一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用，涉及基因检测技术领域，该检测方法采用全血样本处理液对全血样本进行预处理，可使血液样本经简单处理后即可直接用作后续荧光PCR的模板进行基因检测，大大简化了样本处理的操作流程，缩短了样本处理时间，降低了检测成本，并适合高通量检测的进行，适用范围广，可用于TaqMan探针检测体系和通用发卡探针检测体系，具有检测结果重复性、准确性好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用。

背景技术

近年来，随着生物、医学和法医学等各相关领域的发展，基因检测技术得到越来约为广泛的应用，而血液样本则是基因检测中最为常见的样本类型之一。全血中存在有很多PCR反应抑制物，例如，血红素、蛋白质、盐和抗凝剂等，使得常规的Taq聚合酶不能从全血中直接进行PCR反应，因此，现有的基因检测技术如测序、基因芯片等，通常需要从全血中提取出高纯度和浓度的基因组DNA作为模板。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往伴随着较高的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续检测失败的可能。此外，由于提取过程耗时长、成本高、步骤复杂，且需使用苯酚等有害试剂，增加了操作者感染的风险。因此，血液样本若能直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行后续PCR扩增检测，省去提取的过程，将从时间、经济、结果准确性等多方面对现有基因检测技术进行提高。

血液直接扩增技术主要是通过全血样本预处理或/和基因工程改造DNA聚合酶来实现，全血样本预处理包括热处理(如95℃处理15min、90℃和50℃之间各暴露1min并循环20次)、化学试剂处理(如硫酸铵、明胶、甲酰胺、无机碱、Triton X-100、DMSO、H

现有的血液直接扩增技术虽然较常规的基因组DNA提取纯化过程有所简化，但全血样本的预处理仍然会涉及到额外的热循环、离心、加液和弃液等步骤，且条件难以控制、重复性差、不能形成商品化试剂盒，不利于推广使用。而基因工程改造DNA聚合酶法多为缺陷型Taq酶，与常规Taq DNA聚合酶相比保真度下降，同时，较普通Taq酶需要更高的成本。

荧光PCR是在PCR过程中加入了荧光基团或者荧光染料指示剂，对PCR产物进行标记跟踪，利用信号积累实时监测PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析和计算。荧光PCR在反应的对数期检测，分析起始点产物的量、实时监测荧光信号、动力学范围广、有效鉴别非特异性扩增和突变、可以相对定量和绝对定量。虽然目前可用于基因检测的技术还有很多，如芯片法、测序法的，但综合考虑仪器设备成本、试剂耗材成本、方法开发难易程度、操作简便性、劳动强度以及检测通量等，荧光PCR仍是目前用于基因检测的最重要的检测技术方法之一。

目前的全血直接荧光PCR技术较少，且基本上都存在一定的局限性，CN107475252A提供的方法中全血样本的处理包含震荡、离心及热处理5～30min的步骤；CN106978501A提供的方法中全血样本的处理需要两步的加液及一步离心操作；CN111500735A提供的方法中需要进行两轮PCR，耗时较长且涉及开管操作，易造成气溶胶污染；CN111020026A和CN107058530A则分别使用了进口的PCR反应Mix和血液高耐受Taq酶，增加了检测的成本。因此，需要开发一种血液样本经过简单处理就可以作为模板进行荧光PCR扩增检测的方法，以满足科研和医学领域对于基因检测技术的快速、简便、成本低廉的要求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全血直接荧光PCR检测方法以及全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种全血直接荧光PCR检测方法，其包括将全血样本处理液与全血样本混合后进行荧光定量PCR检测；在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，所述全血样本处理液的组分及其组分的终浓度如下：终浓度为100～250mM的NaCl、终浓度为10～50mM的Tris-HCl、终浓度为50～100mM的NaOH、终浓度为0.5～4mM的EDTA、终浓度为0.01wt％～0.04wt％的SDS以及水。

第二方面，本发明实施例还提供了全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用，所述基因检测试剂盒的检测方法为：将全血样本处理液与全血样本混合后进行荧光定量PCR检测；

