用于合成单金属纳米桥结构的方法以及通过使用其制造DNA点突变检测传感器的方法

摘要

本发明涉及：单纳米粒子生物传感器平台，包括其中生物分子固定在两个金属纳米晶种之间的金属纳米粒子，及包括单纳米粒子生物传感器平台的生物传感器；通过使用生物传感器检测突变的方法；以及用于制造单纳米粒子生物传感器平台的方法，包括形成其中生物分子固定在两个金属纳米晶种之间的金属纳米粒子的步骤。根据本发明的单纳米粒子生物传感器平台能够对靶标进行高度灵敏及可靠的检测，而且能够直接鉴别各种突变以便能够对突变进行有效诊断，进而可广泛地用于生物医学诊断领域及类似领域中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含金属纳米桥结构的单纳米粒子生物传感器平台及一种构建单纳米粒子生物传感器平台方法。更确切地说，本发明涉及一种包含金属纳米粒子的单纳米粒子生物传感器平台，每一个金属纳米粒子由两个金属纳米晶种(nanoseed)及固定于所述金属纳米晶种之间的生物分子组成；包含单纳米粒子生物传感器平台的生物传感器；使用生物传感器检测突变的方法；以及用于构建单纳米粒子生物传感器平台的方法，包含形成金属纳米粒子，每一个金属纳米粒子由两个金属纳米晶种及固定于所述金属纳米晶种之间的生物分子组成。

背景技术

许多疾病具有遗传成分；因此其检测需要清晰的了解生物医学诊断学中由突变引起的代谢病症。诊断基因突变的大部分方法依赖于测序，但采集突变信息的最佳方法可在没有序列的先验知识，理想地在无标记和活体外环境的假影的情况下判定突变碱基的存在和一致性。已努力找到一种具有与许多生物体中复制后错配修复(MMR)相反的系统的方法，其中根据利用纳米等离子(nanoplasmonic)生物传感器引入修复MutL和突变DNA的其它酶，错配修复(mismatch repair，MMR)起始蛋白质MutS以序列非特异性方式识别突变(马，X.(Ma，X.)，特龙，PL(Truong，PL)，安，N.H.(Anh，N.H.)以及希姆，S.J.(Sim，S.J.)，《生物传感器与生物电子学(Biosensors&Bioelectronics)》67，59-65(2015))。

纳米生物感测的可靠性通常由两个主要因素来确定：用于单一生产的纳米材料和用于靶标识别的生物分子，其与特定物理条件的检测灵敏度及选择性直接相关。在这些纳米材料当中，等离子体纳米粒子由于其与入射光相互作用并产生局部化表面等离子共振(LSPR)的能力而引起人们的兴趣。纳米结构中的电子以给定共振频率的集体振荡将局部折射率(RI)的变化转换为其吸收光谱和散射光谱的等离子带的偏移。感测尺寸可减小至单纳米粒子，进而有助于单纳米粒子感测(sNPS)；这类单NP感测(single-nanoparticlesensing，sNPS)可以纳米尺寸传递局部生物信息，其中检测极限(LOD)使用极小的感测体积达到可数数量的分子。相比之下，使用大量溶液或平坦表面的大部分其它感测技术展现出定位且分离感测元件的有限能力，并且受到缓慢的分子扩散、随机结合以及络合生物分子的频繁解离及随之而来的反应不平衡的限制，从而导致信号以低信噪比(signal-to-noise，S/N)波动。sNPS传感器为能够实现高通量及并行读数的微型探针，其中NP的结构和局部化感测体积/面积对于RI灵敏度来说是必需的。对具有不同形状的金纳米粒子(NP)的RI灵敏度的系统性研究表明棒状NP展现出对RI变化的最高灵敏度(特龙，P.L.，马，X.以及希姆，S.J.，《纳米尺寸(Nanoscale)》 6，2307-2315(2014))。近年来，已证实除了粒子形状之外，纳米间隙和纳米桥结构相关联并且通过等离子耦合产生较强的光信号，进一步增强局部场以产生不同的光谱响应(利姆，D.K. (Lim，D.K.)等人.《自然纳米技术(NatureNanotech.)》6，452-460(2011)；纳姆J.M.(Nam，J.M.)，欧，J.W.(Oh，J.W.)，李，H.(Lee，H.)以及苏荷，Y.D.(Suh，Y.D.)，《化学研究报告(Acc.Chem.Res.)》49，2746-2755(2016))。然而，合成具有预定结构的胶状等离子NP 具有挑战性，这是因为难以处理溶液中的瞬态原子。此外，化学合成的NP被限制为具有相同表面特征的高度对称形状(例如，纳米球、纳米棒、纳米立方体、纳米盘以及其它)。NP的结构可编程性可为克服sNPS在灵敏度和可再生性方面的局限性提供强有力的手段。近年来，两个研究小组在使用可编程生物分子(即，DNA)以低于5纳米精密度进行设计合成方面获得突破，进而通过在DNA模具中铸造(孙，W.(Sun，W.，)等人.《科学(Science)》346，1258361 (2014))或使用DNA框架(马，X.，等人.《自然通讯(Nat Commun)》7，(2016))产生精细定义的纳米等离子体粒子。

