免疫刺激剂及预防感染的方法

摘要

本发明提供含有葡聚糖的具有免疫刺激效果的免疫刺激剂。免疫刺激剂为水不溶性，其包含源自酵母细胞壁的葡聚糖和脂质，且葡聚糖和脂质的总含有率为80质量％以上，脂质相对于葡聚糖的含有比为0.1以上且0.4以下。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫刺激剂及预防感染的方法。

背景技术

近年，耐药菌的世界性蔓延令人担忧。世界卫生组织(WHO)指出家畜用抗生素的滥用是原因之一，畜产业界寻求抗生素的代替品，即，寻求针对感染的解决方案。提高生物体原本具有的免疫功能作为感染对策是有效的，作为具有免疫刺激效果的材料认知度较高的β-葡聚糖备受期待。

与上述相关，在日本专利特表2017-511122号公报中记载了一种处理酵母细胞壁获得可溶于二甲基亚砜的β-葡聚糖的方法。在日本专利特开2009-263333号公报记载了一种包含硒强化酵母和β-葡聚糖的组合物，认为具有免疫刺激性作用。在日本专利特开2004-099580号公报中记载了一种将酵母菌体进行自溶处理而制备的免疫增强组合物。日本专利特开2003-169607号公报中记载了一种添加有将酵母进行自溶处理而获得的酵母分解组合物的鱼贝类饲养用饲料，认为提高了免疫活性。

发明概述

发明要解决的问题

包含β-葡聚糖的材料在市场上流通的较多，但根据产品不同而品质差异较大，具有也存在许多无法担保功能性的产品等问题。因此，本发明的一个实施方式的目的在于提供含有葡聚糖，且具有免疫刺激效果的免疫刺激剂。

用于解决问题的方法

本发明的第一实施方式是免疫刺激剂，其为水不溶性，其包含源自酵母细胞壁的葡聚糖和脂质，且葡聚糖和脂质的总含有率是80质量％以上，且脂质相对于葡聚糖的含有比为0.1以上且0.4以下。在一个实施方案中，α-葡聚糖相对于β-葡聚糖的含有比可以是0.2以上且0.85以下。在一个实施方案中，免疫刺激剂包含甘露聚糖，且甘露聚糖的含有率可以是5质量％以下。在一个实施方案中，可以对鱼类使用免疫刺激剂。

第二实施方式是包含上述免疫刺激剂的饮品、食品或饲料。第三实施方式是对鱼类的感染预防剂，其包含葡聚糖和脂质，且葡聚糖和脂质的总含有率是80质量％以上。第四实施方式是预防感染的方法，其包括将上述免疫刺激剂施用至对象。

第五实施方式是源自酵母的葡聚糖的制备方法，其包括：准备经自溶处理的包含酵母细胞壁的组合物，将包含酵母细胞壁的组合物进行碱水解处理而获得水解物，和从水解物中回收葡聚糖。

在一个实施方案中，包含酵母细胞壁的组合物是通过包括将酵母进行自溶处理而获得自溶物，和将自溶物进行离心分离处理的方法获得的。在一个实施方案中，碱水解处理是在碱金属氢氧化物的存在下加热进行的。在一个实施方案中，源自酵母的葡聚糖的甘露聚糖的含有率为5质量％以下。在一个实施方案中，源自酵母的葡聚糖的蛋白质的含有率为10质量％以下。在一个实施方案中，源自酵母的葡聚糖的葡聚糖含有率的变异系数为10％以下。

发明效果

根据本发明的一个实施方式，可以提供含有葡聚糖且具有免疫刺激效果的免疫刺激剂。

附图简述

图1是显示促进猪白细胞的活性氧类的产生的能力的图。

图2是显示促进人类嗜中性细胞样细胞的活性氧类的产生的能力的图。

图3是显示对虹鳟的弧菌病感染试验的生存率的图。

具体实施方式

在本说明书中，“步骤”这一术语不仅指独立的步骤，即使在不能与其他步骤明确区分的情形下，只要实现了该步骤的预期目的，则包含于本用词中。另外，对组合物中各组分的含量而言，在组合物中存在复数种相当于各组分的物质的情形下，只要没有特别说明，则意指存在于组合物中的该复数种物质的合计量。进一步地，各组分的含量是免疫刺激剂的干物换算的值，也可以是平均值。此处将含量设为平均值是因为考虑到制备批次间的差异，例如为对任意选择的6个以上试样的算术平均值。作为算出平均值的试样数的上限，例如为20个以下。以下详细地说明本发明的实施方案。但是，以下所示的实施方案是用以使本发明的技术思想具体化而例示的，本发明不限定于以下所示的免疫刺激剂等。

