一种从热带水果中分离得到高效生产茉莉酸的可可毛色二胞菌的生产工艺

摘要

本发明公开了一种从热带水果中分离得到高效生产茉莉酸的可可毛色二胞菌的生产工艺，包括以下步骤：S1、将不同品种的热带水果洗净擦干后，室温保存，并观察热带水果的腐烂过程，当热带水果达到6‑7成腐烂时，挑出该水果，标记为水果A；S2、在100mL的无菌生理盐水中，加入同等质量的水果A，在26‑30℃条件下旋转震荡30‑35min，得到稀菌液a；S3、取2mL稀菌液a稀释到20mL，混合摇匀，取一定量涂布在PDA板上，在26‑30℃条件下培养2‑3天。本发明提出了一种生物合成茉莉酸得率高、成本低、健康环保的可可毛色二胞菌的生产工艺，非常适合应用于大规模农业生产实际中，在茉莉酸的生物合成中，可以得到含茉莉酸浓度较高的培养液，最高可达1080mg·L‑1，培养周期短，培养流程简便。

说明书

技术领域

本发明涉及热带水果分离技术领域，尤其涉及一种从热带水果中分离得到高效生产茉莉酸的可可毛色二胞菌的生产工艺。

背景技术

茉莉酸是一种有芳香味的环戊烷类化合物，在农业、工业及医药领域有良好的应用价值。茉莉酸的来源有三种途径，一是从富含茉莉酸的植物中提取分离获得，但含茉莉酸高的植物较少，提取成本较高，研究工作前人做了许多，都不宜用于大规模的生产实际中。其二是化学合成方法，从结构上分析茉莉酸及其酯具有两个手性中心，有4个同分异构体，在化学合成上具有一定的挑战性，化学法的优点是可以合成高纯度的茉莉酸，且可以通过特殊的分离手段把4种同分异构体分开，得到单一的消旋体，合成的起始反应物不同，合成路径差异很大，反应器的要求差异也大，得率从5％至60％，得率高的起始反应物，成本就比较高，反应器的耐温耐压要求就很高，所以，化学合成法的缺点也是生产成本高，可以应用于工业和医药领域，但不宜应用于农业生产实际中。第三种是生物合成方法，就是利用一种特殊的菌，在特定的培养基中适宜的条件下，培养一定的时间后，培养液中会生成一定量的茉莉酸，不同的菌种，不同的培养基，不同的培养条件，茉莉酸的得率从1mg·L-1至1080mg·L-1，差异非常大，得率的大小主要受菌种的影响，其次是培养基和培养条件。菌种选择不对时，培养液中几乎检测不到茉莉酸。

茉莉酸的生物合成，关键是菌种的扩繁，菌种的活性和浓度都与茉莉酸的得率紧密关联，菌种的活性随着其寿命的增长而衰减，随着扩繁次数的增多也减弱，活性高浓度合适的菌种接种于培养液中，茉莉酸的得率就高。保藏一段时间的菌种，复活后，必需检测其活性和浓度，若活性低，必需进行复壮后，才可以用于茉莉酸的生物合成。菌种的接种量影响茉莉酸的得率。并不是所有的可可毛色二胞菌都可以用于茉莉酸的生物合成，很多可可毛色二胞菌的培养液中，现在的检测仪器是检测不到茉莉酸的存在。菌种活性的高低和浓度是否合适，主要通过茉莉酸的得率来评价。用高效液相色谱(HPLC)对培养液中的茉莉酸进行定性定量，发现从热带水果中分离得到的可可毛色二胞菌，产茉莉酸的得率最高可以达到1080mg·L-1，而且生产成本很低(1g/50元)，非常适合应用于大规模农业生产实际中。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不易观察、菌种的活性较差、且产得率低、生产成本高的缺点，而提出的一种从热带水果中分离得到高效生产茉莉酸的可可毛色二胞菌的生产工艺。

一种从热带水果中分离得到高效生产茉莉酸的可可毛色二胞菌的生产工艺，包括以下步骤：

S1、将不同品种的热带水果洗净擦干后，室温保存，并观察热带水果的腐烂过程，当热带水果达到6-7成腐烂时，挑出该水果，标记为水果A；

S2、在100mL的无菌生理盐水中，加入同等质量的水果A，在26-30℃条件下旋转震荡30-35min，得到稀菌液a；

S3、取2mL稀菌液a稀释到20mL，混合摇匀，取一定量涂布在PDA板上，在26-30℃条件下培养2-3天，挑选出单一的菌株b；

S4、按上述制备步骤得到菌株b，分离纯化过程中，从菌株b的颜色变化和扫描电镜的表观图来确认是否可可毛色二胞菌，菌株b的培养过程中，颜色从乳白色到浅绿色到深绿色，最后变为黑褐色，并且电镜下观察到的菌体形状为椭圆形；