sNPS提供多种利用其与例如核酸或蛋白质的生物分子尺寸相当的大部分固有较小感测体积的应用。举例来说，MutS蛋白质为

因此，本发明的发明人已较早地并且集中地实施研究以解决现有技术的问题。因此，本发明人通过修改各DNA分子的两端以便结合至金纳米晶种并且以两个相反的方向使金结晶来成功的制备具有高RI灵敏度的Au桥接纳米粒子；以及发现包含Au桥接纳米粒子的单纳米粒子生物传感器平台可用于以高灵敏度及可靠性检测靶标并且根据MutS针对突变的相对活性而直接鉴别出各种突变。已基于这个发现实现了本发明。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明的一个目标是提供一种包含金属纳米桥结构的单纳米粒子生物传感器平台和一种包含单纳米粒子生物传感器平台的生物传感器。

本发明的另一目标是提供一种使用生物传感器检测突变的方法。

本发明的另一目标是提供一种用于构建单纳米粒子生物传感器平台的方法，包含形成金属纳米粒子，每一个金属纳米粒子由两个金属纳米晶种及固定于所述金属纳米晶种之间的生物分子组成；以及使用所述金属纳米粒子形成金属纳米桥结构。

解决问题的方法

本发明提供一种包含金属纳米桥结构的单纳米粒子生物传感器平台和一种包含单纳米粒子生物传感器平台的生物传感器。

本发明还提供一种使用生物传感器检测突变的方法。

本发明还提供一种用于构建单纳米粒子生物传感器平台的方法，包含形成金属纳米粒子，每一个金属纳米粒子由两个金属纳米晶种及固定于所述金属纳米晶种之间的生物分子组成；以及使用所述金属纳米粒子形成金属纳米桥结构。

本发明的效果

本发明的单纳米粒子生物传感器平台可用于不仅以高灵敏度及可靠性检测靶标，而且直接鉴别各种突变，从而实现突变的有效诊断。因此，本发明的单纳米粒子生物传感器平台可用于广泛范围的领域，包含生物医学诊断。

附图说明

图1示出单NP的RI灵敏度分析的示意性图示。LSPR波长响应于周围介质的RI变化而偏移。右侧的表示出介质的RI值。

图2示出AuNS-dsDNA-AuNS的制备和表征：a通过电泳分离的不同AuNS-ssDNA共轭物的凝胶图像。各条带表示固定到一个AuNS的一定数量的ssDNA。最左边的条带表示未结合DNA的裸纳米晶种；b ssDNA杂交之后通过电泳分离及鉴别的AuNS-dsDNA-AuNS的凝胶图像；以及c AuNS-dsDNA-AuNS的TEM图像。