免疫刺激剂

免疫刺激剂包含葡聚糖和脂质，葡聚糖和脂质的总含有率为80质量％以上。本实施方案的免疫刺激剂具有良好的品质稳定性和明确的免疫刺激效果。由此，不仅期待抑制家畜、人、养殖鱼等的感染的患病、进展，也可以提供减轻产生耐药菌的威胁的方法。优选地，构成免疫刺激剂的葡聚糖和脂质例如为源自酵母细胞壁的、将酵母细胞壁水解处理而获得的那些。水解处理包含碱水解、酸水解。

构成免疫刺激剂的葡聚糖是D-葡萄糖通过糖苷键连接的聚合物，包括β-葡聚糖和α-葡聚糖。β-葡聚糖例如具有β-1,3键合的直链的主链骨架及β-1,6键合的分支的侧链。另外，α-葡聚糖例如具有α-1,4键合的直链的主链骨架及α-1,6键合的分支的侧链。

免疫刺激剂中的葡聚糖的总含有率例如为60质量％以上，优选地为65质量％以上，更优选地为70质量％以上，并例如为90质量％以下，优选地为85质量％以下，更优选地为80质量％以下。

免疫刺激剂中的β-葡聚糖的含有率例如为30质量％以上，优选地为35质量％以上或40质量％以上，并例如为65质量％以下，优选地为60质量％以下或50质量％以下。另外，α-葡聚糖的含有率例如为10质量％以上，优选地为15质量％以上或20质量％以上，并例如为40质量％以下，优选地为35质量％以下或30质量％以下。

免疫刺激剂中的α-葡聚糖含量相对于β-葡聚糖含量的比例如为0.2以上且0.85以下，优选地为0.25以上、0.3以上、0.4以上、0.45以上或0.5以上，又，优选地为0.8以下、0.7以下或0.6以下。当α-葡聚糖相对于β-葡聚糖的含有比为上述范围，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。

免疫刺激剂中的脂质包括由醇和脂肪酸进行酯键合而形成的单纯脂质；为在分子中包含磷酸、糖、蛋白质等的脂质的复合脂质；以及由单纯脂质或复合脂质通过水解而衍生的衍生脂质。免疫刺激剂中的脂质的总含有率例如为3质量％以上，优选地为5质量％以上或10质量％以上，并例如为20质量％以下，优选地为16质量％以下或14质量％以下。当脂质的含有率为上述范围内，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。

免疫刺激剂中的葡聚糖和脂质的总含有率为80质量％以上，优选地为82质量％以上。并例如为95质量％以下，优选地为90质量％以下或88质量％以下。当葡聚糖和脂质的总含有率为上述范围内，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。

免疫刺激剂中的脂质的总含量相对于葡聚糖的总含量的比例如为0.1以上且0.4以下，优选地为0.12以上或0.15以上，并例如为0.3以下，优选地为0.25以下或0.2以下。当脂质相对于葡聚糖的含有比为上述范围，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。

除葡聚糖和脂质以外，免疫刺激剂也可以进一步包含甘露聚糖。甘露聚糖是以D-甘露糖为主要结构单元的多糖类。在免疫刺激剂包含甘露聚糖的情形，甘露聚糖的含有率例如为5质量％以下，优选地为3质量％以下或1.2质量％以下，并例如为0.1质量％以上，优选地为0.2质量％以上或0.3质量％以上。当甘露聚糖的含有率为上述范围，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。免疫刺激剂中的甘露聚糖的总含量相对于葡聚糖的总含量的比而言，例如为0.004以上且0.05以下，优选地为0.005以上或0.008以上，并优选地为0.02以下或0.018以下。

除葡聚糖和脂质以外，免疫刺激剂也可以进一步包含蛋白质。在免疫刺激剂包含蛋白质的情形，蛋白质的含有率例如为10质量％以下，优选地为8质量％以下或6质量％以下，并例如为1质量％以上，优选地为2质量％以上或3质量％以上。当蛋白质的含有率为上述范围，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。

