具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用

摘要

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，该片段命名为P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明还公开了一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，该信号肽命名为SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了含上述DNA片段和上述信号肽的重组载体或重组工程菌在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体，并成功应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现了高效生产。本发明提供的启动子特征揭示它在工业生产中具有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域和分子生物学技术领域，涉及一种DNA片段及其应用，具体说，涉及一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种重要的原核表达宿主，其遗传背景清晰，遗传操作简单，具有较强的蛋白分泌能力，不具有致病性，发酵工艺成熟。广泛用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等工业用酶。

启动子是直接影响基因表达水平的重要的基因组调控元件，在细菌中，RNA聚合酶和相关的sigma因子识别启动子，并通过调节蛋白与启动子内特定位点的结合而被招募。迄今为止，已有三种启动子用于枯草杆菌异源蛋白的高水平表达：组成性启动子、诱导特异性启动子和自诱导启动子。组成型启动子，如P43启动子，会影响菌体生长，不适合生产对宿主有毒的物质。诱导型启动子(如Pspac和Pxyl)是使用最广泛的类型，但是诱导物如IPTG和木糖一般价格昂贵，会增加工业生产成本。自诱导启动子是大规模蛋白质生产的理想选择。这样的启动子可以诱导目标基因从对数晚期到稳定期的表达，而不需要诱导物，这有助于以较低的成本高效生产异源蛋白，然而，低活性是该类启动子目前广泛应用的一个障碍。因此有必要找到更高效、适合于工业培养基生产表达的启动子。除启动子外，核糖体结合位点(RBS)、SD序列和信号肽等元件也会影响蛋白的表达。通常根据转录组测序结果，可以筛选到转录水平较高的启动子，然而进行蛋白表达时还需要对上述元件进行进一步的优化。

果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层的杂多糖，根据果胶分子主链和支链结构的不同,可以将其分为3类:同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan,HG)，鼠李半乳糖醛酸聚糖I(Rhamngalacturonan I,RGI)，鼠李半乳糖醛酸聚糖II(Rhamngalacturonan II,RGII)。该酶作用于果胶可以释放不同聚合度的寡糖，这些寡糖具有益生作用(Inês R Silva,Jers C,Otten H,et al.Design of thermostablerhamnogalacturonanlyase mutants from Bacillus licheniformis by combination oftargeted single point mutations[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(10):4521)但检索发现，利用在枯草芽孢杆菌胞外蛋白质组信息，克隆胞外含量较高蛋白的启动子和信号肽编码区的DNA片段并使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现高效生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的文献或专利还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。

本发明所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，其特征在于：该DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列为如下任一序列：

(1)如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)与序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；

(3)对上述(1)或(2)所示DNA序列进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有相同启动子功能的DNA序列。

上述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，优选的实施方式是：所述DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，其特征在于：所述信号肽命名为信号肽SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码上述枯草芽孢杆菌信号肽的基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种重组载体，其特征在于：所述重组载体命名为pN-P2454-SP2454，是将上述启动子P2454核苷酸序列与上述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接到载体pNW33N上获得；其中所述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接在启动子P2454下游，在P254介导下表达。

本发明还提供了一种鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶分泌表达载体，其特征在于：所述分泌表达载体命名为pN-rgl，是将编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因rgl连接到重组载体pN-P2454-SP2454的SP 2454编码基因下游得到；其中所述编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的重组工程菌，其特征在于：是利用鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶分泌表达载体pN-rgl转化宿主细胞得到。

上述的重组工程菌中：所述宿主细胞优选草芽孢杆菌7-3-3，所述表达载体pN-rgl转化宿主细胞得到的重组工程菌命名为BS-OErgl。

含上述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段和上述枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽的重组载体或重组工程菌在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。

申请人通过对一株在麸皮玉米粉组成廉价培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌的发酵液上清进行了蛋白质组分析，筛选到了一个在发酵液中含量较高的蛋白，克隆了其启动子和信号肽编码序列。使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体，并成功应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现了高效生产。该启动子特征揭示它在工业生产中的应用具有重要价值。本发明的突出效果体现在：在当前枯草芽孢杆菌缺少可工业化应用的启动子背景下，本发明提供的具有启动子和信号肽功能的DNA片段，不需要添加诱导物的条件下即能实现蛋白基因的分泌表达，将其运用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的表达，为枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白提供了有效的手段，具有很好的开发前景。