图3示出sNPS系统：a基于通过白光照射进行单Au桥接NP的RLS及LSPR的sNPS 系统的详细配置；b检测腔室的示意图；c通过相机获取的腔室图像。标记粒子间间距比闪光点直径大约5倍的个别纳米粒子的位置并对所述个别纳米粒子进行分析；d腔室的SEM图像；e每分钟一次持续10分钟获取的Au桥接NP的原始光谱；以及f 10个原始光谱的洛伦兹拟合(Lorentzian fitting)显示出0.188纳米的峰值测量精密度。

图4示出感测特异性：a MutS与探针的对照实验。单NP的RLS光谱显示无明显的λ

图5示出显示出限制酶的活性位点的序列。MboI，5′-GATC-3′；AluI，5′-AGCT-3′；StyI， 5′-CCWWGG-3′。

图6示出在酶MboI、AluI以及StyI限制性消化之后的不同细胞系的BRCA1的计算分段图谱。使用软件GENETYX 4.0(Genetyx公司(Genetyx Corporation)，日本东京(Tokyo，Japan)) 进行分析。

图7示出三种限制酶的协同性消化前后的BRCA1 DNA的琼脂糖凝胶电泳的结果(显示于最右侧的DNA阶梯)。从乳癌细胞系MCF7和HCC1937，以及卵巢癌细胞系SNU251中萃取基因组DNA。

图8示出个别纳米粒子的等离子兴趣场(FOI)：a FOI及负载Au桥接NP的MutS的可用空间的示意图；b CCD图像的比例校准。一个像素的长度等于0.42微米；c FOI的高度(h)的图示；以及d LSPR峰偏移周期性的图示。以绿色标记的区域为短程折射率感测区，其中等式Δλ

图9示出具有高灵敏度和保真度的单纳米粒子(NP)生物传感器的制造：a用于鉴别单点DNA突变的sNPS的示意性图示；b Au桥接NP的代表性瑞利光散射(Rayleigh lightscattering；RLS)光谱及原位暗场显微镜图像。比例尺，1微米；c在DNA与MutS结合后的局部化表面等离子共振(LSPR)λ

图10示出每个Au桥接NP的探针平均负载量(N

图11示出等离子体纳米粒子(NP)于溶液中的设计合成：a经设计NP模型(上图；尺寸单位，纳米)和等离子共振电场模式(下图)的图示；b线性拟合局部化表面等离子共振(LSPR)波长偏移与NP周围环境的RI变化；c示出通过用NH

图12示出Au桥接NP的尺寸分布。使用ImageJ测量纳米结构的长度及直径。统计结果显示狭窄尺寸的分布。

图13示出八个单点突变的可鉴别检测：a对于MutS结合于各突变DNA及同源双链体的实时监测；以及b MutS与各点突变之间相互作用的速率常数的重绘曲线。

图14示出感测的可靠性：a对MutS以各种浓度结合于GT-突变DNA的实时监测；以及b速率常数对MutS浓度的依赖性。

图15为针对不同点突变的MutS亲和力的图谱。通过单Au桥接NP感测MutS与八个不同突变之间可数数量的结合事件来创建图谱。将来自人类乳癌细胞HCC1937及卵巢癌细胞SNU251的BRCA1中关于潜在点突变的存在及类型的信息的诊断结果输入到图谱中，从而分别预测+C及A-C的突变。

图16示出用本发明中研发的八个sNPS芯片对BRCA1点突变的诊断结果：a-h将来自人类乳癌细胞系HCC1937的样本作为分析物进行检测。来自MCF7的样本用作对照。临床样本在监测期间产生较大的Δλ

图17示出使用5382insC探针对来自细胞系HCC1937的BRCA1中的突变进行检测。全部实验是一式三份地进行。将k

图18示出DNA测序结果。与细胞系MCF7的BRCA1序列(没有点突变的阴性对照)相比，HCC1937序列展现出单个胞嘧啶插入。

图19示出来自卵巢癌细胞系SNU251的DNA样本的用户指定基因组区域中点突变的诊断。分析位于染色体17的长臂的区域2条带1上的43047665处的靶标，一式三份。将k

