重组CD1限制性T细胞及方法

摘要

用重组RNA分子转染T细胞，该重组RNA分子编码CD1b限制性T细胞受体的α链和β链中的至少一条。优选地，将如此制备的T细胞用作基于细胞的治疗组合物以治疗结核病。

说明书

本申请要求2018年8月8日提交的序列号为62/716,292的我们共同未决的美国临时专利申请的优先权，并且将其通过引用并入本文中。

名为102719.0013PCT_ST25、大小为8KB的序列表的ASCII文本文件创建于2019年7月19日，通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，将其内容通过引用以其整体并入。

技术领域

本发明的领域是基于细胞的免疫疗法，尤其是涉及表达CD1b限制性T细胞受体的至少一部分的基因修饰的T细胞的用途。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

CD1b向相应的CD1b限制性T细胞呈递了多种结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)衍生的脂质，这些脂质包括分枝菌酸、葡萄糖单霉菌酸酯、甘油单霉菌酸酯、二酰化磺基糖脂、脂阿拉伯甘露聚糖和磷脂酰肌醇甘露糖苷。分枝菌酸构成结核分枝杆菌细胞包膜的主要脂质成分，并且通常被认为是结核分枝杆菌毒力因子。

值得注意的是，在结核分枝杆菌感染的个体的血液和疾病部位已经发现了分枝菌酸特异性CD1b限制性T细胞，并且健康或分枝杆菌感染的个体的一些CD1限制性T细胞系表现出细胞毒性并且产生IFN-γ和TNF-α，它们对于建立针对结核分枝杆菌的保护性免疫非常重要。最近，已分离出各种CD1b限制性T细胞受体，并对它们与CD1b及结合的脂质组分的相互作用进行了表征(参见Nature Communications[自然通讯]2017,DOI:10.1038/ncomms13257)。

为了产生治疗结核分枝杆菌感染的治疗组合物，如CA 2202680或CA 2323733所述，可以将CD1呈递的抗原制备成疫苗。类似地，为了建立可以开发的CD1靶向疫苗，产生了表达人第1组CD1分子(hCD1Tg)和CD1b限制性、分枝菌酸特异性TCR的转基因小鼠(eLife2015；DOI:10.7554/eLife.08525.001)。尽管这些是在概念上简单且有吸引力的方法，但有效的疫苗仍然难以得到。在又另一种已知方法中，可以将来自各种供体的CD1b限制性T细胞扩增至相对较大的数量(参见例如，US 2003/0153073)，但是这种扩增通常需要复杂的过程，并且通常不适合于临床环境。

因此，仍然需要针对细菌抗原，并且尤其是针对与结核分枝杆菌有关的抗原具有所需特异性的修饰的T细胞的改进的组合物、方法和用途。

发明内容

本发明主题涉及重组T细胞，并且尤其是初级T细胞的各种组合物、方法和用途，用编码CD1b限制性T细胞受体的α和β链的核酸转染这些重组和初级T细胞。有利地，此类重组T细胞适合作为用于治疗结核病的基于细胞的治疗剂。

在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种包括重组RNA分子的基因修饰的T细胞，该重组RNA分子编码CD1b限制性T细胞受体的α链和β链中的至少一条。优选地，该重组RNA分子编码CD1b限制性T细胞受体的α链和β链两者，并且特别优选的CD1b限制性T细胞受体是克隆18CD1b限制性T细胞受体。因此，优选的CD1b限制性T细胞受体将包括根据SEQID NO:1-4的序列中的至少一种。此外，优选的重组RNA分子是包括至少一种IRES序列的双顺反子或多顺反子mRNA分子。合适的T细胞尤其包括自体T细胞和/或初级T细胞。

在另外设想的方面，重组RNA分子至少暂时偶联至聚合物颗粒，该聚合物颗粒在T细胞内是任选地可降解的。例如，该聚合物颗粒的设想的聚合物包括聚(β-氨基酯)或壳聚糖。当需要时，该聚合物颗粒可进一步偶联至第二mRNA，该第二mRNA编码能够降解该聚合物颗粒的聚合物的酶(例如，壳聚糖酶)。

在本发明主题的另一方面，诸位发明人还设想了一种药物组合物，该药物组合物包含适于注射的液体载体和多个悬浮于该载体中的如上所述的基因修饰的T细胞。例如，设想的药物组合物可以具有至少10