其中，在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，所述全血样本处理液的组分及其组分的终浓度如下：终浓度为100～250mM的NaCl、终浓度为10～50mM的Tris-HCl、终浓度为50～100mM的NaOH、终浓度为0.5～4mM的EDTA、终浓度为0.01wt％～0.04wt％的SDS以及水。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种全血直接荧光PCR检测方法，该检测方法采用全血样本处理液对血液样本进行预处理，经简单处理后的血液样本直接作为后续荧光PCR的模板进行基因检测，大大简化了样本处理的操作流程、缩短了样本处理时间，显著提高了PCR检测的效率，具有较高的时间和经济效益；本发明样本需求量少，并适合高通量检测的进行，适用范围广，可用于TaqMan探针检测体系和通用发卡探针检测体系，具有检测结果重复性、准确性好等优点，还可配合PCR试剂冻干技术、微流控芯片技术等，实现PCR的现场即时检测(POCT)，为临床医学检验、检验检疫、疾病预防控制等提供有效的解决方案。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中使用含不同Tris-HCl浓度的全血样本处理液处理的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图2为本发明实施例1中使用含不同EDTA浓度的全血样本处理液处理的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图3为本发明实施例1中使用含不同SDS浓度的全血样本处理液处理的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图4为本发明实施例1中使用含不同NaCl浓度的全血样本处理液处理的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图5为本发明实施例1中使用含不同NaOH浓度的全血样本处理液处理的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图6为本发明实施例1中使用不同混合比例的全血样本处理液处理的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图7为本发明实施例1中使用全血样本处理液处理不同时间的全血样本的荧光PCR检测扩增曲线图；

图8为本发明实施例2中10份样本GAPDH基因血液直接荧光PCR检测的荧光扩增曲线图；

图9为本发明实施例2中同一份样本平行处理10次后进行GAPDH基因血液直接荧光PCR检测的荧光扩增曲线图；

图10为对比例中使用本发明提供的血液直接荧光PCR检测方法与对比产品处理的全血样本的荧光PCR扩增曲线图；

图11为本发明实施例3中CYP2C19:c.681G>A血液直接荧光PCR检测荧光扩增曲线图及验证例中Sanger测序图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明实施例提供了一种全血直接荧光PCR检测方法，其包括将全血样本处理液与全血样本混合后进行荧光定量PCR检测；在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，所述全血样本处理液的组分及其组分的终浓度如下：终浓度为100～250mM的NaCl、终浓度为10～50mM的Tris-HCl、终浓度为50～100mM的NaOH、终浓度为0.5～4mM的EDTA、终浓度为0.01wt％～0.04wt％的SDS以及水。

发明人经一系列创造性劳动，发现通过上述全血样本处理液可使血液样本经简单处理后即可直接作为后续荧光PCR的模板进行基因检测，且处理流程无需热处理以及多次离心、弃液等步骤，仅需一步混合即可完成，简化了样本处理的操作流程、缩短了样本处理时间、降低了检测成本，并适合高通量检测的进行。

本文所述“全血样本处理液”中各组分的“终浓度”是指：各组分在全血样本处理液中的终浓度。

本文中的“wt％”为质量百分比，即质量浓度，表示单位质量的溶液中含有某物质的百分比。

具体地，在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，全血样本处理液中的NaCl的终浓度可以为：100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM、200mM、205mM、210mM、215mM、220mM、225mM、230mM、235mM、240mM、245mM、250mM中的任意浓度。

在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，Tris-HCl的终浓度可以为：10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM中的任意浓度。

在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，NaOH的终浓度可以为：50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM以及100mM中的任意浓度。

在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，EDTA的终浓度可以为：0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM中的任意浓度。

在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，SDS的终浓度可以为：0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％中的任意质量浓度。