图20示出DNA测序结果。与细胞系MCF7的BRCA1序列(没有点突变的阴性对照) 相比，SNU251序列展现出单个G＞A取代。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文中使用的术语为熟知的且通常在所属领域中采用。

在一个方面，本发明涉及一种金属纳米桥结构，具体地包含金属纳米粒子的金属纳米桥结构，每一个金属纳米粒子由两个金属纳米晶种(nanoseed)及固定于所述金属纳米晶种之间的生物分子组成；以及一种包含金属纳米桥结构的单纳米粒子生物传感器平台。

在另一方面，本发明涉及一种用于构建单纳米粒子生物传感器平台的方法，包含形成金属纳米粒子，每一个金属纳米粒子由两个金属纳米晶种及固定于所述金属纳米晶种之间的生物分子组成；以及使用所述金属纳米粒子形成金属纳米桥结构。

在本发明中，金属优选地是由以下组成的群组中选出：金(Au)、铜(Cu)、铂(Pt)以及钯(Pd)，优选地为金(Au)。

在本发明中，金属纳米晶种是由以下组成的群组中选出：纳米球(nanosphere)、纳米棒 (nanorod)、纳米棱柱(nanoprism)以及纳米板(nanoplate)。

在本发明中，生物分子是由以下组成的群组中选出：单链DNA、双链DNA、DNA寡聚物、RNA寡聚物、质粒DNA、多肽以及蛋白质，优选地为双链DNA。

在本发明中，金属纳米晶种优选地具有25纳米或小于25纳米的直径。

在本发明中，生物分子优选地具有30纳米或小于30纳米的长度。

本发明方法更包含在金属纳米粒子的表面上用还原剂还原金属离子以生长金属纳米粒子。

在本发明中，还原剂为羟胺(NH

在另一方面，本发明涉及一种包含单纳米粒子生物传感器平台的生物传感器。

本发明的生物传感器包含蛋白质，优选地错配修复起始蛋白质(mismatch repairprotein， MutS)。MutS是指识别核酸分子中的错配并且可结合至错配位点的蛋白质。MutS另外还包含野生型蛋白质，所述野生型蛋白质具有其中取代、缺失、添加和/或插入一或多个胺基酸的胺基酸序列，只要其可识别错配即可。

本发明的生物传感器具有比纳米棒高的折射率(refractive index，RI)灵敏度。RI灵敏度定义为LSPR峰偏移相对于粒子周围介质的折射率变化的相对变化。在下文的实例部分中，根据本发明的金属纳米桥结构的RI灵敏度经确认高于纳米棒的RI灵敏度，已知所述纳米棒的 RI灵敏度高于其它纳米结构的RI灵敏度。

本发明的生物传感器用以检测突变，尤其点突变。

本发明的生物传感器用以指定样本中BRCA1突变的类型。

在又一方面，本发明涉及一种使用生物传感器检测突变，尤其点突变的方法。

本发明方法用以通过错配修复起始蛋白质(MutS)与突变核酸分子的结合分析来鉴别蛋白质，优选地突变。

用于实施本发明的模式

[实例]

将参考以下实例更具体地解释本发明。本领域的技术人员应了解，这些实例仅为示出性的且本发明的范围不理解为限于所述实例。因此，应通过所附权利要求和其等效物来限定本发明的真实范围。

实例1：构建单纳米粒子感测平台及使用单纳米粒子感测平台检测点突变

使用金纳米晶种(AuNS；5纳米)溶液(英国生物细胞国际公司(British BioCellInternational)，英国克拉姆林(Crumlin，UK))、洗涤/存储缓冲液(具有0.02％NaN

[表2]

执行具有球形、棒状以及二聚体形状的纳米结构的建模及光学模拟并且使用软件COMSOL桥接NP。NP是由Au组成；粒子尺寸(dimension)设定为均匀的以便于进行比较。根据实验中合成的产物测定最终尺寸。在局部介电环境中执行光学模拟，其中制备不同重量比的水-甘油混合物以使得周围介质的RI介于1.333至1.443范围内(图1)。

