β-咔啉生物碱GAK在制备治疗和/或预防肺纤维化的产品中的用途

摘要

本发明公开了β‑咔啉生物碱GAK在制备治疗和/或预防肺纤维化的产品中的用途，本发明探究了β‑咔啉生物碱GAK治疗肺纤维化的生物活性，验证了其对PF小鼠的体重、存活率、肺指数、组织病理变化具有较好的改善作用，并呈剂量依赖性。Masson染色以及羟脯氨酸含量测定结果表明GAK可明显抑制肺组织的胶原沉积；免疫荧光染色结果表明，GAK给药组小鼠肺组织中上皮细胞标志蛋白E‑Cadherin明显升高，而肺组织中间质细胞标志蛋白α‑SMA明显降低，表明GAK对纤维化阶段的EMT过程具有明显的抑制作用。以上结果表明GAK在动物体内具有抗PF活性，为治疗肺纤维化天然产物药物的研发提供理论依据，有望用于肺纤维化的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及β-咔啉生物碱GAK的医药应用领域，特别是涉及β-咔啉生物碱GAK在制备治疗和/或预防肺纤维化的产品中的用途。

背景技术

甘肃蚤缀，又称甘肃雪灵芝，产于西藏东南部、青海、四川西北部、甘肃西部，生于海拔4000～5000米的高山草甸和砾石流带，是传统的藏药。

传统藏药对于天然产物药物的开发具有重要意义，甘肃蚤缀主要含有多种生活活性成分，如β-咔波啉生物碱、甾体化合物、三萜类化合物、黄酮类化合物、氨基酸、硬脂酸、a-海藻糖等。但由于缺乏合适的色谱纯化方法，关于甘肃蚤缀的具体化学成分的相关报道较少，各成分的具体应用开发更是非常有限。

β-咔啉生物碱GAK，是从甘肃蚤缀中提取得到的生物碱活性成分，结构如下：

研究表明，β-咔啉生物碱GAK具有抗氧化活性，除此之外，目前还未有对GAK其它生物活性的应用研究，有待进一步探究。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供β-咔啉生物碱GAK的一种新应用，能够制备治疗和/或预防肺纤维化的产品。

肺纤维化(PF)是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)，是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病。

肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。特发性肺纤维化发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一种“类肿瘤疾病”。

目前临床治疗肺纤维化主要应用吡非尼酮、尼达尼布等药物治疗，并结合氧疗、机械通气、肺康复等非药物手段辅助治疗，但吡非尼酮和尼达尼布价格昂贵，普通患者难以承受长期服用的费用。因此，开发一种高效安全、成本更低的治疗肺纤维化的新药具有重大意义。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

本发明提供β-咔啉生物碱GAK在制备治疗和/或预防肺纤维化的产品中的用途。

进一步地，所述产品是降低肺组织羟脯氨酸含量的产品。

进一步地，所述产品是抑制肺组织胶原沉积的产品。

进一步地，所述产品是抑制上皮间质转化的产品。

上皮间质转化(EMT)，是指上皮到间质细胞的转化，它赋予细胞转移和入侵的能力，包括干细胞特征、减少凋亡与衰老，和促进免疫抑制，不仅在发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。

进一步地，所述产品是提高上皮细胞标志蛋白E-Cadherin表达的产品。

进一步地，所述产品是降低中间质细胞标志蛋白α-SMA表达的产品。

本发明还提供了β-咔啉生物碱GAK在制备降低肺组织羟脯氨酸含量的产品中的用途。

本发明还提供了β-咔啉生物碱GAK在制备抑制肺组织胶原沉积的产品中的用途。

本发明还提供了β-咔啉生物碱GAK在制备抑制上皮间质转化的产品中的用途。

本发明还提供了β-咔啉生物碱GAK在制备提高上皮细胞标志蛋白E-Cadherin表达，和/或，降低中间质细胞标志蛋白α-SMA表达的产品中的用途。

本发明中，所述产品包括但不限于食品、药品、保健品等。

本发明的有益效果是：本发明探究了β-咔啉生物碱GAK治疗肺纤维化的生物活性，验证了其对PF小鼠的体重、存活率、肺指数、组织病理变化具有较好的改善作用，并呈剂量依赖性。Masson染色以及羟脯氨酸含量测定结果表明GAK可明显抑制肺组织的胶原沉积；免疫荧光染色结果表明，GAK给药组小鼠肺组织中上皮细胞标志蛋白E-Cadherin明显升高，而肺组织中间质细胞标志蛋白α-SMA明显降低，表明GAK对纤维化阶段的EMT过程具有明显的抑制作用。以上结果表明GAK在动物体内具有抗PF活性，为治疗肺纤维化天然产物药物的研发提供理论依据，有望用于肺纤维化的治疗。

附图说明

图1是GAK对PF小鼠的影响(低中高剂量分别记为GAKL、GAKM和GAKH；剂量分别为25、50和70mg/kg/day)；(A)是不同剂量的GAK对PF小鼠的体重的影响；(B)是不同剂量的GAK对PF小鼠的存活率影响；(C)是不同剂量的GAK对PF小鼠病理组织的影响；(D)是不同剂量的GAK对PF小鼠肺指数的影响；(E)是不同剂量的GAK对PF小鼠胶原沉积(蓝染)的影响；(F)是不同剂量的GAK对PF小鼠羟脯氨酸(胶原蛋白的主要成分，用于间接检测胶原蛋白沉积情况)含量的影响；(G、H、I、J)是不同剂量的GAK对PF小鼠上皮-间质转化过程的标志蛋白表达影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.实验方法