附图说明

图1.含有启动子和信号肽编码序列的DNA片段PCR扩增产物的电泳图，其中：M为DNA分子量Marker，泳道1为DNA片段。

图2.重组载体pN-P2454-SP2454构建示意图。

图3.重组载体pN-rgl构建示意图。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。实施例中所描述的方法内容若无特殊说明，均为常规实验方法。

实验条件：

1.菌株与载体

枯草芽孢杆菌7-3-3(Bacillus subtilis 7-3-3)分离自山东大学校园土壤，并保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.M200038；大肠杆菌感受态细胞Trans5α(购自北京全式金生物技术有限公司)；大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N(GenBank:AY237122.1，购自Bacillus Genetic Stock Center，USA)。

2.酶类及其他生化试剂

FastPfu DNA聚合酶、Basic Seamless Cloning and Assembly Kit无缝克隆试剂盒，T4 DNA连接酶均购自全式金公司，细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司，FastDigest限制性内切酶购自ThermoFisher公司，所述试剂使用方法参照其说明书。其他普通分析纯化学试剂购自国药集团。

3.培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，pH 7.0，固体LB培养基额外添加1.6％琼脂粉。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母提取物5.0，氯化钠5，磷酸氢二钾10，硫酸镁0.5。

发酵培养基(g/L)：麸皮5.0、玉米粉4.2,硫酸铵0.3，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.2，使用前添加单独灭菌的碳酸钠0.1。

实施例1枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白的获得及蛋白质组鉴定

将枯草芽孢杆菌7-3-3(保藏编号CCTCC NO.M200038)从-80℃甘油管取出划线于LB固体平板上，37℃培养12h，挑取单菌落于5mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养12h；按体积比3％接种量转接于种子培养基中，37℃，200rpm培养4h；按体积比10％接种量接种于发酵培养基，使用500mL三角瓶，发酵培养基装液量为100mL，37℃，200rpm进行摇瓶发酵培养。

于55h对发酵液进行取样1mL，于4℃，8000g离心后获得上清液。使用含10％三氯乙酸的丙酮溶液，-20℃预冷后，3mL丙酮溶液与500μL发酵液上清混合，-20℃放置过夜。4℃，8000g离心20min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2次，空气中干燥沉淀15min，即得到枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白。

蛋白质组测序委托华大科技股份有限公司。利用LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对得到的枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白进行无标记质谱定量分析，样品处理方法参照公司说明。

实施例2筛选并克隆启动子及信号肽编码序列

采用信号强度法对枯草芽孢杆菌7-3-3胞外分泌蛋白定量信息进行提取，采用肽段定量值与全部肽段定量值之和的比值作为蛋白丰度比，对数据进行处理，筛选在蛋白质谱中丰度较高的蛋白基因。使用SignalP 5.0在线预测服务(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对丰度较高的蛋白预测信号肽，“Organism group”选择“Gram-positive”，输入蛋白质氨基酸序列进行预测。根据预测结果，进一步筛选具有信号肽的蛋白，最终筛选到一个蛋白表达量较高且具有信号肽的蛋白基因2454，其启动子命名为P2454，长300bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；信号肽命名为SP2454，含有25个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码信号肽SP2454的基因序列长75bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

使用细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌7-3-3总DNA，提取方法参照说明书。根据所述DNA设计如下引物：

上游引物：5'

下游引物：5'

下划线表示酶切位点和保护碱基序列，以便后续克隆。

以枯草芽孢杆菌7-3-3总DNA为模板，使用FastPfu DNA聚合酶扩增375bp大小的DNA片段，即具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段，PCR反应条件为，94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸3min，扩增产物大小与预期相符(见图1)。

实施例3分泌表达载体pN-P2454-SP2454的构建

以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pNW33N为骨架，用限制性内切酶KpnI和BamHI将质粒进行酶切，酶切产物经过DNA胶回收试剂盒进行纯化。实施例2中扩增的DNA片段经过同样的酶切和纯化操作。使用T4 DNA连接酶连接纯化后的DNA片段和质粒pNW33N，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性转化子并委托北京擎科新业生物技术有限公司进行测序验证，得到正确的重组载体，该分泌表达重组载体命名为pN-P2454-SP2454，如图2所示，启动子P2454核苷酸序列与编码信号肽SP2454的基因连接到载体pNW33N的KpnI和BamHI酶切位点之间，编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接在启动子P2454下游，在P254介导下表达。

