用于诊断脑白质病变的生物标志物F7及其应用

摘要

本发明提供了用于诊断脑白质病变的生物标志物及其应用，该生物标志物为神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))（Cer(d18:0/24:1(15Z))）。该生物标志物神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))与胆固醇‑α‑D‑葡萄糖苷（Cholesteryl‑alpha‑D‑glucoside）组合，并结合6Z,9Z,20‑二十碳三烯酸（6Z,9Z,20‑Heneicosatriene）、大麻黄素A（Cannflavin A）、葫芦素E（Cucurbitacin E）或胆固醇酯22:6（22:6 Cholesterol ester）来判断是否存在脑白质病变。一种用于诊断脑白质病变的生物标志物，用于制备诊断脑白质病变的检测试剂，有助于诊断是否存在脑白质病变的倾向，提前预防。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及用于诊断认脑白质病变的生物标志物及其应用。

背景技术

脑白质病变（white matter lesion, WML）是一种常见的神经退行性疾病，最典型的病理表现为脑白质完整性破坏或脱髓鞘变化，该病常见于脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、精神分裂症等多种疾病中。脑白质是中枢神经系统的重要组成部分，是神经纤维聚集的地方，脑白质中的中枢神经细胞的髓鞘损害，则会引起脑白质病变。而脑白质对各种有害刺激的典型反应是脱髓鞘变化，它可以是神经系统疾病如感染、中毒、退行性变、外伤后、梗塞缺乏等的继发表现。脑白质病变主要引起患者脑白质病变、言语障碍、精神行为异常、步态障碍、排尿障碍等症状，严重影响患者健康生活质量。它与中风和痴呆风险的增加密切相关。随着影像技术的不断进展，脑白质病变的检出率越来越高。目前已公认，年龄为脑白质病变的明确危险因素。有研究发现，在60～70岁的人群中，脑白质病变检出率达87%；80～90岁人群中脑白质病变的检出率高达95%～100%，而高血压、糖尿病、血脂异常、代谢紊乱等因素也与脑白质病变的发病和进展密切相关，而这些代谢性疾病也主要发生在在高龄人群中。随着我国老龄化社会的到来，脑白质病变的危害逐渐引起医学界重视。一般情况下，多数脑白质病变患者的病情是可逆的，所以对于脑白质病变患者采取适当的预防措施，其症状可明显改善，其中早期筛查是至关重要的手段。

脑白质病变的诊断包括精神状态检查和影像学检查，目前常用的颅脑检查手段包括电子计算机断层扫描及磁共振成像。其中初步精神状态检查包括评价注意力不集中的试验、鉴定记忆力障碍的三词延迟回忆试验、评价视觉功能障碍的时钟绘画和评价脑功能的交替运动序列等操作。而脑白质病变在早期临床上可无症状。并且测试过程涉及到需要提问和回答，消耗非常大的医学资源，耗时耗力。随着影像学技术的不断发展，脑白质病变的检出率逐渐增加。但检测需用到的设备昂贵，且花费较大。目前尚无准确性高，特异性强的脑白质病变外周血生物标志物。脑白质病变的发病机制尚不清楚，临床上缺乏明确有效的治疗靶点，不利于脑白质病变患者的治疗和恢复。

代谢组学是一门新兴的组学技术，在生物学研究中发挥着越来越重要的作用，因为它能够揭示机体细胞代谢的独特化学指纹特征。代谢组学作为一种无偏的小分子代谢物研究方法，为发现更多的脑白质病变的生物标志物提供了希望。越来越多的证据表明神经系统疾病，伴随着胆汁酸，脂肪酸和氨基酸的紊乱。并且这些结果证明代谢紊乱可能预示着脑白质病变的发生。但具体哪种物质能明确检出作为预测和诊断脑白质病变的发生还不清楚。

发明内容

为了能有效预测和和诊断脑白质病变，本发明提供了用于诊断脑白质病变的生物标志物。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

用于诊断脑白质病变的生物标志物，其特征在于，该生物标志物为经酰胺(d18:0/24:1(15Z))（Cer(d18:0/24:1(15Z))）。

如上所述的诊断脑白质病变的生物标志物在制备检测试剂中的应用。

如上所述的应用，优选地，所述生物标志物神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))组合胆固醇-α-D-葡萄糖苷（Cholesteryl-alpha-D-glucoside），并结合6Z,9Z,20-二十碳三烯酸（6Z,9Z,20-Heneicosatriene） 、大麻黄素A（Cannflavin A）、葫芦素E（Cucurbitacin E）或胆固醇酯22:6（22:6 Cholesterol ester）来判断是否存在脑白质病变。

如上所述的应用，优选地，所述神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))记为F7，胆固醇-α-D-葡萄糖苷的含量记为F1，6Z,9Z,20-二十碳三烯酸的含量记为F2，当含量的单位均为mg/L时，根据计算公式TC= 9.470-2.564×F7+13.203×F1-15.253×F2计算TC值，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.930，则判定为脑白质病变；若TC＜0.930，则为正常。

