甲苯磺丁脲的检测方法

摘要

本发明提供了甲苯磺丁脲的检测方法，包括：制备具有甲苯磺丁脲和内标物的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中的内标物的量相同；利用液质联用仪在检测条件下检测每一种标准溶液，获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中甲苯磺丁脲的浓度和内标物的浓度，拟合甲苯磺丁脲的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对第一上清液进行萃取，得到待测样品；利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中甲苯磺丁脲的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及甲苯磺丁脲的检测方法。

背景技术

甲苯磺丁脲为一种磺酰脲类化合物，为白色结晶性粉末，无臭，无味， 在氯仿中溶解、在甲醇或乙醇中极微溶解、在水或乙醚中不溶。

目前，检测样品中甲苯磺丁脲含量通常采用的方法为液质连用色谱法。 而现有检测方法通常采用梯度洗脱，需要不断改变洗脱流动相的浓度配比， 而且前处理过程较为复杂，对待测样品的分析时间较长，从而导致样品检测 时间较长。

发明内容

本发明提供了甲苯磺丁脲的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了甲苯磺丁脲的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有甲苯磺丁脲 和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获 得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中甲苯磺丁脲的浓度和内标 物的浓度，拟合甲苯磺丁脲的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对所述 第一上清液进行萃取，得到待测样品；

利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样 品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中甲苯 磺丁脲的浓度。

优选地，为了更准确地检测出待测样品中甲苯磺丁脲的浓度，标准溶液 和待测样品中的内标物均为氯硝西泮。

需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆，萃取后选择为上层有机相。

具体地，标准溶液制备方式如下：

(1)标准储备液的配制

精确称取甲苯磺丁脲标准品置于容量瓶中，用乙腈溶液进行溶解，并定 容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为12个 月。

(2)标准工作液的配制

取适量步骤(1)中标准储备液，用含有70-90％乙腈的水溶液作为稀释 液进行稀释混合，得到含有0.1-50μg/mL甲苯磺丁脲的标准工作液，并在 -80℃条件下保存，有效期为3个月。

(3)内标储备液的配制

取内标物氯硝西泮标准品置于容量瓶中，用乙腈溶液进行溶解，并定容 至容量瓶的标线，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。

(4)内标工作液的配制

取步骤(3)中内标储备液，用含有70-90％乙腈的水溶液作为稀释液进 行稀释，得到含氯硝西泮的内标工作液，并在-80℃保存。

(5)标准溶液的标定

分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作 液置于容器(例如，该容器可以选用96孔板以及离心管)中，分别向各个容 器中加入空白样本，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶 液在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀0.5-1min后，顺次加入萃取剂进行萃 取，得到标准溶液。

需要说明的是，空白样本为未含有甲苯磺丁脲的血清或血浆。

为了保证甲苯磺丁脲和内标物充分溶解，选择乙腈溶液进行溶解，同时 为了降低标准工作液和内标工作液反复使用过程中的挥发，确保标准工作液 和内标工作液的稳定性，所以稀释液为含有70％-90％乙腈的水溶液。

优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：反相色谱柱；

洗脱流动相中的水相包括：含有0.05％-0.1％甲酸的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：含有0％-0.1％甲酸的甲醇溶液；

柱温为25-55℃；流速为0.3-1.0mL/min；进样量为2-10μL。

具体地，液相条件的色谱柱包括Agilent Extend C18色谱柱(内径2.1mm ×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱(内 径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Waters Atlantis dC18色谱柱 (内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、SHIMADZU Shim-pack Velox SP-C18色谱柱(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径2.7μm)。

针对水相中的甲酸来说，0.05％-0.1％是指0.05％-0.1％范围内的任一比 例，比如，0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％以及0.1％。

针对有机相中的甲酸来说，0％-0.1％是指0％至0.1％范围内的任一值， 比如，有机相中添加0％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％以及0.1％的甲酸。

具体地，洗脱流动相还可以包括：水相包括：含有0.05％-0.2％甲酸的水 溶液；有机相包括：甲醇溶液。

比如，洗脱流动相中水相为含有0.1％甲酸的水溶液，有机相为甲醇溶液； 洗脱流动相中水相为含有0.2％甲酸的水溶液，有机相为甲醇溶液；洗脱流动 相中水相为含有0.05％甲酸的水溶液，有机相为含有0.05％甲酸的甲醇溶液； 洗脱流动相中水相为含有0.1％甲酸的水溶液，有机相为含有0.1％甲酸的甲 醇溶液。

具体地，洗脱流动相的有机相中可以加入甲酸也可以不添加甲酸。当洗 脱流动相中加入甲酸时，由于质谱检测器为ESI正离子扫描模式，因此，通 过该洗脱流动相对待测样品进行检测，可以增加待测样品的离子化程度，提 高目标物质谱峰的强度。

具体地，当洗脱流动相中的水相中的甲酸含量大于0.1％，且有机相中的 甲酸含量大于0.1％时，洗脱流动相中的甲酸含量过多，导致洗脱流动相的 pH值过低，从而对色谱柱造成不可逆的损伤。因此，洗脱流动相中的水相包 括：含有0.05％-0.1％甲酸；有机相包括：含有0％-0.1％甲酸。

针对柱温来说，25-55℃是指25℃至55℃范围内的任一温度值，比如， 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃以及55℃。