因此，还设想了基因修饰的T细胞在治疗结核病中的用途，其中该基因修饰的T细胞包含重组RNA分子，该重组RNA分子编码CD1b限制性T细胞受体的α链和β链中的至少一条。优选地，但不是必须地，该CD1b限制性T细胞受体是克隆18CD1b限制性T细胞受体，和/或该基因修饰的T细胞是自体T细胞。

在本发明主题的又另一方面，诸位发明人设想了一种产生基因修饰的T细胞的方法。此类方法将典型地包括获得或提供多个T细胞，并且刺激这些多个T细胞的步骤；以及用重组RNA分子转染这些经刺激的T细胞的另一步骤，该重组RNA分子编码CD1b限制性T细胞受体的α链和β链中的至少一条。

优选地，这些多个T细胞是初级T细胞，其可以是或可以不是自体细胞。通常进一步优选的是，在转染之前刺激这些多个T细胞(例如，用CD3-CD28修饰的珠)。此外，设想使用偶联至该重组RNA分子的多个聚合物颗粒转染这些经刺激的T细胞。应当注意，这些聚合物颗粒可全部为相同类型，或包含至少两种不同类型的聚合物颗粒。

另外，设想这些多个聚合物颗粒在经刺激的T细胞中是可降解的，和/或这些聚合物颗粒缺乏靶向部分，这些靶向部分特异性将这些颗粒靶向至T细胞的组分。用于设想的颗粒的合适的聚合物材料包括聚(β-氨基酯)和壳聚糖。当需要时，该聚合物颗粒可进一步偶联至(例如，包被)第二且不同的mRNA，该第二且不同的mRNA可以编码能够降解该聚合物颗粒的聚合物的酶。

优选地，进行转染使得表达CD1b限制性T细胞受体的所有细胞中的至少40％、或至少50％、或至少60％是活细胞。同样，优选地进行转染使得所有细胞中的至少20％或至少30％表达CD1b限制性T细胞受体。如先前所述，重组RNA分子编码CD1b限制性T细胞受体(并且优选的(但不是必须地)是克隆18CD1b限制性T细胞受体)的α链和β链。因此，可以将重组RNA配置为双顺反子或多顺反子RNA，并且包括至少一种IRES序列。在其他合适的序列中，CD1b限制性T细胞受体可以包含根据SEQ ID NO:1-4的序列中的至少一种。

本发明主题的多个对象、特征、方面和优点将根据以下关于优选实施例的详细描述以及附图而变得更清楚。

附图说明

图1是描绘使用靶向性和非靶向性PBAE纳米颗粒对经刺激的和未经刺激的T细胞进行T细胞转染的示例性结果的图。

图2是描绘使用靶向性和非靶向性PBAE纳米颗粒对经刺激的T细胞进行T细胞转染的示例性结果的图。

图3是描绘使用靶向性和非靶向性PBAE纳米颗粒对经刺激的和未经刺激的初级T细胞进行T细胞转染的示例性结果的图。

图4是描绘使用CD3-CD28珠对T细胞进行刺激的示例性结果的图。

图5是描绘使用靶向性和非靶向性PBAE纳米颗粒对GFP在经刺激的和未经刺激的初级T细胞中表达的示例性结果的图。

图6是描绘使用靶向性和非靶向性PBAE纳米颗粒对经刺激的和未经刺激的初级T细胞的活力和GFP表达的示例性结果的图。

图7是壳聚糖/壳聚糖酶纳米颗粒转染的示例性示意图。

图8是一个描绘使用壳聚糖纳米颗粒和各种培养基对HEK293T细胞的活力以及GFP表达的示例性结果的图。

图9是另一个描绘使用壳聚糖纳米颗粒和各种培养基对HEK293T细胞的活力以及GFP表达的示例性结果的图。

图10是另一个描绘使用壳聚糖纳米颗粒和各种培养基对HEK293T细胞的活力以及GFP表达的示例性结果的图。

图11是用于产生壳聚糖酶mRNA的示例性载体图谱。

图12是另一个描绘使用各种纳米颗粒和培养基条件对HEK293T细胞的活力以及GFP表达的示例性结果的图。

图13是又另一个描绘使用各种纳米颗粒和培养基条件对HEK293T细胞的活力以及GFP表达的示例性结果的图。

图14描绘了TCR 18α链的示例性核酸和蛋白序列。

图15描绘了TCR 18β链的示例性核酸和蛋白序列。

具体实施方式

发明人现已发现，功能性CD1b限制性T细胞受体在T细胞并且尤其是人初级T细胞中的表达可用于产生用于治疗结核病的基于细胞的治疗剂。值得注意的是，使用如下文更详细地描述的各种方案，可以以相对较高的速率和活力转染T细胞(特别是初级T细胞或自体T细胞)。