S5、把纯的菌种b接种于培养基B中，培养2-7天，把培养不同天数的菌种b，按5％、10％和15％的浓度，接种于培养基C中，调节pH值为5.4-5.6，在26-30℃条件下，静置培养,用高效液相色谱分别检测后期的培养液中的茉莉酸含量。

优选的，所述S1中，热带水果采用芒果、龙眼、荔枝、香蕉、菠萝、黄皮中的一种或多种。

优选的，所述S3中，从挑选出的菌株b中观察是否纯化，若观察到菌株b不纯，含有杂菌，重复步骤S3的操作，直至观察到菌株b完全纯化。

优选的，所述S5中，培养基B包括以下质量份的原料：蔗糖35g/L、玉米浆1g/L、硝酸钠3g/L、硫酸锰0.001g/L、硫酸铜0.001g/L、硫酸锌0.01g/L、硫酸镁2g/L、硫酸亚铁0.3g/L、氯化钾0.3g/L和磷酸二氢钾1g/L。

优选的，所述培养基C包括以下质量份的原料：蔗糖50g/L、玉米浆3g/L、硝酸钠7g/L、硫酸锰0.002g/L、硫酸铜0.002g/L、硫酸锌0.02g/L、硫酸镁4g/L、硫酸亚铁0.6g/L、氯化钾0.5g/L和磷酸二氢钾2g/L。

本发明提出了一种生物合成茉莉酸得率高、成本低、健康环保的可可毛色二胞菌的生产工艺，非常适合应用于大规模农业生产实际中，在茉莉酸的生物合成中，可以得到含茉莉酸浓度较高的培养液，最高可达1080mg·L

附图说明

图1为本发明的菌种培养工艺流程图；

图2为电镜下的菌体形状为椭圆形的观察图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例

参照图1-2，本发明提出的一种从热带水果中分离得到高效生产茉莉酸的可可毛色二胞菌的生产工艺，包括以下步骤：

(1)将不同品种有腐烂趋势的热带水果芒果、龙眼、荔枝、香蕉、菠萝和黄皮等洗净擦干，室温保存，观察腐烂过程，当达到7成左右腐烂时，挑出该水果。

(2)取同等质量的腐熟的水果，放入100mL无菌生理盐水中，在28℃条件下旋转震荡30分钟，得到稀菌液a。

(3)取2mL稀菌液a稀释到20mL，将稀释液混合摇匀，取一定量涂布在PDA板上，在28℃条件下培养48小时，挑选出单一的菌株b。

(4)若观察到菌株b不纯，含有杂菌，重复(3)的操作步骤。

(5)将纯的菌株b在扫描电镜下，观察其生物学形态特征，确定其是否是可可毛色二胞菌。

(6)按上述制备步骤得到菌株b，分离纯化过程中，从菌株的颜色变化和扫描电镜的表观图来确认是否可可毛色二胞菌，菌株的培养过程中，颜色从乳白色到浅绿色到深绿色，最后变为黑褐色，并且电镜下观察到的菌体形状为椭圆形，如下图2。

(7)把纯菌种b接种于培养基B【(克/升)：蔗糖35、玉米浆1、硝酸钠3、硫酸锰0.001、硫酸铜0.001、硫酸锌0.01、硫酸镁2、硫酸亚铁0.3、氯化钾0.3和磷酸二氢钾1】中，培养2、3、4、5、6、7天。

(8)把培养不同天数的菌种，按5％、10％和15％的浓度，接种于培养基C【(克/升)：蔗糖50、玉米浆3、硝酸钠7、硫酸锰0.002、硫酸铜0.002、硫酸锌0.02、硫酸镁4、硫酸亚铁0.6、氯化钾0.5和磷酸二氢钾2】中，在30℃、pH＝5.5静置培养，用高效液相色谱分别检测5、6、7天的培养液中的茉莉酸含量，检测结果表明接种量为10％，培养6天时，培养液中的茉莉酸含量达到最高1080mg·L

其中不同的接种浓度和培养天数，对茉莉酸产量的影响见下表1：

表1：茉莉酸在不同的接种浓度和培养天数下的产量表

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。