将全部5′硫醇修饰的寡核苷酸用1∶100比率的寡核苷酸OD比DTT溶液培育15分钟并且用乙酸乙酯纯化两次。5′-硫醇的双硫键裂解成活性巯基形式并且立即与Au表面共轭。在与溶液中的DNA共轭之前，AuNS涂布有双(对磺酸根苯基)苯基膦二水合物二钾(BSPP；100毫升AuNS溶液与100毫克BSPP混合10小时)以提高AuNS对高度离子环境的耐受性。随后将AuNS溶液与NaCl混合，这会使得颜色从暗红色变为淡紫色。溶液以500×克离心30分钟且将沉淀物再悬浮于1毫升的0.5毫摩尔浓度BSPP中。在添加0.5毫升甲醇后，溶液的颜色再次从暗红色变为淡紫色；通过离心(30分钟，500×克)收集AuNS并将其溶解于1毫升0.5× TBE缓冲液中。将AuNS的浓度增加到若干微摩尔浓度，如用紫外光-可见光-近红外光谱仪 (UV-3600；日本京都岛津(Shimadzu，Kyoto，Japan))所测量；根据制造商的说明书，1 OD的 5纳摩尔浓度AuNS等于每微升有5.00×10

将金前体(HAuCl

sNPS系统的总体配置展示于图3a中。为构建检测腔室，将显微镜载玻片(22×40×0.1 毫米；华纳仪器(Warner Instruments))涂布有第一接触清洁聚合物(光子清洁技术(Photonic Cleaning Technologies))，所述第一接触清洁聚合物在固化15分钟后立即剥离掉。将载玻片用王水溶液冲洗整夜；在用超纯水冲洗之后，将载玻片浸没于5％(v/v)3-氨基丙基三乙氧基硅烷/纯乙醇中15分钟，接着在超纯水中超声处理5分钟。这个过程重复三次。将3微升体积的经稀释Au桥接NP溶液(OD～0.05)以液滴形式添加于硅烷化载玻片上，接着在室温下培育 1分钟。随后在生物防护罩中用超纯水及乙醇洗涤载玻片以最小化气载残渣的污染，并最终用氮气吹干。将载玻片放置在封闭槽成像微流体腔室(RC-30；华纳仪器)中，所述腔室组装于平台控制器(三月屋传感技术公司(Marzhauser Sensotech)，德国韦茨拉尔(Wetzlar，Germany)) 上并且与实现快速扰动溶液混合的流动装置以及流速控制系统(PHD 2000；哈佛设备(Harvard Apparatus)，美国马萨诸塞州霍利斯顿(Holliston，MA，USA))连接。用感测系统获得腔室中各NP的图像及瑞利散射特性(图3b)。用彩色相机(D50；尼康(Nikon)，日本东京(Tokyo， Japan)获得配备有100W卤素来源(型号7724，菲利普斯(Philips))、暗场干聚光器(NA＝ 0.80-0.95；尼康)以及100×物镜(CFI Plan FluorELWD，NA＝0.6；尼康)的倒置显微镜(Eclipse TE2000-U；尼康)视场的图像，仅分析粒子间间距比闪光点直径大约5倍的个别纳米粒子以最小化粒子间共振耦合的效应(图3c)。使腔室的图像在-70℃聚焦于电荷耦合装置(CCD) 相机(PIXIS：400B；普林斯顿仪器(PrincetonInstruments)，美国新泽西州特伦顿(Trenton，NJ， USA))上，帧积分时间为100毫秒。将显微镜及长通滤波器的输出端口的光束分光器放置于所述CCD之前。平台允许在18℃下在暗室中使用RLS光谱图(Microspec 2300i；罗珀科学 (Roper Scientific)，法国吕弗斯街南山8号(Montagne Sud-8，rue du Forez，France))测定腔室中各NP的瑞利光散射(RLS)特性。记录300-900纳米范围内的光谱，采集时间为1秒。用洛伦兹演算法拟合光谱数据以消除噪音，并使用Origin2018软件(OriginLab公司，美国马萨诸塞州北安普敦(Northampton，MA，USA))测定精确的λ