最典型地，但不是必须地，用于转染的T细胞获得自急性感染结核分枝杆菌的患者。在大多数情况下，按照方案使用磁珠分离从全血中分离T细胞(例如，用针对CD2和/或CD3的抗体包被)，并且可以进一步培养此类分离的T细胞以扩增细胞群。优选地，使用颗粒相关的mRNA进行转染，该mRNA编码对分枝菌酸具有高特异性的CD1b限制性T细胞受体(TCR)的α和β链两者。例如，尤其合适的TCR是克隆18(例如，Nature Communications[自然通讯]2016,DOI:10.1038/ncomms13257)T细胞受体。用RNA转染后，将T细胞进一步培养(以及任选地进一步刺激)，然后施用于同一患者。

当然，应当理解，结核分枝杆菌患者的感染的特定性质不限于本发明主题，并且本文明确设想了感染的所有形式，该感染包括肺结核(例如，潜伏的/休眠的、急性和慢性)以及肺外结核病(例如，胸膜感染、脑膜感染、泌尿生殖系统感染、和淋巴系统的感染)。此外，应当注意该患者无需是人，而实际上可以是任何受结核分枝杆菌感染的哺乳动物。

另外，设想CD1b受体不必限于分枝菌酸的结合，但所有其他CD1b呈递配体(尤其是微生物脂质)也被认为是合适的。例如，合适的序列变异和特异性改变在其他地方进行了描述(例如，Nature Communications[自然通讯]2017,DOI:10.1038/ncomms 13257)。因此，许多其他微生物也可用本文所述的重组T细胞来靶向。同样，应当理解，除CD1b以外的许多CD1限制性TCR可以在如本文所述的T细胞中表达，并且尤其设想的亚型包括CD1a、CD1c、CD1d、和CD1e。因此，应当注意，所有限制性TCR可以按如本文所述的方式在T细胞中表达，以增加/扩增患者‘先天性免疫’池。

在尤其优选的实例中，重组TCR将具有或包括克隆18CD1b限制性T细胞受体的序列部分。其中TCR将仅包括该序列的一部分，用于α链的Vα、Jα、Cα片段，和/或Vα中的CDR1和2，和/或CDR3中的任何一个或多个被认为适合于在此使用。同样，用于β链的Vβ、Jβ、Dβ、Cβ片段，和/或Vβ中的CDR1和2，和/或CDR3中的任何一个或多个被认为适合于在此使用。例如，特别优选的序列包括图14和15中所示的那些(描绘为SEQ ID No:1-4)，或其任何部分。因此，编码CD1b限制性TCR的重组核酸包括克隆18TCR的α和/或β链、或具有修饰的部分以适应特定脂质抗原(参见例如，Nature Communications[自然通讯]2017,DOI:10.1038/ncomms13257；或Nat Immunol.[自然免疫学]2013年7月；14(7):706-713)。

此外，应当注意T细胞的性质也可以显著变化，并且合适的用于转染的T细胞包括自体(相对于患者)T细胞、初级T细胞、培养的T细胞、来自T细胞培养的T细胞(通常会在施用前进行辐照)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、和与接受者具有组织相容性的T细胞。因此，T细胞分离的方式可以有相当大的变化，并且合适的分离方案将包括使用针对CD23、CD3、CD4、和/或CD25的抗体经由磁珠或FACS分离。进一步已知的方案在其他地方进行了描述(参见例如，JVis Exp.[可视实验杂志]2010；(40):2017)。

在较不优选的方面中，还设想宿主细胞是除T细胞以外的其他细胞，并且尤其优选的替代性细胞包括各种细胞毒性免疫感受态细胞，如NK细胞或iNK细胞。然而，在这种情况下，这些细胞将需要进一步的基因修饰(经由其他基因工程的转染)以实现CD3γ、δ、ε、和ζ链中的一条或多条的共表达。

无论用于转染的细胞的特定类型如何，通常优选地，重组核酸是RNA，优选地构建为双顺反子或多顺反子RNA，其包括一个或多个IRES序列用于α和β链的协同表达。然而，单顺反子RNA也被认为是合适的，尽管其较不优选。并且较不优选的转染包括用DNA(无论是作为基因编辑的修饰还是作为染色体外的)的那些。仍进一步设想的转染核酸包括病毒载体。