如上所述的应用，优选地，所述神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))记为F7，胆固醇-α-D-葡萄糖苷的含量记为F1，大麻黄素A记为F4，当含量的单位均为mg/L时，根据计算公式TC=3.580-2.689×F7+9.487×F1-6.079×F4计算TC值，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.383，则判定为脑白质病变；若TC＜0.383，则为正常。

如上所述的应用，优选地，所述神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))记为F7，胆固醇-α-D-葡萄糖苷的含量记为F1，葫芦素E的含量记为F5，当含量的单位均为mg/L时，根据计算公式TC= 0.3711-2.3128×F7+5.8871×F1-1.8116×F5计算TC值，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.178，则判定为脑白质病变；若TC＜0.178，则为正常。

如上所述的应用，优选地，所述神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))记为F7，胆固醇-α-D-葡萄糖苷的含量记为F1，胆固醇酯22:6的含量记为F6，当含量的单位均为mg/L时，根据计算公式TC= -0.4784-1.6754×F7+6.0304×F1-1.9504×F6计算TC值，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.299，则判定为脑白质病变；若TC＜0.299，则为正常。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种诊断脑白质病变的生物标志物，神经酰胺 (d18:0/24:1(15Z))组合胆固醇-α-D-葡萄糖苷，并结合6Z,9Z,20-二十碳三烯酸 、大麻黄素A、葫芦素E 或胆固醇酯22:6来判断是否存在脑白质病变。可应用于诊断试剂盒中，有助于诊断是否存在脑白质病变的倾向，可用于提前预防。

附图说明

图1为正（A）负（B）离子模式下VIP＞1的样本;

图2为正（A）负（B）离子模式下(O)PLS-DA的得分图;

图3 为正（A）负（B）离子模式下S-plot图；

图4为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F7+F1+F2）；

图5 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F7+F1+F4）；

图6 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F7+F1+F5）；

图7为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为F7+F1+F6）。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

样本

模型建立样本群112人，年龄范围：45岁以上，其中对照人群64人，患者人群48人。

对照人群中的男女比例为1：1， 磁共振成像检测显示无异常。

患者人群中的男女比例为1：1，磁共振成像检测显示脑白质出现梗死灶。

实验仪器及试剂

实验仪器：1. 漩涡振荡器：型号MX-S，Scilogex公司，美国； 2. 高分辨质谱仪：ESI-QTOF/MS；型号：Xevo G2-S Q-TOF；厂家：Waters, Manchester, UK3. 冷冻离心机：型号D3024R，Scilogex公司，美国；4.超高效液相色谱：UPLC，型号：ACQUITY UPLC I-Class系统；厂家：Waters, Manchester, UK；5.数据采集软件：MassLynx4.1; Waters；6.分析鉴定软件：Progenesis QI; Waters。

实验试剂：异丙醇，甲酸，甲酸氨，乙腈，甲酸钠亮氨酸脑啡肽；厂家均为Fisher。

实验方法

1.样品前处理

收集样本人群的血清样本在冰上解冻，200μL的血浆用600μL的预冷异丙醇萃取，涡流1min，室温孵育10min，然后将萃取混合物在-20℃下储存过夜，4000r离心20min后，将上清液转移到新的离心管之后，用异丙醇/乙腈/水(按2：1：1，v：v：v)稀释至1：10。样品在LC-MS分析前，保存在-80℃。此外，还将每个萃取混合物的10μL组合在一起制备混合血浆样品。

2. 脂质组学的超高效液相色谱-质谱联用方法

样品用ACQUITY UPLC连接到带有ESI的Xevo-G2XS高分辨飞行时间的质谱仪进行分析。采用CQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×10 0 mm，1.7μm，Waters)，流动相为10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-乙腈(A，乙腈：水的体积比为60：40)和10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-异丙醇-乙腈(B，异丙醇：乙腈的体积比为90：10)。在大规模研究之前，进行了10分钟、15分钟和20分钟洗脱期的中试实验，以评估流动相组成和流速对脂质保留时间的潜在影响。在正离子模式(PIM)中，丰富的脂质前体离子和碎片以相同的顺序分离，具有相似的峰形和离子强度。此外，具有10分钟洗脱期的混合质控样品也表现出与测试样品相似的前体和碎片的基峰强度。流动相流速为0.4mL/min。该柱最初用40%B洗脱，然后在2分钟内线性梯度到43%B，然后在0.1min内将B的百分比增加到50%。在接下来的3.9分钟内，梯度进一步增加到54%B，然后B的量0.1分钟内增加到70%。在梯度的最后部分，B的量在1.9分钟内增加到99%。最后，溶液B在0.1分钟内返回到40%，并且在下一次进样之前将色谱柱平衡1.9分钟。每次进样量为5μL，用QTOF质谱仪检测正负两种模式下的脂质，采集范围为 m/z50~1200年，采集时间为0.2s/次。离子源温度为120℃，去溶温度为600℃，气体流量为1000L/h，以氮气为流动气体。毛细管电压为2.0kV(+)/锥体电压为1.5kV(-)，锥体电压为30V。以亮氨酸脑啡肽进行标准质量测定，用甲酸钠溶液进行校正。样品被随机排序。每10个样本注入一个质控样本并进行分析，以调查数据的重复性。