免疫刺激剂中的甘露聚糖和蛋白质的总含量相对于葡聚糖的总含量的比而言，例如为0.01以上且0.2以下，优选地为0.02以上或0.05以上，并优选地为0.1以下或0.09以下。

免疫刺激剂也可以进一步包含灰分。在免疫刺激剂包含灰分的情形，灰分的含有率例如为10质量％以下，优选地为6质量％以下或4质量％以下，并例如为1质量％以上，优选地为1.5质量％以上或2质量％以上。当灰分的含有率为上述范围，则有免疫刺激活性进一步增强的倾向。

免疫刺激剂的各组分的含量可以通过常规方法测定。例如，葡聚糖的含量可以通过对使葡聚糖水解而生成的葡萄糖进行定量来测定。另外，脂质的含量可以通过酸分解法进行定量。

免疫刺激剂的品质稳定性优异。免疫刺激剂的质量的稳定性例如可以通过起因于制备批次不同的各组分的含有率的偏差进行评价。具体而言，通过各组分的含有率的变异系数(％)进行评价。变异系数(％)是对任意选择的6个以上的试样，测定免疫刺激剂的各组分的含有率，而算出含有率的算术平均值和标准偏差，作为用标准偏差除以算术平均值而得的值的百分率而算出。免疫刺激剂中的葡聚糖的总含有率的变异系数(％)例如为10％以下，优选地为8％以下或不到5％。另外，脂质的含有率的变异系数(％)例如为20％以下，优选地为15％以下或8％以下。进一步地，葡聚糖和脂质的总含有率的变异系数(％)例如为6％以下，优选地为5％以下或不到5％。另外，变异系数的下限值为0％，但实质上为大于0％的值。

除作为主要成分的葡聚糖和脂质以外，免疫刺激剂还可以进一步包含具有免疫调节作用的公知成分。作为具有免疫调节作用的成分，可以例举例如：甜茶提取物、岩藻糖胶、阿拉伯木聚糖、乳铁蛋白、儿茶素、壳聚糖、低聚壳聚糖、几丁质寡糖、L-抗坏血酸、辅酶Q

在免疫刺激剂中，根据需要，可以调配通常已知可用于药物、食品、饲料等的任意成分，例如水、油脂、糖类、维生素类、甜味剂、调味料、酸味剂、防腐剂、香料、色素、赋形剂、增量剂、粘合剂、增稠剂、稳定剂、乳化剂、pH调节剂等。

免疫刺激剂的形态可为粉末、颗粒等固体、液体、糊剂等中的任一种。另外，免疫刺激剂的剂型可以根据施用方法、施用对象等适当选择。作为剂型，可以例举例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖锭剂、散剂、液体剂等经口施用制剂。这些制剂可以使用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂等添加剂根据公知的方法制备。另外，也可以使含有免疫刺激剂而构成健康食品、健康辅助食品等食品组合物、饮料组合物、饲料等。

当将免疫刺激剂施用至脊椎动物等施用对象，则在对象中显现出免疫刺激作用。由此，可以抑制对象的感染的发病。即，免疫刺激剂可以应用于对象的感染的预防方法。作为成为施用对象的脊椎动物，可以例举哺乳动物、鸟类、鱼类等。哺乳动物可以包括人类，也可以是除了人类以外的哺乳动物。作为除了人类以外的哺乳动物，除猪、牛、马、羊、猴以外，还可以例举狗、猫等宠物动物等。作为鸟类，可以例举肉鸡、蛋鸡、火鸡、鸭、鸽等。另外，作为鱼类，可以例举鲑鱼、鳟鱼、山女鳟鱼(Oncorhynchus masou)、红点鲑、远东哲罗鱼等鲑科鱼类、鲤鱼、鲫鱼、罗非鱼、鲶鱼、日本花鲈、鰤鱼、高体鰤、幼鰤鱼、比目鱼、鲷鱼、金枪鱼、鳗鱼等。

在免疫刺激剂作为药物或饮品，食品施用的情形，例如可以以每次1mg至500mg(干燥重量)/kg体重的量1天1次至数次经口施用。另外，在作为饮品，食品、饲料等使用的情形下，可以在每100g饮品，食品、饲料等中添加0.1g至1g。