优选地，使用一种或多种类型的偶联至一个或多个RNA分子的纳米颗粒，在经刺激的(例如，使用CD3/CD28免疫磁珠)T细胞上将T细胞进行转染。在特别优选的方面，这些纳米颗粒在T细胞内是可降解的，典型地以酶促方式。例如，尤其优选的纳米颗粒的聚合物是聚(β-氨基酯)(参见例如，Methods Mol Biol.[分子生物学方法]2009；480:53-63)和壳聚糖(参见例如，Mol.Pharmaceutics[分子药物学]2017,14,2422-2436；或InternationalJournal of Nanomedicine[国际纳米医学杂志]2010:5 473-481)。如将容易理解的，如下文更详细地讨论，这些纳米颗粒可以是靶向的(例如，用结合CD3的抗体或抗体片段)或‘裸的’(未靶向的)。替代性地，可以使用电穿孔进行T细胞的转染(参见例如，MolecularTherapy[分子疗法]第13卷,第1期,第151-159页,2006年1月)，或化学转染，如核因子(Nucleofactor)或Amaxa试剂盒(商购于龙沙公司(Lonza)，美国新泽西州艾伦代尔州(Allendale，NJ，USA))。

一旦制备了转染的T细胞，典型地在适于注射的水性载体中优选地配制此类细胞以用于输注给患者。例如，用于输注的典型溶液将包括至少10

以下描述为本领域普通技术人员提供了本文所述重组细胞的制备和用途的示例性指导。然而，这些实例不应被解释为限制本发明主题。

为了研究T细胞刺激和转染类型对T细胞针对各种抗原应答的影响，用与如下两种类型RNA相关的‘裸’非靶向性PBAE(聚(β-氨基酯))纳米颗粒分别转染T细胞：编码克隆18TCR的RNA(具有克隆18TCRα和β链的双顺反子构建体)和编码GFP(绿色荧光蛋白)的RNA。在这种情况下，通过将分离的T细胞与抗CD3和抗CD28抗体(Immunocult人CD3/CD28 T细胞激活剂，干细胞技术公司(Stemcell Technologies))的混合物一起培养24小时，然后在转染前在未补充的培养基中再培养24小时来实现刺激。通过首先将PBAE和RNA两者分别溶解在酸性乙酸钠缓冲液中，然后以适当的比例将PBAE溶液添加到RNA溶液中并通过涡旋快速混合，来制备PBAE-RNA纳米颗粒。在纳米颗粒形成5分钟后，将它们添加至培养中的T细胞中24小时。在一些情况下，然后，将这些转染的T细胞与人外周血单核细胞衍生的树突状细胞一起共培养，在一些另外的情况下，还添加克隆18TCR的配体。这些是分枝菌酸或结核分枝杆菌的提取物。培养约24小时后，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量培养基中存在的干扰素γ的量。如从图1可以很容易地看出，刺激T细胞对用所有测试的CD1b配体(上方分图；分枝菌酸和TB提取物)转染的T细胞的干扰素γ分泌有显著影响。对对照肽pp65无影响。在GFP转染的对照组中也没有观察到对干扰素γ分泌的影响。这里，仅T表示T细胞，仅作为阴性对照；T+DC表示T细胞和树突细胞；分枝菌酸(Myc Acid)表示添加分枝菌酸作为单个已鉴定的Cd1b配体，而TB提取物表示结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的复杂混合物。将pp65肽用作非结合对照。

发明人还研究了将纳米颗粒靶向T细胞(这里为CD3靶向)是否对配体依赖性干扰素γ分泌具有任何影响。值得注意的是，如从图2中可以看出，使用CD3靶向纳米颗粒(PBAE)转染经刺激的T细胞对TB提取物提供了相似的影响，但对分枝菌酸的影响有所降低。更具体地，为了靶向纳米颗粒，将抗CD3单克隆抗体与聚阴离子聚谷氨酸(PGA)化学偶联，并将这些偶联物静电吸附到阳离子裸PBAE-RNA颗粒上。因此，与未靶向的转染相比，靶向转染没有提供实质的优点。