优选地，全血样本处理液中的水为灭菌超纯水。

优选地，在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，所述全血样本处理液的组分及其组分的终浓度如下：终浓度为150～250mM的NaCl、终浓度为10～30mM的Tris-HCl、终浓度为60～90mM的NaOH、终浓度为0.5～3mM的EDTA、终浓度为0.02wt％～0.04wt％的SDS以及水。

在该浓度范围下，能够进一步提高预处理的效果，提高检测有效率和准确性。

更优选地，在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，所述全血样本处理液的组分及其组分的终浓度如下：终浓度为180～220mM的NaCl、终浓度为15～25mM的Tris-HCL、终浓度为70～80mM的NaOH、终浓度为0.5～1.5mM的EDTA、终浓度为0.025wt％～0.035wt％的SDS以及水。

优选地，所述全血样本与所述全血样本处理液的混合体积比为1：(25～35)。在一些实施例中，该体积比可以为1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35中的任意比例。在该混合比例下，全血样本处理液能够有效对全血样本能够进行预处理。

优选地，所述全血样本与全血样本处理液的混合体积比为1：(27～33)。

在一些实施例中，所述全血样本处理液与全血样本的混合时间为1～10min。具体的，混合时间可以为1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min中的任意时间。

优选地，所述全血样本处理液与全血样本的混合时间为1～5min。

优选地，所述全血样本处理液与全血样本的混合方式为震荡混合。

本发明对混合温度不作具体限制，在一些实施例中，所述全血样本处理液与全血样本的混合温度为15～35℃。具体地，混合温度可以为15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和35℃中的任意温度。

此外，本发明实施例还提供全血样本处理液在制备基因检测试剂盒中的应用，所述基因检测试剂盒的检测方法为：将全血样本处理液与全血样本混合后进行荧光定量PCR检测；

其中，在全血样本处理液与全血样本混合的溶液中，所述全血样本处理液的组分及其组分的终浓度如下：终浓度为100～250mM的NaCl、终浓度为10～50mM的Tris-HCl、终浓度为50～100mM的NaOH、终浓度为0.5～4mM的EDTA、终浓度为0.01wt％～0.04wt％的SDS以及水。

在一些实施例中，全血样本处理液同上述任意实施例所述的全血样本处理液，在此不再赘述。

综上，本发明提供的PCR检测方法的优点主要包括：

1)全血样本不需核酸提取流程，只需与本发明提供的血液样本处理液按一定比例稀释、混匀后即可作为后续荧光PCR检测的模板，样本处理流程无需热处理、多次加液、离心、弃液等步骤，操作极为简便，即用于少量血液样本的处理，也可用于大量样本的高通量检测。

2)本发明所需样本量低(最少仅需2μL血液样本)，大大节约了样本，尤其适用于少量采血时(如儿童采血)的标本的检测。

3)本发明提供的血液样本处理液成本较低，常规核酸提取纯化成本约3～6元/样本，而血液样本处理液成本低于0.1元/样本。

4)本发明提供的血液直接荧光PCR检测方法适用范围广，即可用于TaqMan探针检测体系，也可用于通用发卡探针检测体系，检测结果重复性、准确性好。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：全血样本处理液组分及样本处理流程优化

1.1全血样本处理液组分优化

本发明全血样本处理液包含以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)。

NaOH可使血红蛋白、核酸酶及其他一些蛋白变性，降低它们对PCR反应的抑制，核酸酶的变性还可减少样本中基因组DNA的降解，同时NaOH也是裂解血细胞的细胞膜的主要组分；当NaOH浓度过低时PCR抑制成分变性不彻底、细胞裂解不充分，而NaOH浓度过高时则会使DNA聚合酶变性失活，这均会影响后续的PCR扩增过程。SDS是阴离子表面活性剂，可加速细胞膜上脂类、蛋白等成分的溶解，NaCl可增加细胞膜的渗透性，这两种成分都有助于细胞的裂解，促进基因组DNA的释放；当SDS或NaCl浓度过低时，细胞裂解不充分，而浓度过高时则会抑制PCR反应的进行。EDTA作为二价阳离子螯合剂，可用于抑制细胞内源性核酸酶的活性，提高样本中基因组DNA保存的稳定性，但当EDTA浓度过高时，则会降低PCR反应中DNA聚合酶的活性，影响反应的进行。Tris-HCl为DNA的保存提供合适的pH值，可提高样本中基因组DNA的稳定性，有利于样本的保存，同时还提供了一套很好的pH缓冲系统，用于降低NaOH对于PCR扩增的影响；当Tris-HCl浓度过高时，会消减NaOH对于血细胞的裂解效果，而浓度过低时，则无法消除NaOH对于后续PCR反应的抑制。因此优化全血样本处理液中各组分的浓度，能够提高样本预处理的效果，增加检测有效率和准确性。