在将免疫刺激剂作为饲料施用的情形，例如对哺乳动物、鸟类、鱼类而言，可以以相对于施用的饵为0.001质量％以上且1质量％以下进行混合所得的饵，一天施用1次至数次。

免疫刺激剂的制备方法

免疫刺激剂例如可以利用以酵母细胞壁为原料的如下所述的制备方法制备。免疫刺激剂的制备方法例如包含用酸水溶液或碱水溶液水解处理酵母细胞壁而获得水解物的水解步骤、和从水解物回收含有葡聚糖的组合物的回收步骤。即，免疫刺激剂可以为包含源自酵母的葡聚糖的组合物。

此处，供进行水解步骤的酵母细胞壁也可以利用预处理步骤进行预处理。在预处理步骤中，包括使成为原料的酵母自溶而获得自溶物的自溶步骤、对成为原料的酵母进行热水提取而获得热水提取物的热水提取步骤、对成为原料的酵母进行酶处理而获得酶处理物的酶处理步骤等预分解步骤，对自溶物、热水提取物、酶处理物等预分解物进行离心分离而获得酵母细胞壁的第1离心分离步骤等。

作为成为原料的酵母，可以例举例如：酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyberomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、球拟酵母属(Torulopsis)等酵母，优选地为选自由这些所组成的组中的至少1种，更优选为酵母属酵母。作为酵母属酵母，例如包括酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、贝酵母(S.bayanus)等，可以为选自由这些所组成的组中的至少1种。另外，酵母根据其用途，也称为啤酒酵母、威士忌酵母、蒸馏酒酵母、面包酵母、葡萄酒酵母、清酒酵母、生物乙醇酵母等，可以为选自由这些所组成的组中的至少1种。成为原料的酵母可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。

在自溶步骤中，利用酵母本身的蛋白酶等将酵母的蛋白质等分解而获得自溶物。自溶步骤例如将pH调节为2至7，将温度调整为40℃以上且65℃以下，在1小时以上且48小时以下进行。在第1离心分离步骤中，将自溶物进行离心分离而以重液形式获得包含酵母细胞壁的级分。对于离心分离，例如在工业生产中，可以使用喷嘴型离心机、间歇排出型离心机、夏普勒斯(Sharples)型离心机等，只要可以回收自溶物中的不溶性成分即可，可以适当调整离心分离的条件。

在水解步骤中，对酵母细胞壁，例如使用碱水溶液进行水解处理而获得水解物。作为碱水溶液，例如使用包含氢氧化钠等碱金属氢氧化物的水溶液。碱水溶液的浓度例如为0.01质量％以上且10质量％以下，优选地为0.1质量％以上且5质量％以下，更优选地为1质量％以上且3质量％以下。水解处理的温度例如为70℃以上且100℃以下，优选地为85℃以上且95℃以下。水解处理的时间例如为1小时以上且48小时以下，优选地为4小时以上且24小时以下。

对回收步骤而言，例如在必要的情形下，包括将水解物进行中和而获得中和物的中和步骤、将中和物或水解物进行离心分离而获得含有葡聚糖的组合物的第2离心分离步骤、和将含有葡聚糖的组合物干燥的干燥步骤。通过进行碱水解处理从酵母的自溶物等获得的酵母细胞壁，能够以稳定的品质制备包含葡聚糖和脂质的免疫刺激剂。

在中和步骤中，在碱水解物中添加酸性化合物而将pH调节为6.5至7.5，获得中和物。作为酸性化合物，可以使用盐酸、硝酸、硫酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸等有机酸。在第2离心分离步骤中，将中和物离心分离而以重液形式获得含有葡聚糖的组合物。对于离心分离，例如在工业生产中，可以使用喷嘴型离心机、间歇排出型离心机、夏普勒斯(Sharples)型离心机等，只要可以回收中和物或水解物中的不溶性成分即可，可以适当调整离心分离的条件。在干燥步骤中，干燥处理含有葡聚糖的组合物，获得免疫刺激剂。作为干燥条件，在工业生产中，可以使用喷雾干燥机、冷冻干燥机或滚筒干燥机等，条件可以适当调整。在干燥步骤之前，也可以设置将含有葡聚糖的组合物杀菌处理的杀菌步骤。杀菌步骤例如可以为使用UHT杀菌机，于120℃以上进行热处理10秒至60秒钟，可以适当调整以使得符合目标品质。

