a从而与第1流路11连通的孔15aa以及孔15ab。孔15aa成为第1流路11的入口。孔15ab成为第1流路11的出口。在第2玻璃板15b形成有在厚度方向上贯通第2玻璃板15b而与第2流路12连通的孔15ba以及孔15bb。孔15ba成为第2流路12的入口。孔15bb成为第2流路12的出口。

第1片材14a以及第2片材14b由透气性较低的材料形成。第1片材14a以及第2片材14b例如由硅橡胶形成。由于第1玻璃板15a以及第2玻璃板15b的透气性也较低，所以氧难以从第1主体部10的外部侵入至第1流路11内以及第2流路12内。

如图1所示，第1主体部10也可以进一步具有电极16a以及电极16b。电极16a形成在第1玻璃板15a，电极16b形成在第2玻璃板15b。电极16a以及电极16b例如由白金(Pt)形成。电极16a以及电极16b的形成例如能够通过溅射进行。

通过对电极16a以及电极16b施加电压，能够测量第1流路11和第2流路12之间的电阻值。在第1主面13a中培养的细胞形成紧密连接的情况下，该电阻值变大；在不形成紧密连接的情况下，该电阻值变小。因此，通过测量该电阻值，能够判定在第1主面13a中培养的细胞是否形成紧密连接(是否对细胞产生损伤)。另外，该电阻值的测量例如能够通过四端子法进行。

氧浓度调整部20例如是第2主体部30。第2主体部30和第1主体部10成为同样的构成。即，第2主体部30具有第3流路31、第4流路32和第2薄膜33。

第1培养基在第3流路31中流动。第3培养基在第4流路32中流动。第3培养基的溶解氧浓度比第1培养基的溶解氧浓度高。第3培养基例如是和第2培养基相同的培养基。

第2薄膜33具有第3主面33a和第4主面33b。在第3主面33a培养有细胞。第3主面33a中培养的细胞可以和在第1主面13a中培养的细胞相同，也可以和在第1主面13a中培养的细胞不同。第2薄膜33只要是可在第3主面33a中培养细胞，且使氧透过的薄膜即可。第2薄膜33可以是和第1薄膜13相同的膜，也可以是和第1薄膜13不同的膜。

第3流路31的一部分由第3主面33a划分。第4流路32的一部分由第4主面33b划分。

第2主体部30也可以进一步具有用于测量第3流路31和第4流路32之间的电阻值的电极36a以及电极36b。

共培养装置100进一步具有三通连接器40、管41a～管41h、泵42、泵43a及泵43b、氧传感器44a及氧传感器44b。

三通连接器40具有第1连接口40a、第2连接口40b、第3连接口40c。虽未图示，但在第3连接口40c处连接有隔膜(septum)。管41a～管41h由透气性较低的材料形成。管41a～管41h例如由PEEK(聚醚醚酮)树脂形成。泵42、泵43a及泵43b例如是注射泵。

管41a与第3流路31的入口连接。管41b与第3流路31的出口和第1连接口40a连接。管41c与第2连接口40b和第1流路11的入口连接。管41d与第1流路11的出口连接。

管41e与第4流路32的入口连接。管41f与第4流路32的出口连接。管41g与第2流路12的入口连接。管41h与第2流路12的出口连接。氧传感器44a及氧传感器44b分别安装在管41b及管41d。由此来监控流经第3流路31及第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度。

通过驱动泵42，第1培养基通过管41a而被供给至第3流路31。在第1培养基在第3流路31中流动的期间，第1培养基中包含的氧被第1培养基中的菌及在第3主面33a中培养的细胞消耗。因此，第1培养基的溶解氧浓度由于通过第3流路31而降低。