将玻璃载片安装在sNPS平台中之后，通过注入75％乙醇来冲洗腔室5分钟，接着用洗涤 /存储缓冲液冲洗20分钟以移除污染物及未结合的Au-NP。在拍摄腔室之后，记录Au桥接 NP的位置。一个NP代表一个检测集且针对分子结合的每个步骤测定其光学特性。腔室在室温下装填有100纳摩尔浓度的探针DNA(例如，探针-GT)持续8小时且在杂交缓冲液中引入不同浓度的靶标DNA(例如4956A＞G)之前用洗涤/存储缓冲液冲洗5分钟。通过用杂交洗涤包进行冲洗来移除未结合的靶标，之后注入目标浓度的MutS溶液。在18℃下在结合缓冲液(pH 7.5；100毫摩尔浓度NaCl、1毫摩尔浓度DTT、0.1毫摩尔浓度EDTA以及5毫摩尔浓度MgCl

使用G-spin

个别纳米粒子的等离子FOI定义为等离子灵敏度对比折射率变化的有效空间，其中等式1 (参见章节1-10：数据分析，见下文)适用于计算与λ

1-9：估算每个NP的探针平均负载数(N

基于纳米粒子及DNA足迹(footprint)的建模定量地预测N

根据球体的直径，球体上的足迹面积(S

利用等式：N

由于粒子固定于平坦基板上，假设仅“有效负载边缘”线上方的表面可与DNA有效地结合，其覆盖粒子的总表面积的59.4％(图10)。在饱和条件下，全部探针均捕获靶标。使用确立的等式N

NP表面上对应于各分子结合步骤的RI变化表示为LSPRλ

Δλ

其中m为折射率灵敏度，Δn为由吸附物诱导的折射率变化，d为介电厚度且L

获得可靠Δλ

LOQ＝10σ/S (2)

其中σ为信号的标准差且S为校准曲线的斜率。根据回归线的y截距的标准差估算σ的值。

如下测定sNPS系统针对DNA靶标的检测极限(LOD)：

LOD＝3.3σ/S (3)

信噪比(S/N)定义为Δλ

S/N＝μ/σ (4)

在蛋白质核酸结合反应中，MutS结合DNA，从而形成MSDNA络合物。缔合为涉及两个反应物的二阶反应。

在概念上，结合及解离反应均涉及直接结合。在单DNA链的层级下，MutS缔合及解离为随机过程。通过简单的估算，Au桥接NP上的全部DNA链可平均地用于结合。所使用的DNA链长度指示以1∶1化学计量与MutS结合；通过单指数过程描述结合的时程。在稳定状态下，结合速率等于释放速率：

k

其中[MutS]及[DNA]分别为MutS及DNA的游离摩尔浓度；以且k

达到稳定状态之前，MSDNA络合物浓度的变化率等于其形成速率与解离速率之间的差。

d[MSDNA]/dt＝k

结合因尚未消耗反应物而以最大速率开始，且随后因反应物被消耗而减缓。反应随时间推移的程度可表示如下：

MSDNA的起始浓度([MSDNA

其中k

等式(9)及等式(10)的进一步转化可得到等式：

其中k

基于λ

τ

实例2：构建的单纳米粒子感测平台的表征及点突变的检测

因为每个NP在sNPS平台中充当信号转换器，所以NP结构及形状应为均质的且可控的。这不包含形状不规则的纳米晶体(例如，分支链纳米星)，因为基于合成原理，其形成具有实验性而不具有科学性。此外，多面体纳米结构的可控性会因缺乏可专门调谐目标晶体晶面的化学物质而受到限制且因此以相对较高产率产生NP。因此，选择呈球体形状及棒形状的纳米结构作为用于sNPS的基板，因为可以均匀且可扩展的方式合成这两种形状的纳米结构。另外还引入诱导不同光谱响应并影响等离子耦合、偏光方向、信号强度以及RI灵敏度的量值的由纳米桥组成的结构以探索更高RI灵敏度(图11a)。金属NP的灵敏度为测定生物/化学传感器的效用的主要因素。执行具有预先设计结构(其中周围介质的RI设定为改变)的单NP的光学模拟，而不是使用络合物生物标记来定量RI灵敏度。对通过不同RI溶液诱导的单Au-NP 的LSPR波长(λ