源自酵母的葡聚糖的制备方法

本实施方案的源自酵母的葡聚糖的制备方法包括：准备经自溶处理的包含酵母细胞壁的组合物的准备步骤；将包含酵母细胞壁的组合物进行碱水解处理而获得水解物的水解步骤；和从水解物回收葡聚糖的回收步骤。对将酵母菌体进行自溶处理而获得的酵母细胞壁进行碱水解所得到的源自酵母的葡聚糖显示良好的品质稳定性，每个制备批次的质量的差异得到抑制。另外，对所制备的源自酵母的葡聚糖而言，葡聚糖的回收率良好，且充分地去除了甘露聚糖、蛋白质等杂质。源自酵母的葡聚糖的制备方法也可以为源自酵母的葡聚糖的纯化方法。

在准备步骤中，准备经自溶处理的包含酵母细胞壁的组合物。包含酵母细胞壁的组合物可以自市售品中适当选择而准备，也可以制备具有所需的构成的包含酵母细胞壁的组合物而准备。成为原料的酵母为如上所述。

包含酵母细胞壁的组合物例如可以用这样的方法制备，所述方法包括将成为原料的酵母菌体进行自溶处理而获得自溶物的自溶步骤、和将自溶物进行离心分离处理的第1离心分离步骤。关于自溶步骤和第1离心分离步骤的详细情况，如上所述。

在获得包含酵母细胞壁的组合物的方法中，在自溶步骤之前，也可以将成为原料的酵母菌体纯化处理。纯化处理例如包括通过利用振动筛过筛成为原料的酵母菌体从而去除夹杂物，于pH值9至11的碱性条件下清洗等。

在水解步骤中，使用碱水溶液水解处理酵母细胞壁而获得水解物。关于水解步骤的详细情况，如上所述。

在回收步骤中，从水解物回收葡聚糖。回收步骤中获得的葡聚糖例如以含有葡聚糖的组合物的形式获得。关于回收步骤的详细情况，如上所述。

源自酵母的葡聚糖的制备方法达成良好的葡聚糖的回收率，并且甘露聚糖、蛋白质等的去除率优异。葡聚糖的回收率是通过以下算出：将所获得的源自酵母的葡聚糖中所包含的葡聚糖的总量，除以经自溶处理的包含酵母细胞壁的组合物中所包含的葡聚糖的总量而算出。另外，甘露聚糖的去除率是通过以下算出：将从经自溶处理的包含酵母细胞壁的组合物中所含的甘露聚糖的总量中，减去在获得的源自酵母的葡聚糖中所含的甘露聚糖的总量而得的去除量，除以经自溶处理的包含酵母细胞壁的组合物中所含的甘露聚糖的总量而算出。关于蛋白质等的去除率，也为相同的方式。

源自酵母的葡聚糖的制备方法中的葡聚糖的回收率例如为65％以上，优选地为70％以上或75％以上。另外，葡聚糖的回收率的上限例如为95％以下，优选地为90％以下或85％以下。

源自酵母的葡聚糖的制备方法中的甘露聚糖的去除率例如为85％以上，优选地为90％以上或95％以上。另外，甘露聚糖的去除率的上限例如为100％以下，优选为不到100％。

源自酵母的葡聚糖的制备方法中的蛋白质的去除率例如为80％以上，优选地为85％以上或90％以上。另外，蛋白质的去除率的上限例如为100％以下，优选地为不到100％或98％以下。

作为另一方面，本发明包含免疫刺激方法，所述免疫刺激方法包括将免疫刺激剂或源自酵母的葡聚糖施用至对象。另外，作为另一方面，本发明还包含免疫刺激剂或源自酵母的葡聚糖的用途，用于免疫刺激方法或感染的预防方法的组合物的制备中；免疫刺激剂或源自酵母的葡聚糖的用途，用于免疫刺激方法或感染的预防方法中；用于免疫刺激方法或感染的预防方法中的免疫刺激剂或源自酵母的葡聚糖。免疫刺激方法或感染的预防方法的对象可以为已述的脊椎动物，包括哺乳动物、鸟类、鱼类等。