在流经第3流路31的第1培养基经由管41b从第1连接口40a流入三通连接器40a，并且从第2连接口40b流出。从第2连接口40b流出的第1培养基经由管41c被供给至第1流路11。因此，可利用第2主体部30(氧浓度调整部20)调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度。流经第3流路31的第1培养基的一部分也可以被隔膜采集。流经第3流路31的第1培养基也可以在被供给至第1流路11之前从隔膜加入菌。

通过驱动泵43a，第2培养基通过管41e被供给至第4流路32。通过驱动泵43b，而通过管41g被供给至第2流路12。

在第2培养基通过第2流路12期间，第2培养基中的氧经由第1薄膜13被供给至在第1主面13a中培养的细胞。在第3培养基通过第4流路32期间，第3培养基中的氧经由第2薄膜33被供给至在第3主面33a中培养的细胞。因此，与第1培养基的溶解氧浓度无关地使在第1主面13a中培养的细胞得以维持，与第3培养基的溶解氧浓度无关地使第3主面33a中培养的细胞得以维持。

共培养装置100也可以进一步具有容器50、加热器51、脱气装置52。在容器50贮存有液体。该液体例如是电子氟化液Fluorinert(注册商标)。在该液体中含浸有第1主体部10以及第2主体部30。

加热器51通过对容器50所贮存的液体进行加热，来保持在容器50所贮存的液体的温度。脱气装置52脱出贮存在容器50的液体中包含的氧。

脱气装置52例如具有腔、配置在腔的内部的管、第1泵以及第2泵。通过驱动第1泵，贮存在容器50的液体在容器50与脱气装置52间循环。贮存在容器50的液体在循环时通过管。通过驱动第2泵，腔的内部成为真空状态。管由透气性的材料形成。由此，贮存在容器50的液体在通过管时被脱气。

在上述的例子中，对第1主体部10的个数为1的情况进行说明，但是第1主体部10的个数也可以是2个以上。在第1主体部10的个数是2个以上的情况下，与第2主体部30连接的第1主体部10以外的第1主体部10串联连接。与某个第1主体部10的上游侧连接的另一个第1主体部10作为对于与该另一个第1主体部10的下游侧连接的第1主体部10而言的氧浓度调整部20发挥作用。

下面，对第1实施方式的共培养方法进行说明。

图3是第1实施方式的共培养方法的工序图。如图3所示，第1实施方式的共培养方法具有氧浓度调整工序S1和培养基处理工序S2。第1实施方式的共培养方法可以进一步具有培养基采集工序S3a和培养基分析工序S4。第1实施方式的共培养方法也可以具有菌添加工序S3b来代替培养基采集工序S3a。

在氧浓度调整工序S1中，进行供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度的调整。更具体而言，氧浓度调整工序S1通过使第1培养基在第3流路31流动，并且使第3培养基在第4流路32流动来进行。由于在第1培养基流经第3流路31时，第1培养基中的菌以及第3主面33a中培养的细胞消耗氧，因此可调整流过第3流路31的第1培养基(即，供给至第1流路11的第1培养基)的溶解氧浓度。在氧浓度调整工序S1中，在第3培养基流经第4流路32时，第3培养基中的氧经由第2薄膜33被供给至第3流路31侧。流过第4流路32的第3培养基被供给至培养基分析工序S4。

在培养基处理工序S2中，进行对被供给至第1流路11的第1培养基以及被供给至第2流路12的第2培养基的处理。更具体而言，培养基处理工序S2通过使第1培养基在第1流路11流动，并且使第2培养基在第2流路12流动来进行。在培养基处理工序S2中，在第2培养基流经第2流路12时，第2培养基中的氧经由第1薄膜13被供给至第1流路11侧。流过第1流路11的第1培养基被供给至培养基分析工序S4。

在培养基采集工序S3a中，流过第3流路31的第1培养基的一部分在被供给至第1流路11之前被采集。该采集通过与三通连接器40的第3连接口40c连接的隔膜来进行。在培养基采集工序S3a中采集到的第1培养基的一部分被供给至培养基分析工序S4。