实施例4鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶表达载体的构建

使用限制酶BamH I和Sal I双酶切重组载体pN-P2454-SP2454，酶切产物经过DNA胶回收试剂盒进行纯化。

根据SignalP 5.0在线预测网站预测信号肽结果，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶基因rgl前96bp为信号肽编码区，以枯草芽孢杆菌7-3-3总DNA为模板，扩增无信号肽编码区的rgl基因即编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)。使用引物对：

上游引物：5'aacagcagtactaccaatagtTGAAGGGGCAGCGCGGCAGAT 3'

下游引物：5'aagcttgcatgcctgcagTTAAGGCGTATACATATTTGGTTTTGGC3'

扩增出1758bp的DNA片段，PCR反应条件为，94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸3min，回收扩增产物并纯化。使用Basic SeamlessCloning and Assembly Kit无缝克隆试剂盒对纯化后的DNA片段和载体进行连接，挑选阳性转化子并测序验证，得到鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶分泌表达载体，命名为pN-rgl。该分泌表达载体pN-rgl是将编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因连接到重组载体pN-P2454-SP2454的SP 2454编码基因下游得到(见图3)；其中所述编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例5鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶表达重组工程菌的构建

枯草芽孢杆菌7-3-3电击转化：挑取新鲜单菌落于5mL LB培养基，37℃，200rpm培养过夜；按体积比1％接种量转接至50mL GM培养基(LB培养基添加0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养3-4小时至OD

实施例6鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的发酵生产及表达水平检测

将得到的工程菌株BS-OErgl和BS-pN按照实施例1的方法进行发酵培养，并添加额外的5μ/mL氯霉素，菌株7-3-3作为对照，于24h，48h，72h，96h分别取样1mL，在8000g条件下离心取上清得到粗酶液，进行下一步分析。

鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶活性检测：高纯度染色和交联的不溶性AZCL-鼠李半乳糖醛酸聚糖(AZCL-Rhamnogalacturonan，购自Sigma-Aldrich)用于表征酶活，酶活测定方法参考说明书。

具体测定方法是：准确称取0.2g不溶性AZCL-鼠李半乳糖醛酸聚糖于烧杯中，加入含0.44mM CaCl

酶活定义为：在37℃，pH 7.0下，单位时间(1min)使1mL 0.2％的AZCL-鼠李半乳糖醛酸聚糖(AZCL-Rhamnogalacturonan)降解，反应液在590nm处吸光值升高1所需要的酶量定义为一个活力单位。