Tris-HCl溶液(pH8.0，1M)、EDTA溶液(pH 8.0，0.5M)、10％SDS溶液、NaCl、NaOH均采购自上海生工，NaCl及NaOH均配制成1M的溶液于4℃保存备用。

本实施例采用单一因素优化试验进行检测不同浓度的Tris-HCl、EDTA、SDS、NaCl和NaOH对于PCR扩增效率的影响：

Tris-HCl浓度测试了10mM、20mM、30mM、50mM、75mM、100mM、125mM共7个梯度，体系中其他组分浓度固定为：EDTA 1mM，SDS 0.01％，NaCl 100mM，NaOH 50mM；

EDTA浓度测试了0.05mM、1mM、2mM、3mM、4mM共5个梯度；体系中其他组分浓度固定为：Tris-HCl 50mM，SDS 0.01％，NaCl 100mM，NaOH 50mM；

SDS浓度测试了0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％共5个梯度；体系中其他组分浓度固定为：Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，NaCl 100mM，NaOH 50mM；

NaCl浓度测试了50mM、100mM、150mM、200mM、250mM共5个梯度；体系中其他组分浓度固定为：Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，SDS 0.01％，NaOH 50mM；

NaOH浓度测试了25mM、50mM、75mM、100mM、125mM共5个梯度；体系中其他组分浓度固定为：Tris-HCl 50mM，EDTA 1mM，SDS 0.01％，NaCl 100mM。

依据以上各组分浓度梯度测试要求，计算各试剂Tris-HCl溶液(pH8.0，1M)、EDTA溶液(pH 8.0，0.5M)、10％SDS溶液、NaCl溶液(1M)、NaOH溶液(1M)及灭菌超纯水的需求量，配制27种候选全血样本处理液，轻轻颠倒混匀后室温保存备用。

1.2样本处理流程优化

样本处理流程可能对后续PCR扩增效率产生影响，本实施例中分别对样本处理时血液与全血样本处理液的最佳比例、样本处理时间进行了试验：

1.2.1血液与全血样本处理液最佳比例测试

依次取2μL的同一EDTA抗凝血样本分别加入到盛有20、40、60、80、100、160、320μL的全血样本处理液的1.5mL离心管中(即血液：样本处理液的比例分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:80、1:160))，震荡混匀1min，瞬时离心后备用。

1.2.2样本处理时间测试

取一计时器并调整计时器为10min，开启计时器后在7个装有60μL全血样本处理液的1.5mL离心管中，依次在计时器时间点为10、8、5、4、3、2、1min时加入2μL的同一EDTA抗凝血样本，震荡混匀1min，瞬时离心后备用。

1.3人GAPDH检测引物及TaqMan探针设计

以对人外周血中管家基因GAPDH检测为例，对血液直接荧光PCR扩增最佳体系及流程进行测试。

GAPDH基因序列来源于NCBI，从基因上选取一段特异序列

上游引物GAPDH-F序列为5’-TGTTCCAATATGATTCCACCCAT-3’，下游引物GAPDH-R序列为5’-ATTTCCATTGATGACAAGCTTCC-3’，探针GAPDH-P序列为5’-HEX-TCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-BHQ1-3’，探针5’端连接有HEX荧光基团，探针3’端连接有BHQ1荧光淬灭基团，引物和探针设计完成后，由上海生工进行合成。