(1)实验动物、建立PF小鼠模型和实验分组

清洁级健康C57BL/6小鼠，80只，雄性和雌性数量各半，8～10周龄，体重20～24g。饲养环境适宜，通风良好，安静，保持12h昼夜节律，温度为25±2℃，湿度为45％～60％，雌雄分养，每隔2天换一次垫料，自由饮水，每日颗粒饲料喂养，自由饮食。实验动物适应一周后按照体重随机分组进行实验。所有小鼠在试验前饥饿处理12h，实验操作均在10:00am到4:00pm之间进行。

采用气管滴入博来霉素溶液的方法建立小鼠PF模型，小鼠用10％水合氯醛麻醉固定后，沿颈正中切开1cm，钝性分离至气管，用注射器经气管软骨环间隙向气管内缓慢注入博来霉素(5mg/kg，约100μL)，空白对照组向气管内缓慢注入等体积生理盐水溶液(假手术组)，缝合切口并将每只小鼠直立进行左右缓慢晃动数秒确保小鼠左右肺内药液均匀分布。

造模一周后，随机选取10只小鼠(雌雄各半)，麻醉后脱颈处死，摘取肺组织，制作切片并观察病理情况来确定模型是否成功。模型建成后小鼠重新做如下分组(每组10只，雌雄各半)：空白对照组、模型组、GAK低剂量组(简称GAKL组)：25mg/kg/day、GAK中剂量组(简称GAKM组)：50mg/kg/day、GAK高剂量组(简称GAKH组)：70mg/kg/day，分组完成后当天开始对阳性药组和GAK组采用灌胃方式分别给药(药物用CMC-Na水溶液制备为混悬液)，空白对照组和模型组灌胃等量CMC-Na水溶液，持续2周。其中，实验药物GAK由本实验室纯化制备得到，纯度≥98％。

(2)GAK对博来霉素致PF小鼠羟脯氨酸的影响

小鼠经10％水合氯醛麻醉后，称重，取血后，将小鼠平放于鼠板之上，用75％的酒精轻轻擦拭胸部和腹部的皮肤，用剪刀依次将腹部和颈部剪开，分离出肺组织，用PBS将肺组织表面血迹洗净，准确称量各组小鼠60mg左肺组织，按照重量体积比1：9加入预冷的生理盐水(即称取60mg肺组织加入0.54mL的生理盐水)，然后在冰水中进行手动机械匀浆，将制成的10％肺组织匀浆液转移至离心管中备用；取0.25mL待测样本，向其中加入0.05mL消化液，混匀后置于37℃水浴锅内孵育3小时，除了检测组以外，还需要将空白组和标准组同时置于37℃水浴锅内孵育3小时，各组待测液过滤，滤液通过商业试剂盒定量检测羟脯氨酸的含量，用羟脯氨酸含量间接代表肺组织中胶原沉积含量。

(3)采集肺组织进行HE和Masson染色，观察GAK对肺组织肺泡炎症及PF程度的影响

小鼠经10％水合氯醛麻醉后，称重，取血后，将小鼠平放于鼠板之上，用75％的酒精轻轻擦拭胸部和腹部的皮肤，用剪刀依次将腹部和颈部剪开，分离出肺组织，用PBS将肺组织表面血迹洗净，将右肺放在4％多聚甲醛中固定。大约24h之后取出肺组织进行梯度酒精脱水，脱水完成后，浸入OCT中放入-20℃冰箱中预冻10min，然后放入冷冻切片机冻台上深入冷冻(-40℃)15min，切片(5μm)，捞片，然后按照试剂盒操作规程分别进行HE和Masson染色。镜下观察过程采用从低倍镜到高倍镜，从整体到局部，从宏观到微观的方法。并参照Szapiel的分级标准判定肺泡炎和PF的程度(表1)。

表1 Szapiel法肺泡炎症和PF分级及积分标准

(4)免疫荧光方法检测GAK对PF相关标志蛋白表达的影响

将(3)中所得切片滴加pH＝6.0的枸橼酸盐缓冲液至浸没肺组织，加热到98℃，持续5min进行抗原修复。待冷却到室温之后，用PBS反复冲洗三次，每次约5min。加入3％的过氧化氢，用以阻断内源性的过氧化物酶，在室温下阻断15min。用PBS冲洗三次，每次5min。滴加5％BSA进行封闭，室温下孵育30min。弃去封闭液，各组组织切片分别加入一抗(1：50稀释)后，4℃孵育过夜，PBS冲洗三次，每次5min，室温孵育FITC标记的二抗(1：200稀释)3h，DAPI染色3min，PBS冲洗三次，每次5min，然后经过梯度酒精脱水后二甲苯透化，封片后镜检。荧光显微镜拍摄时均采用统一曝光时间。蛋白相对表达量采用Image J软件进行定量分析。检测蛋白包括E-cadherin和α-SMA。

2.实验结果

通过博来霉素诱导的C57BL/6小鼠PF模型初步检测GAK在动物体内的抗PF活性，通过对GAK的毒性进行评价之后，分别设置3个剂量浓度，依次为25、50和70mg/kg/day(以上剂量均为无毒剂量)，连续灌胃给药15天。结果表明(如图1所示)，GAK对PF小鼠的体重、存活率、肺指数、组织病理变化具有较好的改善作用，并呈剂量依赖性。Masson染色以及羟脯氨酸含量测定结果表明GAK可明显抑制肺组织的胶原沉积。而且，免疫荧光染色结果表明，GAK给药组小鼠肺组织中上皮细胞标志蛋白E-Cadherin明显升高，而肺组织中间质细胞标志蛋白α-SMA明显降低，表明GAK对纤维化阶段的EMT过程具有明显的抑制作用。基于以上实验结果表明GAK在动物体内具有抗PF活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。