研究使用双链DNA(dsDNA)进行金NP的“方向特定”合成的可行性，固定于两个Au纳米晶种(AuNS；直径为约5纳米)之间的一个dsDNA(长度为约3纳米)充当金原子结晶的方向特定引导(图2)。有趣的是，通过调节pH改变dsDNA的表面电荷也会产生小于1纳米的纳米间隙(图11c)。在pH 5下，dsDNA略微带负电并静电地聚集NH

[表3]

所需形态的产率为87％，且纳米结构呈相对高的单分散性(图12)。相比之下，在pH4 下，dsDNA由于其pI为4-4.5而带正电(郭，Z.L.(Guo，z.L.)等人，《软物质(SoftMatter)》，12，6669-6674，2016)。DNA因静电斥力排斥NH

在从AuNS-dsDNA边界到dsDNA链中点的特定方向中出现结晶，其中纳米尺寸可控性是由dsDNA长度限定。这一方法基本上与涉及使DNA金属化或DNA折纸术的现有途径不同，在所述现有途径中，形成连续的项链或连续的凸出而结构精密度控制不佳(＞100纳米)。通过 X射线衍射及高分辨率穿透式电子显微镜术(HR-TEM)评估DNA在合成Au桥接NP中的定向作用(图11d及e)。AuNS展现金(JCPDS编号03-0921)的fcc结构在38°(111)及44° (200)处的峰。峰位置在DNA定向结晶之后展现明显的偏移，表明DNA在Au桥接纳米结构中诱导显著的晶格应变。峰的狭窄线宽间接反映增大的粒子尺寸。此外，纳米尺寸桥体系的HR-TEM图像显示间隔为0.208±0.004纳米的晶体平面，与<100>结晶方向中的(200)晶格条纹相对应(马，X.，等人.《自然通讯》7，(2016))。综上所述，DNA实现纳米尺寸桥及间隙的方向特定合成，所述纳米尺寸桥及间隙可用于灵敏的纳米等离子感测及成像。

研究在白光源下sNPS对单Au桥接NP的共振RLS响应(图3)。在配备有白光源、暗场聚光器、100×物镜以及相机的暗场显微镜上观测岛个别NP的光散射。白光照射使得有可能区分具有不同光学共振的个别NP的光散射；其不会诱导使靶生物分子变性或干扰分子相互作用的较强能量及热量。使用暗场配置，在暗背景下明亮地照射光散射对象。AuNP对LSPR的刺激在很大程度上提高光散射，足以用裸眼识别并通过成像进行分析。NP稀疏地分散于经设计微流体反应腔室的玻璃基板上。为测量单NP的RLS光谱，将高度灵敏的电荷耦合装置(CCD) 及瑞利光谱仪连接到显微镜上。随光散射强度与光谱波长的变化，用CCD记录单NP的散射单色光。用洛伦兹演算法拟合散射光谱以消除来自周围光的噪音。

光在NP下产生的LSPR充分增强光散射以允许直接观测到个别NP；在另一方面，白光照射避免在微流体反应腔室中可使靶生物分子变性或阻断分子相互作用的高能量及热量(图 9a)。单Au桥接NP的RLS光谱具有两个表面等离子峰(图9b)：一个与横向方向上的电子振动相关，产生相对弱的共振带，约500纳米(类似于AuNSph)，而另一个与纵向方向上的电子振动相关，约500纳米(类似于AuNR)。本发明人关注纵向表面等离子峰，这是因为纵向模式比横向模式对介质的介电常数变化更灵敏(特龙，P.L.，马，X.以及希姆，S.J.《纳米尺寸》6，2307-2315(2014))。介质的吸附物为ssDNA及MutS蛋白质。探针ssDNA通过硫醇修饰固定于Au桥接NP并随后通过氢(H-)键合及π-π堆积而与靶ssDNA杂交，在所述过程期间，λ