1.4荧光PCR反应体系配制

GAPDH血液直接荧光PCR检测体系的配制按表1进行：在200μL的PCR管中依次加入10μL 2×ChamQ Geno-SNP Probe Master Mix(诺唯赞)、0.6μL上游引物GAPDH-F(10μM)、0.6μL下游引物GAPDH-R(10μM)、0.15μL探针GAPDH-P(10μM)、6.65μL灭菌ddH2O，最后加入2μL经预处理的血液样本作为模板，轻柔混匀，瞬时离心后置于冰上备用。

表1 Taqman探针法血液直接荧光PCR检测体系配制

1.5上机检测

将配制好荧光PCR检测体系的PCR管放置在ABI ViiA7荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。按照表2设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增程序。反应结束后，根据扩增曲线划定合适的基线和荧光阈值，参考仪器用户指南，读取Ct值，进行结果判读。

表2仪器核酸扩增参数

1.6结果分析

1.6.1全血样本处理液组分优化结果

全血样本处理液组分优化试验结果如图1～图5所示：

图1为Tris-HCl浓度优化测试结果，当全血样本处理液中Tris-HCl(pH8.0)浓度为20mM时，荧光PCR扩增效率最高，10mM和30mM时扩增效率次之，当Tris-HCl浓度为50mM和以上浓度时，PCR扩增效率则显著下降，所以Tris-HCl最佳浓度选择为20mM；

图2为EDTA浓度优化测试结果，当EDTA的浓度为1mM、2mM、3mM时，荧光PCR扩增效率没有明显差异，浓度为0.5mM时PCR扩增的荧光信号有轻微下降，EDTA浓度为4mM时，PCR扩增受到轻微抑制，Ct值有所后移，扩增效率下降，因此EDTA最佳浓度选择为1mM；

图3为SDS浓度优化测试结果，当SDS浓度为0.02％、0.03％、0.04％时，荧光PCR扩增的Ct值相似，浓度为0.02％时荧光信号值有轻微下降，而SDS浓度为0.005％和0.01％时，Ct值明显滞后，扩增效率下降，因此SDS的最佳浓度选择为0.03％；

图4为NaCl浓度优化测试结果，当NaCl浓度为100mM、150mM、200mM、250mM时，荧光PCR扩增的Ct值相似，但浓度为200mM时荧光信号值最高，而NaCl浓度为50mM时，荧光PCR扩增效率明显降低，因此NaCl的最佳浓度选择为200mM；

图5为NaOH浓度优化测试结果，当NaOH浓度为75mM时，荧光PCR扩增的效率最高，随着NaOH浓度的升高或下降，扩增效率也逐渐降低，因此NaOH最佳浓度选择为75mM。

综上，最优的全血样本处理液体系为：Tris-HCl(pH8.0)20mM、EDTA(pH 8.0)1mM、SDS 0.03％、NaCl 200mM、NaOH 75mM。

1.6.2样本处理流程优化结果

图6为血液与优化后的血液样本处理液最佳混合比例测试的结果，当血液：样本处理液以1:30的比例进行混合时，荧光PCR扩增的效率最高，随着血液：样本处理液混合比例的升高或者降低，其扩增效率均逐渐下降，因此血液/样本处理液的最佳混合比例选择为1:30。

图7为使用优化后的血液样本处理液对EDTA抗凝血处理不同时间后作为模板进行荧光PCR扩增的结果，测试结果表明不同处理时间的样本，荧光PCR扩增的效率不存在明显差异，综合时间节约考虑，本发明选择的样本处理时间为1min。

实施例2：基于Taqman探针的全血直接荧光PCR检测方法

本实施例以对人外周血中管家基因GAPDH进行血液直接荧光PCR扩增为例，对基于Taqman探针的血液直接荧光PCR检测方法进行说明。

2.1全血样本处理液配制

全血样本处理液按照表3配方进行配制，以配制10mL全血样本处理液为例：在1个15mL的无菌离心管中依次加入1M NaCl溶液2000μL、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液200μL、1MNaOH溶液750μL、0.5M EDTA(pH8.0)溶液20μL、10％SDS溶液30μL，然后加入7000μL灭菌超纯水，轻轻颠倒混匀后室温保存备用。