在菌添加工序S3b中，能够在流过第3流路31的第1培养基被供给至第1流路11前对流过第3流路31的第1培养基加入菌。在菌添加工序S3b中添加的菌可以与流经第3流路31的第1培养基所包含的菌相同，也可以与流经第3流路31的第1培养基所包含的菌不同。

在培养基分析工序S4中，对流过第1流路11的第1培养基、流过第2流路12的第2培养基以及流过第4流路32的第3培养基进行质量分析。该质量分析例如通过液体色谱质量分析法进行。也可以在该质量分析之前，对流过第1流路11的第1培养基、流过第2流路12的第2培养基以及流过第4流路32的第3培养基进行所期望的前处理。

另外，只要对流过第1流路11的第1培养基、流过第2流路12的第2培养基以及流过第4流路32的第3培养基中的至少任一个进行培养基分析工序S4即可。也可以对在培养基采集工序S3a中采集到的第1培养基进行培养基分析工序S4。

以下，对共培养装置100以及第1实施方式的共培养方法的效果进行说明。

在共培养装置100中，能够通过氧浓度调整部20(第2主体部30)，调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度。因此，根据共培养装置100，能够以从小肠朝向大肠的状况的方式模拟氧浓度不同的环境。

在共培养装置100中，在第1主体部10以及第2主体部30浸渍于贮存在容器50的液体中的情况下，能够抑制氧混入在共培养装置100内部流动的培养基中。在共培养装置100具有脱气装置52的情况下，能够进一步抑制氧混入在共培养装置100内部流动的培养基中。在共培养装置100具有加热器51的情况下，能够抑制共培养装置100的外部的温度对共培养装置100中的培养基处理造成影响。

在共培养装置100具有三通连接器40的情况下，由于可将菌加入流过第3流路31的第1培养基中，因此可模拟不仅氧的浓度不同，而且菌的种类以及/或者菌的存在量也不同的环境。此外，在共培养装置100具有三通连接器40的情况下，由于能够将流过第3流路31的第1培养基的一部分在供给至第1流路11之前进行采集，从而可监控逐渐变化的环境的中途过程。

在第1主面13a中培养的细胞的状态(紧密连接是否被损坏等)体现在第1流路11和第2流路12之间的电阻值的变化中，因此在第1主体部10具有电极16a以及电极16b的情况下，能够监控第1主面13a中培养的细胞的状态。

由于根据第1实施方式的共培养方法，能够调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度，因此能够模拟氧浓度不同的环境。

在第1实施方式的共培养方法中，在流过第3流路31的第1培养基的一部分在供给至第1流路11之前被采集的情况下，可监控逐渐变化的环境的中途过程。在第1实施方式的处理方法中，在流过第3流路31的第1培养基被供给至第1流路11前对流过第3流路31的第1培养基加入菌的情况下，可模拟不仅氧的浓度不同，而且菌的种类以及/或者菌的存在量也不同的环境。

在第1实施方式的共培养方法中，在对流过第1流路11的第1培养基、流过第2流路的第2培养基、流过第3流路的第1培养基以及流过第4流路的第3培养基进行质量分析的情况下，例如能够对第1培养基所包含的菌的活动状况、来自第1培养基所包含的菌的代谢物的被细胞吸收等进行分析。

(第2实施方式)

下面，对第2实施方式的共培养装置(以下，称作“共培养装置200”)的构成进行说明。在此，主要对与共培养装置100的构成不同的方面进行说明，不再反复进行重复的说明。

图4是共培养装置200的示意性的剖视图。如图4所示，共培养装置200具有第1主体部10和氧浓度调整部20。在共培养装置200中，能够通过氧浓度调整部20调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度。关于这些方面，共培养装置200的构成和共培养装置100的构成是共通的。