菌株BS-pN酶活72h达到最高，活性为3.31±0.11U/mL，菌株BS-OErgl酶活48h达到最高，活性为184.72±8.85U/mL。

序列表

<110>山东大学

<120>一种具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用

<141>2020-12-31

<160>8

<210>1

<211>300

<212> DNA

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>启动子P2454的核苷酸序列

<222>（1）…（300）

<400> 1

catataagtg tcctgctcgt tttttccgag gtacttccat gtgaggagat cgccgtttaa 60

agcaatctct tccggaagcc agaactgctt cacgttttgg ttatagaaca tttgggtaaa 120

atcgtcttca tgctttgacc agtttgctgc agtatacagc ttgttttcgt tgagttgtga 180

caaaaatgtg acctcctaaa tattttttcc tccctcacca cctgtaaaaa gaagggaata 240

ttttataaat gttgtaaatt ttataatgca acatattcac tattaaggga ggaataaaaa 300

<210> 2

<211> 25

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>信号肽SP2454的氨基酸序列

<222>（1）…（25）

<400> 2

Met Lys Lys Lys Phe Ile Ala Gly Ala Leu Val Leu Gly Leu Ile Pro

1 5 10 15

Thr Ile Gly Ser Thr Ala Val Ser Ala

20 25

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列

<222>（1）…（75）

<400> 3

atgaaaaaga aatttattgc tggtgcttta gttttaggtc taatacctac tattggtagt 60

actgctgttt cagca 75

<210> 4

<211> 1758

<212> DNA

<213>枯草芽孢杆菌7-3-3

<221>鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶核苷酸编码序列

<222>（1）…（1758）

<400> 4

gaaggggcag cgcggcagat ggaagcgctg aaccgggggc ttgtagcggt caagacggac 60

gggggcattt ttgtcagctg gcggtttctt ggaaccgaaa acgcatctgt tttgttcaat 120

gtgtacagag acgggcaaaa actgaatgct gcgcctgtca aaaccacgaa ctatgtggat 180

aaaaacggat cggcgggctc aacgtatacg gttcgtgctg ttgtaaacgg taccgaacag 240

ccggcttctg aaaaagcctc cgtatgggcg cagccgtatc attccgtccc gctggataaa 300

ccggctggcg gcacgacgcc aaagggtgaa ggttacacgt acagcgctaa tgacgcaagt 360

gttggcgatg tggatggtga cgggcaatac gagctgatcc taaaatggga cccgtctaac 420

tcaaaagaca attcacagga tggctatacg ggtgacgtgc tggttgacgc gtataaactg 480

gacggcacaa agttatggcg gatcaatctc ggcaaaaaca tcagagcggg cgcgcactac 540

acccagttta tggtgtatga ccttgatggt gacggaaaag cggaagtggc aatgaaaacg 600

gcagacggga caaaagacgg cacgggcaaa gtaattggaa atgccaatgc tgattacaga 660

gatgaacagg ggcgtgtgct ttcaggccca gaatatctca ctgtgtttca aggttcaacc 720

gggaaagagc ttgtcaccgc aaattttgaa ccggcgcgcg gcaatgtgtc ggattgggga 780

gacagctacg gcaaccgtgt tgaccgtttt ctcgccggca ttgcctacct tgatggacag 840

cggccgagcc tgatcatgac cagagggtat tacgctaaaa ccatgctagt tgcctataac 900

ttcagggatg gaaagctgtc aaagctttgg acgctggact cctcaaagtc aggaaatgaa 960

gcgtttgccg gacaggggaa tcacaacctg agcatcgcgg acgttgacgg ggatggaaaa 1020

gatgagatta ttttcggctc aatggctgta gatcatgacg ggaaaggcat gtactcgacc 1080

ggcttaggcc atggggatgc cctccataca ggagatcttg atccgggccg gccggggctt 1140

gaggtgtttc aagtacatga ggacaaaaat gcaaaatacg gcttatcttt ccgggatgct 1200

gcaaccggaa agatcctttg gggcgtttat gccggcaagg atgtaggccg gggaatggct 1260

gctgatattg acccgcgtta tccgggacag gaagtgtggg caaacggttc tctctactca 1320

gcgaaagggg tcaaaatcgg aagcggggtt ccgtcctcga ccaacttcgg tatctggtgg 1380

gacggcgacc tgctgcggga acagctggac agcaaccgaa ttgataagtg ggattatcaa 1440

aacggcgtat cgaaaaatgt gctgactgca tcaggcgcag cggctaacaa cggcacaaaa 1500

gcaacaccgg cgcttcaggc tgatctgctc ggtgactggc gcgaggaagt cgtgtggaga 1560

acggaggaca gcagtgctct gcgcatttac acgacgacca ttccgactga gcacaggctg 1620

tatacgctga tgcacgatcc ggtgtaccgg cttggcatcg cctggcaaaa tgtcgcctat 1680

aaccagccgc cgcacacaag cttcttttta ggagacggca tggcggaaca gccaaaacca 1740

aatatgtata cgccttaa 1758

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 扩增启动子和信号肽编码区上游引物

<222>（1）…（32）

<400> 5

ggggtaccca tataagtgtc ctgctcgttt tt 32

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<221>扩增启动子和信号肽编码区下游引物

<222>（1）…（34）

<400> 6

cgggatcctg ctgaaacagc agtactacca atag 34

<210>7

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 扩增鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶编码序列上游引物

<222>（1）…（41）

<400> 7

aacagcagta ctaccaatag tgaaggggca gcgcggcaga t 41

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213>人工序列

<221>扩增鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶编码序列下游引物

<222>（1）…（46）

<400>8

aagcttgcat gcctgcagtt aaggcgtata catatttggt tttggc 46