表3全血样本处理液

2.2样本处理

10例临床EDTA抗凝全血样本用于本发明全血直接荧光PCR检测方法的测试，样本的处理流程为：取2μL的EDTA抗凝血样本加入到盛有60μL全血样本处理液的1.5mL离心管中(当样本需求量较大时，可按血液：处理液＝1:30的比例，扩大处理的样本量)，震荡混匀1min(或颠倒混匀20次以上)，瞬时离心后备用。

2.3人GAPDH检测引物及TaqMan探针设计

同实施例1中第1.3步。

2.4荧光PCR反应体系配制

同实施例1中第1.4步。

2.5上机检测

同实施例1中第1.5步。

2.6结果分析

使用本发明提供的全血样本处理液和快速处理方案对10份EDTA抗凝全血进行处理，处理后的样本作为模板进行GAPDH基因荧光PCR检测，结果如图8所示。由结果可知，无模板对照VIC通道无扩增信号，1～10号样本VIC通道均有典型的荧光PCR扩增曲线，Ct值集中在25～30之间，所有反应孔背景信号较好，无明显的扩增抑制情况出现，也未出现明显的荧光干扰。

使用本发明提供的全血样本处理液和快速处理方案对同1份EDTA抗凝全血进行10次处理，处理后的10份样本作为模板进行GAPDH基因荧光PCR检测，结果如图9所示。由结果可知，同一样本10次检测荧光扩增曲线图的Ct值都很接近，差值均小于1，表明本发明提供的血液直接荧光PCR法具有很好的重复性和均一性。

对比例：与市售产品进行性能对比

1.1试验步骤

1)使用本发明提供的全血样本处理液和快速处理方案(参照实施例2中2.1～2.2步骤)对2份EDTA抗凝全血样进行处理。

2)使用市场中销售的A公司的全血样本常温裂解试剂(包含Lysis Buffer和Stabilizing Buffer两个组分)对同样的2份EDTA抗凝全血样本进行处理，参照说明书操作流程为：

a.使用前，将Lysis Buffer和Stabilizing Buffer分别轻微颠倒混匀，避免产生大量气泡。

b.将2μL待裂解全血样本置于离心管中，加入20μL的Lysis Buffer，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底。

c.室温(20～25℃)孵育3min。

d.加入20μL的Stabilizing Buffer，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底，完成DNA裂解溶液的制备。

3)以灭菌超纯水代替本发明提供的全血样本处理液，按照实施例2中2.2的步骤对同样的2份EDTA抗凝全血样本进行处理。

经本对比例1)、2)、3)处理后的样本作为模板进行GAPDH基因荧光PCR检测，检测流程同实施例1中1.3～1.5。

1.2结果分析

使用本发明提供的全血样本处理液、市售全血样本常温裂解液、灭菌超纯水对同样的2例EDTA抗凝全血样本进行处理，处理后的样本作为模板进行GAPDH基因荧光PCR检测，检测结果如图10。结果表明使用本发明提供的全血样本处理液处理后的样本，其荧光PCR扩增的Ct值和荧光值明显优于使用市售产品和灭菌超纯水处理的样本。

与市售产品A公司的全血样本常温裂解试剂相比，本发明提供的血液直接荧光PCR检测方法具有以下优点：

1)操作流程更少、操作更加便捷

2)设备需求更简单；

3)成本更低；

4)荧光PCR扩增效率更高。

实施例3：基于通用发卡探针的血液直接荧光PCR检测方法

本实施例以对人外周血中药物代谢酶CYP2C19基因的c.681G>A(CYP2C19*2)位点进行血液直接荧光PCR扩增为例，对基于通用发卡探针的血液直接荧光PCR方法进行说明。