结果分析：

1.利用多元统计学寻找血清差异物质

采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和 PLS-DA方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。VIP值为PLS-DA第一主成分的变量重要性投影，如图1为所示，通常以VIP>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一，其中，A正离子模式，B为负离子模式；图2为脑白质病变组和对照组两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好，说明此方案可以使用其中，A为正离子模式下(O)PLS-DA的得分图，B为负离子模式下(O)PLS-DA的得分图。图3为S-plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05,VIP>1的条件下，负离子模式有125个差异物，正离子模式有174个差异物，其中，A为正离子模式下S-plot图，B为负离子模式下S-plot图。

2.约登指数分析

为了进一步缩小范围，将VIP阈值提高到2，同时体现正常和患者之间的倍数差异在0.5倍以下，或者增加2.5倍以上，

然后对他们进行youden 约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，结果如下表1：

表1脑白质病相关脂质的约登指数分析

表1列出来单个代谢物预测脑白质病变的曲线下面积（AUC）、特异性和敏感度。

3. 样本人群十折交叉验证结果

为提高种变量化合物的生物诊断效果，需要根据上述生物标志物找出适合的模型进行行下一步的分析。将样本人群随机分为10份，选择1份为验证集，其他为训练集，如此反复十次，考察最佳的变量组合。将十次的结果，包括AUC，敏感度，特异性都取平均值，并进行统计学显著性计算，结果如下表2。

表2

组合之间，AUC值并没有显著性p<0.05差异。

基于上述建立逻辑回归模型A-F如下：

"模型A" 变量为上述F7+F1+F2，计算公式为：TC= 9.470-2.564×F7+13.203×F1-15.253×F2，计算TC值，公式中F7为神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))，F1为胆固醇-α-D-葡萄糖苷，F2为6Z,9Z,20-二十碳三烯酸，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.930，则判定为脑白质病变；若TC＜0.930，则为正常。

"模型B" 变量为上述F7+F1+F4，计算公式为：TC= 3.580-2.689×F7+9.487×F1-6.079×F4，计算TC值，公式中F7为神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))，F1为胆固醇-α-D-葡萄糖苷，F4为大麻黄素A，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.383，则判定为脑白质病变；若TC＜0.383，则为正常。

"模型C" 变量为上述F7+F1+F5，计算公式为：TC= 0.3711-2.3128×F7+5.8871×F1-1.8116×F5，计算TC值，F7为神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))，公式中F1为胆固醇-α-D-葡萄糖苷，F5为葫芦素E，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.178，则判定为脑白质病变；若TC＜0.178，则为正常。

"模型D" 变量为上述F3+F1+F6，计算公式为：TC= -0.4784-1.6754×F7+6.0304×F1-1.9504×F6，计算TC值，公式中F7为神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))，F1为胆固醇-α-D-葡萄糖苷，F6为胆固醇酯22:6，根据TC值预测脑白质病变：若TC≥0.299，则判定为脑白质病变；若TC＜0.299，则为正常。

4．外部数据集，逻辑回归模型验证

通过外部人群的数据集验证上述结果的准确性，并绘制相应的ROC曲线图。结果如下：

验证人群：200人（外部人群），取样标准同上面所述的样本人群，磁共振成像检测无异常有100人，磁共振成像检测显示脑白质出现梗死灶有100人。进行逻辑回归模型验证：

"模型A" 变量为上述F7+F1+F2，结果如图4，敏感性=1，特异性=1，准确度=1。

"模型B" 变量为上述F7+F1+F4，结果如图5，敏感性=1，特异性=1，准确度=1。

"模型C" 变量为上述F7+F1+F5，结果如图6，敏感性=1，特异性=1，准确度=1。

"模型D" 变量为上述F7+F1+F6，结果如图7，敏感性=1，特异性=1，准确度=1。

数据显示：F7为神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))自身，神经酰胺(d18:0/24:1(15Z))与胆固醇-α-D-葡萄糖苷组合，以及结合其他四种生物标志物6Z,9Z,20-二十碳三烯酸，大麻黄素A，葫芦素E和胆固醇酯22:6都表现出非常高的诊断能力，敏感性、特异性、准确度均为100%，未来都能进行临床试剂盒的应用。

通过对样本信息的对比分析可知：以上7种生物标志物，与正常组相比，F1和F3在脑白质病变组均呈上升趋势，F2、F4、F5、F6和F7则相反。