实施例

以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

免疫刺激剂的制备方法1

准备源自于Asahi Group Foods股份有限公司的栃木小金井工厂制备的属于酵母属(Saccharomyces)的啤酒酵母的酵母细胞壁(固体成分15％；源自酵母的自溶物)，将其进行水解处理。具体而言，在包含酵母细胞壁的浆料中，以最终浓度成为约1.5质量％或约2.0质量％的方式添加氢氧化钠，加热至90℃进行4小时水解处理。用盐酸将处理后的酵母细胞壁浆料调节为pH 7.0后，使用高速冷却离心机(BECKMAN COULTER公司制备的Avanti J-26SXP)，进行8,000g×10分钟的分批式离心分离。向沉淀添加1.5L蒸馏水，悬浮后在上述条件下进行离心分离。重复本操作4次，并用冷冻干燥机(EYELA公司制备的FDU-2100)将沉淀进行干燥2夜以上，获得了免疫刺激剂。

免疫刺激剂的制备方法2

准备源自于Asahi Group Foods股份有限公司的栃木小金井工厂制备的属于酵母属(Saccharomyces)的啤酒酵母的酵母细胞壁(固体成分15％；源自酵母的自溶物)，将其进行水解处理。具体而言，在包含酵母细胞壁的浆料中，以最终浓度成为约1.5质量％或约2.0质量％的方式添加氢氧化钠，加热至90℃进行4小时水解处理。用盐酸将处理后的酵母细胞壁浆料调节为pH 7.0后，通过喷嘴式连续离心分离机(Alfa Laval公司制备的FEUX512T-31C-50及FEUX412U-31C-50)一边加水一边进行固液分离，所获得的重液于130℃40秒的条件进行杀菌，继而用滚筒干燥机干燥，获得了免疫刺激剂。

葡聚糖的分析方法1

秤量约0.6g试样，添加4mL 72(w/w)％硫酸后，于室温搅拌1小时。其后，使用Milli-Q(注册商标)水，将硫酸浓度调整为4(w/w)％，于121℃反应1小时。冷却后使用氢氧化钠水溶液进行中和。在定容后进行过滤，将滤液进行HPLC。柱为Wakopak(注册商标)Wakosil(注册商标)5NH

葡聚糖的分析方法2

秤量约0.5g试样，添加25ml 0.08mol/l磷酸缓冲液(pH值6.0)，添加0.1mlTermamyl 120L(Novozymes公司)，在沸腾水浴中反应30分钟。放置冷却后，使用0.275mol/l氢氧化钠溶液将pH调节为7.5±0.1，使蛋白酶(Sigma-Aldrich公司，P-5380)于60℃作用30分钟。放置冷却后，使用0.325mol/l盐酸将pH调节为4.3±0.1，使淀粉葡萄糖苷酶(Sigma-Aldrich公司，A-9913)于60℃作用30分钟。在酶处理后的液体中添加4倍量的95％乙醇，放置1小时以上。在装入有硅藻土的过滤器中流入液体，进行抽滤。用乙醇、丙酮清洗残渣。回收残渣，添加5ml 72(w/w)％硫酸，于20℃分解4小时。添加水使硫酸变为4(w/w)％，在沸腾水浴中分解2小时。在放置冷却后进行中和、定容、过滤。通过葡萄糖氧化酶法定量了滤液中的葡萄糖，求出葡萄糖浓度，乘以0.9，算出β-葡聚糖的含有率。

α-葡聚糖的含有率是从分析方法1中求出的葡聚糖的总含有率中，减去β-葡聚糖的含有率而算出。

脂质的分析方法

通过酸分解法进行定量。在所取的试样中添加2ml乙醇和10ml浓盐酸，于70℃至80℃的恒温槽内进行分解处理30分钟至40分钟。其后，将试样移至莫氏管(Mojonnier tube)，混合乙醇和二乙醚，再混合石油醚。回收醚层，向水层再添加二乙醚与石油醚的混合液进行了分配。回收醚层，水层再一次使用二乙醚和石油醚进行分配，回收醚层。将二乙醚、石油醚蒸馏去除后，于105℃干燥1小时，将干燥前后的重量差作为脂质量，根据试样获取量算出脂质的含有率。