3.1全血样本处理液配制

同实施例2中2.1。

3.2样本处理

同实施例2中2.2。

3.3CYP2C19*2检测引物及探针设计

通用发卡探针序列为：

K15B：5’-BHQ1-GAGCGATCTGTCCATGTACTCGC/i6FAMdT/C-3’

K16B：5’-BHQ1-GACCGTGTAGCTGTAGATGACGG/iHEXdT/C-3’

CYP2C19:c.681G>A位点侧翼核苷酸序列

检测c.681A碱基上游引物CYP2C19-681A-F序列为：

5’-

检测c.681G碱基上游引物CYP2C19-681G-F序列为：

5’-

下游通用引物CYP2C19-681-R序列为：

5’-GAAGCAATCAATAAAGTCCCGAGG-3’；

其中，小写字母为所要检测的SNP位点碱基，斜体字母为ARMS引物中引入的错配碱基，下划线部分为与通用发卡探针匹配的标签序列。引物和探针设计完成后，由上海生工进行合成。

3.4引物混合液配制

合成好的引物干粉经离心、溶解、定量、标准化至100μM后，按照表4中的体积要求配制引物混合液Primer Mix，配制完成后于-20℃保存备用。

表4引物混合液配制

3.5 2×qPCR Mix混合液配制

2×qPCR Mix混合液按照表5配方进行配制，以配制1mL 2×qPCR Mix混合液为例：在1个1.5mL的无菌离心管中依次加入10×PCR Buffer溶液200μL、1M海藻糖溶液400μL、DMSO溶液60μL、10mg/mL BSA溶液20μL、25mM dNTP溶液16μL、5μM ROX溶液16μL、100mMMgCl

表5 2×qPCR Mix混合液

3.6荧光PCR反应体系配制

CYP2C19:c.681G>A位点血液直接荧光PCR检测体系的配制按表6进行：在200μL的PCR管中依次加入2×qPCR Mix 10μL、Primer Mix 0.20μL、K15B-FAM(10μM)0.30μL、K16B-HEX(10μM)0.24μL、灭菌ddH

表6通用发卡探针法血液直接荧光PCR检测体系配制

3.7上机检测

将配制好荧光PCR检测体系的PCR管放置在天隆Gentier 48E荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。按照表7设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增。反应结束后，根据扩增曲线划定合适基线和荧光阈值，参考用户指南，读取Ct值，进行结果判读。

表7仪器核酸扩增参数

3.8结果分析

使用本发明实施例3提供的通用发卡探针血液直接荧光PCR检测方法对EDTA抗凝血液样本中的CYP2C19:c.681G>A位点进行检测，结果如图11，当无模板对照(NTC)无扩增信号，质控合格时，按照以下标准对样本的CYP2C19:c.681G>A位点的结果进行判读：1)当Ct(FAM)>30，Ct(HEX)≤30时，检测结果为GG基因型；2)当Ct(FAM≤30，Ct(HEX)≤30时，检测结果为GA基因型；3)当Ct(FAM)≤30，Ct(HEX)>30时，检测结果为AA基因型；4)当Ct(FAM)>30，Ct(HEX)>30时，检测失败，需重新检测。

验证例：Sanger测序法验证血液直接荧光PCR检测方法准确性

选取3例基因型分别为GG、GA、AA的血液样本，提取基因组DNA，设计引物对3例样本的CYP2C19:c.681G>A位点进行Sanger测序。CYP2C19:c.681G>A位点扩增引物上游引物CYP2C19-2-F序列为5’-GGAGGATGGAAAACAGAGACT-3’，下游引物CYP2C19-2-R序列为5’-GTGAGGCTGACCATACAAACA-3’，并使用下游引物进行Sanger测序，测序交由上海生工完成，测序结果见图11。

测试结果表明，使用本发明提供的血液直接荧光PCR检测方法对EDTA抗凝血液样本中的CYP2C19:c.681G>A位点进行检测，其三种基因型的检测结果与Sanger测序结果完全一致，本发明血液直接荧光PCR检测方法具有较高的准确性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。