但是，共培养装置200关于氧浓度调整部20的构成和共培养装置100的构成是不同的。在共培养装置200中，氧浓度调整部20是气体交换器60以及脱气装置70。在共培养装置200中，氧浓度调整部20也可以仅由气体交换器60构成或者仅由脱气装置70构成。

气体交换器60例如具有管61和腔62。管61的出口连接于与第1流路11连接的管41i。管61由透气性较高的材料形成。管61配置在腔62的内部。管61的入口连接于管41j。通过驱动泵42，第1培养基通过管41j在管61中流动。

腔62具有气体入口62a和气体出口62b。气体入口62a以及气体出口62b与腔62的内部连通。将气氛气体从气体入口62a供给至腔62的内部。该气氛气体是不包含氧的气体。例如是由5体积％的二氧化碳和构成剩余部分的氮构成的气体。

从气体入口62a供给至腔62的内部的气氛气体与流过管61的第1培养基之间进行气体交换。由此，流经管61的第1培养基的溶解氧浓度降低。其结果为，向第1流路11供给调整了溶解氧浓度的第1培养基。与流经管61的第1培养基之间进行气体交换的气氛气体通过气体出口62b从腔62的内部排出。

脱气装置70例如具有管71、腔72、泵73。管71由透气性较高的材料形成。管71的出口与管41j连接。管71的入口与管41k连接。通过驱动泵42，第1培养基通过管41k被供给至管71。管71配置在腔72的内部。

通过驱动泵73，腔72的内部成为真空状态。因此，流经管71的第1培养基中的氧通过管71向腔72中放出，流经管71的第1培养基被脱气。通过该脱气，也能够调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度。

另外，管41i、管41j以及管41k由透气性较低的材料(例如，PEEK树脂)形成。

在上述的例子中，对第1主体部10的个数为1的情况进行说明，但是第1主体部10的个数也可以是2个以上。在第1主体部10的个数是2个以上的情况下，与第2主体部30连接的第1主体部10以外的第1主体部10串联连接。与某个在第1主体部10的上游侧连接的另一个第1主体部10作为对于与该另一个第1主体部10的下游侧连接的第1主体部10而言的氧浓度调整部20发挥作用。

以下，对第2实施方式的共培养方法进行说明。在此，主要对与第1实施方式的共培养方法不同的方面进行说明，所以不再反复进行重复的说明。

第2实施方式的共培养方法与第1实施方式的共培养方法同样地，具有氧浓度调整工序S1、培养基处理工序S2和培养基分析工序S4。但是，第2实施方式的共培养方法是通过氧浓度调整工序S1对供给至第1流路11的第1培养基的气体交换来进行的这一方面，和第1实施方式的氧浓度调整工序S1不同。第2实施方式的共培养方法的氧浓度调整工序S1也可以通过对供给至第1流路11的第1培养基的脱气来进行。

以下，对共培养装置200以及第2实施方式的共培养方法的效果进行说明。在此，主要对的效果与共培养装置200以及第1实施方式的共培养方法不同的点进行说明，所以不再反复重复的说明。

在共培养装置200中，能够通过作为氧浓度调整部20的气体交换器60以及/或者脱气装置70，调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度。因此，根据共培养装置200，能够以从小肠朝向大肠的状况的方式模拟氧浓度的不同环境。

由于根据第2实施方式的共培养方法与第1实施方式的共培养方法同样地可调整供给至第1流路11的第1培养基的溶解氧浓度，因此能够模拟氧浓度不同的环境。

虽然如上所述对本发明的实施方式进行了说明，但是上述的实施方式可以进行各种变形。此外，本发明的范围不限定于上述的实施方式。本发明的范围并由专利的权利要求书示出，还包括与专利的权利要求书等同的意思和范围内的所有变更。

虽然对本发明的实施方式进行说明，但应认为在此公开的实施方式在所有方面均为例示而并非限制性的内容。本发明的范围由权利要求书示出，还包括与权利要求书等同的意思和范围内的所有变更。