甘露聚糖的分析方法

秤量约0.6g试样，添加4ml 72(w/w)％硫酸，于室温搅拌1小时。其后，添加Milli-Q(注册商标)水，使硫酸浓度变为4(w/w)％，于121℃水解1小时。放置冷却后进行中和、定容，以与上述的葡聚糖的分析方法同样地定量了滤液中的甘露糖的含量。算出试样中的甘露糖浓度，乘以0.9，由此算出甘露聚糖含有率。

蛋白质的分析方法

试样中的蛋白质的含有率用燃烧法定量。使用全氮测定装置(Sumika ChemicalAnalysis Service)进行分析。将试样取至石英舟中，将反应炉的温度设定为870℃以上，将还原炉的温度设定为600℃，将检测器的温度设定为100℃，将柱的温度设定为70℃进行了分析。将检测出的氮气定量，乘以氮、蛋白质换算系数6.25，算出蛋白质含有率。

灰分的分析方法

试样中的灰分的含有率通过直接灰化法定量。将试样取至磁制坩埚中，进行了预灰化。其后，于550℃下进行灰化。在硅胶干燥器内放置冷却后，进行秤量。将灰化前后的重量差设为灰分量，根据试样获取量算出灰分含有率。

关于利用上述制备方法获得的14个样品的免疫刺激剂，将进行成分分析的结果示于表1。另外，表1所示的各组分的含有率是以质量基准算出的免疫刺激剂的干物换算值。另外，表1中的葡聚糖的含有率是α-葡聚糖和β-葡聚糖的总含有率，下文相同。

[表1]

作为参考例，关于以β-1,3/1,6-葡聚糖为主成分的市售的免疫刺激剂(以下也称为“市售品A”)，获取了制备批次不同的9个样品，同样地进行而进行了组分分析。将各组分的含有率的平均值、标准偏差及变异系数(％)示于表2。表2所示的各组分的含有率为质量基准的干物换算值。

[表2]

如表1所示，免疫刺激剂的脂质和葡聚糖的总含有率的平均值为80质量％以上，并且样品间的含有率的差异较小。另一方面，如表2所示，市售品A的脂质和葡聚糖的总含有率的平均值不到80质量％，样品间的差异较大。

然后，对上述获得的免疫刺激剂和市售品A，评价了对于白细胞的促进活性氧类(ROS)产生的能力。

对于猪白细胞的促进ROS产生的能力

从由10周龄的断奶幼猪收集的末梢血液分取了单核细胞。具体而言，将添加有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中悬浮的末梢血单个核细胞(PBMC)播种于96孔板，使得为2×10

如图1所示，在两个不同制备批次的免疫刺激剂#5、#6中，在100μg/mL至400μg/mL的全部添加浓度中，ROS产生量多于市售品A。另外，免疫刺激剂#5的葡聚糖和脂质的总含有率为85.4质量％，免疫刺激剂#6的葡聚糖和脂质的总含有率为83.9质量％。

对于人类白细胞的促进ROS产生的能力

根据Collins等人的方法(Collins SJ，Ruscetti FW，Gallagher RE，Gallo RC，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，2458-2462，1978)，将人类白血病细胞株HL-60于添加有1.25体积％的二甲基亚砜和10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养6天，分化诱导为嗜中性细胞样细胞。将于上述培养基中悬浮的HL-60嗜中性细胞样细胞以4×10

如图2所示，本发明的免疫刺激剂#14在100μg/mL至800μg/mL的全部添加浓度中，ROS产生量多于市售品A。此时所使用的免疫刺激剂#14的葡聚糖和脂质的总含有率为83.8质量％。

虹鳟的弧菌病感染试验

用以免疫刺激剂#4或市售品A的最终浓度成为0.2质量％的方式分散混匀而成的饲料分别饲养25条平均体重2g的虹鳟。自饲养开始7天后，将通过PBS稀释至9×10

注射后第7天的生存率是阴性对照组(无处理)为64％，免疫刺激剂施用组为76％，市售品A施用组为68％。此时所使用的免疫刺激剂#4的葡聚糖和脂质的总含有率为81.3质量％。

如图3所示，与市售的免疫刺激剂相比，本发明的免疫刺激剂显示了更高的生存率。

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