根据两个参数研究sNPS感测方法的灵敏度：实现在特定检测时间内有效的LSPRλ

进行设计以鉴别BRCA1中的八个不同点突变。BRCA1基因突变包含乳癌(世界上最常见的女性癌症)的最重要遗传易感性。约12％的女性将在其生命中患上乳癌，而因BRCA1突变带来的风险最高(59-87％)。除极少的共同突变之外，BRCA1突变的光谱在不同种群中是异质的。选择BRCA1基因的八个多态性，包含在世界范围内最常见的单核苷酸取代(GT、GG、 AC、TC、AA以及GA)、插入(+C)以及缺失(-C)。DNA序列、突变名称、基因组位置、功能性结果以及靶标群概述于表1中。推测MutS与点突变的序列特异性结合会改变不同的 LSPR信号。另外，检测MutS针对不同核苷酸变体的相对活性。在将sNPS平台注入到感测腔室中后，允许MutS结合至DNA共轭的Au桥接NP持续150秒，且每1秒监测单NP的光学响应的变化(图13a)。根据实时信号响应，将MutS负载于同源双链体(完全匹配)DNA 上持续约15秒。这与MutS形成短短暂的钳位并通过一维扩散滑动沿同源双链体DNA移动的先前报告(吉隆，C.(Jeong，C.)等人.《自然结构分子生物学(Nat.Struct.Mol.Biol.)》18， 379-U174(2011))一致。错配鉴别会导致比同源双链体的结合时间长10倍的MutS结合时间并诱导系列Δλ

MutS与突变DNA的相对活性R

已最清楚地证实结合于GT错配的MutS的晶体结构及相互作用(格罗苏伊森，F.S.(Groothuizen，F.S.)等人.Elife 4，(2015))。因此，基于对MutS与GT突变DNA相互作用以形成名为“MSDNA”的络合物的k

另外建立针对具有四种类型点突变的DNA的蛋白质结合亲和力图谱(图15)：高度可鉴别的((k

作为图谱的临床应用的原理证明(proof-of-principle)，生物DNA样本是由人类乳癌细胞系HCC1937及MCF7制备，分别作为分析物及对照(Elstrodt，F等人，《癌症研究(Cancer Res)》， 66，41-45，2006)，并检测图谱中所示的八个突变中的潜在点突变的存在及类型(图5-图7)。明显地，设计用于检测5382insC的玻璃芯片(表1)展现出一系列峰偏移，而其它芯片并未展现明显的信号变化(图15)。关于峰偏移响应于检测时间的动力学研究得到k

最终，此sNPS系统适用于检测用户指定基因组区域中的潜在点突变。位于染色体17的长臂的区域2条带1上的43047665处的潜在BRCA1点突变被指定用于判断卵巢癌细胞系SNU251。用相同的Au桥接NP但用新的64个碱基对探针来制造芯片。有趣的是，观测到光谱峰的连续偏移，从而验证具有新探针的sNPS监测基因中的特定间隔的有效性(图19)。此外，诊断结果输入到图谱中指示突变类型高度类似于AC点突变。尽管新设计的探针与先前使用的AC探针的侧接序列不同，但k

虽然已详细地描述本公开的细节，但将对本领域的技术人员显而易见的是这类细节仅仅是优选实施例且并不意图限制本发明的范围。因此，通过所附权利要求和其等效物来限定本发明的真实范围。

工业实用性

本发明的单纳米粒子生物传感器平台可用于不仅以高灵敏度及可靠性检测靶标，而且直接鉴别各种突变，从而实现突变的有效诊断。因此，本发明的单纳米粒子生物传感器平台可用于广泛范围的领域中，包含生物医学诊断。