在又另外的实验中发明人研究了在刺激或不刺激T细胞的情况下靶向PBAE纳米颗粒的影响。图3描绘了示例性结果，其中经刺激的T细胞通过转染的T细胞提供实质性的干扰素γ分泌，靶向和非靶向之间的差异与如在图2中观察到的相同。对照转染在经刺激的和未经刺激的之间没有实质性差异(尽管同种型靶标(isotarget)转染中有一些IFN-γ分泌)。更具体地，通过用同种型抗体替代抗CD3抗体来制备同种型靶标颗粒，该同种型抗体不应特异地靶向任何细胞表面标记。

如图4所示，使用CD3-CD28免疫磁珠刺激T细胞，并且对所有类型的转染产生相似的应答。更具体地，图4显示了用CD3-CD28珠(代替CD1b/TB配体呈递性DC)处理的T细胞的ELISA结果，其作为阳性对照执行以诱导IFNγ产生并显示T细胞保留了该功能性。值得注意的是即使在这些条件下，也只有经刺激的细胞有应答。

在一组实验中也使用编码GFP的RNA证实了重组RNA的功能性表达，其中使用经刺激的和未经刺激的T细胞进行转染。在图5中可以看到代表性的结果，其中‘裸’PBAE纳米颗粒提供了最强的荧光信号。更具体地，如上所述，在转染后24小时收集T细胞，并在生命技术公司(Life Technologies)Attune NxT流式细胞仪上运行以测量GFP表达。

图6描绘了来自与图5相同实验的示例性结果。显示了T细胞活力和转染的结果，再一次使用PBAE纳米颗粒和编码GFP的RNA比较经刺激的T细胞和未经刺激的T细胞。在图6中，第一个条表示活细胞的百分比，而第二个条表示活细胞群中表达GFP的细胞的比例。

为了确定纳米颗粒的类型的影响，发明人还测试了具有相关RNA的壳聚糖纳米颗粒，其中这些壳聚糖颗粒进一步任选地被编码壳聚糖酶的RNA包被。用于制备此类颗粒的示例性示意图工作流程如图7所示。由于壳聚糖的正电荷，在纳米颗粒形成过程中RNA容易与壳聚糖缔合。一旦形成(或在形成期间)，该纳米颗粒可以暴露于第二类型的RNA(这里为编码壳聚糖的RNA)以如此用该纳米颗粒包被该第二RNA或以其他方式使该第二RNA与纳米颗粒缔合。应当理解，此方法提供了将RNA递送至细胞的纳米颗粒，在该细胞中RNA编码降解纳米颗粒的酶。因此，应当理解，可降解的纳米颗粒可以由可被酶选择性降解的材料制备。在这种方法中，然后将该纳米颗粒包被或以其他方式与编码可被酶选择可降解的材料的RNA缔合。根据RNA的释放动力学，可以控制纳米颗粒的降解动力学。

使用如所示的HEK293T和T细胞，使用具有单个RNA(编码GFP)的纯壳聚糖和具有包含核和壳RNA组分的编码GFP的RNA的壳聚糖核/壳颗粒递送纳米颗粒RNA的示例性结果如图8-10所示。更具体地，通过流式细胞术比较了在多种纳米颗粒和培养基条件下进行转染的转染效率和细胞活力。使用的培养基为磷酸盐缓冲液(PBS)、OptiMEM(OM)和干细胞技术公司(Stemcell Technologies)的Immunocult-XF T细胞扩增培养基(XF)。培养基的pH值也在6到8之间变化。壳聚糖-RNA复合物的N与P比率在单一复合物和核/壳纳米颗粒中也在4与16之间变化。

壳聚糖酶RNA是通过体外转录反应从可商购获得的质粒(pcDNA3.1+/c-(k)dyk)制备的，该质粒包含来自希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum)IMI349063(基因符号：CH63R_01899)的壳聚糖酶基因，如图11所示。

图12-13显示了壳聚糖酶mRNA与GFP mRNA经由核/壳壳聚糖复合物共同递送和单独递送的示例性结果。图12中的结果强调了培养基和纳米颗粒组合物的特定影响，而图13中的结果说明了纳米颗粒系统之间的示例性差异。更具体地，通过流式细胞术比较了以GFP或壳聚糖酶编码性RNA转染的HEK 293T细胞的转染效率和细胞活力，其中使用壳聚糖或PBAE作为载体，以及以GFP RNA为核RNA组分且以壳聚糖酶RNA为壳RNA组分的壳聚糖核/壳构型。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，表明所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或利用、或组合。如本文的说明书和随后的整个权利要求中所用，除非上下文清楚地另外指明，否则“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该(the)”的含义包括复数参照物。而且，如本文的说明书中所用，除非上下文清楚地另外指明，否则“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。