针对流速来说，0.3-1.0mL/min是指0.3mL/min至1.0mL/min范围内的 任一流速，比如，0.3mL/min、0.35mL/min、0.4mL/min、0.45mL/min、0.5 mL/min、0.55mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min 以及1.0mL/min。

针对进样量来说，2-10μL是指2μL至10μL范围内的任一进样量，比 如，2μL、4μL、5μL、6μL、8μL以及10μL。

优选地，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为40％:60％-50％:50％ 中的任一比例。

针对洗脱流动相中的水相与有机相的体积比来说，40％:60％-50％:50％是 指40％:60％至50％:50％范围内的任一比例，比如，40％:60％、42％:58％、 44％:56％、46％:54％、48％:52％以及50％:50％。

比如，水相的体积占洗脱流动相体积的40％，有机相的体积占洗脱流动 相体积的60％；水相的体积占洗脱流动相体积的50％，有机相的体积占洗脱 流动相体积的50％。

具体地，当水相在洗脱流动相中体积占比小于40％时，甲苯磺丁脲和内 标物的出峰时间较早，且易受杂质干扰，影响甲苯磺丁脲的检测准确性；当 水相在洗脱流动相中体积占比大于50％时，甲苯磺丁脲出峰时间较晚，会增 大甲苯磺丁脲的检测时间，因此，洗脱流动相中的水相与有机相的体积比为 40％:60％-50％:50％中的任一比例。

优选地，所述检测条件中的质谱条件，包括：

所述液质联用仪采用ESI离子源，正离子扫描模式和多反应监测模式； 加热气流速：8-11L/min；加热气温度：250-350℃；雾化电压：20-40psi； 毛细管电压：2000-3000V。

针对加热气流速来说，8-11L/min是指8L/min至11L/min范围内的任 一值，比如，8L/min、9L/min、10L/min以及11L/min。

针对加热气温度来说，250-350℃是指250℃至350℃范围内的任一值， 比如，250℃、260℃、280℃、300℃、320℃、340℃以及350℃。

针对雾化电压来说，20-40psi是指20psi至40psi范围内的任一值，比 如，20psi、25psi、30psi、35psi以及40psi。

针对毛细管电压来说，2000-3000V是指2000V至3000V范围内的任 一值，比如，2000V、2200V、2400V、2600V、2800V以及3000V。

优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中甲苯磺 丁脲的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中甲苯 磺丁脲的浓度与内标物的浓度的比值。

具体地，若甲苯磺丁脲的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为 标准曲线方程的x值(即自变量)时，甲苯磺丁脲的浓度与内标物的浓度的 比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。

若甲苯磺丁脲的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线 方程的y值(即因变量)时，甲苯磺丁脲的浓度与内标物的浓度的比值则为 标准曲线方程的x值(即自变量)。

优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的 第一上清液进行萃取的萃取剂包括单一的乙酸乙酯、单一的甲基叔丁基醚或 乙酸乙酯溶液与甲基叔丁基醚任意比例混合后的溶液。

优选地，为了更好的去除杂质，所述第一上清液与所述萃取剂的体积比 为1:5-1:70中的任一比例。

针对第一上清液和萃取剂的体积比来说，1:5-1:70是指1:5至1:70范围 内的任一比例，比如，1:5、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60以及 1:70。

具体地，当第一上清液的体积为10μL，那么萃取剂的体积可以是50μL 至700μL范围内的任一值。

优选地，

所述向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取剂，对 所述第一上清液进行萃取，得到待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合 0.5-1min；

顺次加入萃取剂，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合3-10min，并在 3500-12000rpm的转速下离心5-10min，移取离心后的第二上清液；

利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在1500-2500 rpm的转速下涡旋混合0.5-2min，并在3500-12000rpm的转速下离心5-10 min，取离心后的第三上清液作为待测样品。

具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀， 可以涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入萃取剂，并涡旋混匀，进行 萃取，以通过萃取剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行离心，取离 心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于利用萃取剂萃取 后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二 上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物 分布均匀。

针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的 任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000 rpm、2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm以及2500rpm。

针对加入内标物之后的涡旋时间来说，0.5-1min是指，0.5min至1min 范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min以及1 min。

针对加入萃取剂之后的涡旋时间来说，3-10min是指，3min至10min 范围内的任一时间，比如，3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min 以及10min。

针对加入复溶液之后的涡旋时间来说，0.5-2min是指，0.5min至2min 范围内的任一时间，比如，0.5min、1min、1.5min以及2min。

针对离心转速来说，3500-12000rpm是指3500rpm至12000rpm范围内的 任一转速，比如，3500rpm、3600rpm、3800rpm、4000rpm、4500rpm、5000 rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm以 及12000rpm。

针对离心时间来说，5-10min是指5min、6min、7min、8min、9min 以及10min。

具体地，在对待处理样品进行前处理后得到待测样品过程中，用于放置 待处理样品的容器可以选用96孔板以及离心管。

具体地，当选用96孔板对待处理样品进行前处理时，涡旋混合转速均为 1500-2500rpm，离心时的转速均为3500-4500rpm。比如，利用96孔板对待 处理样品进行离心处理，得到离心后的第一上清液，将第一上清液置于96 孔板中，向第一上清液内加入内标物，在2000rpm的转速下涡旋混合1min， 顺次加入萃取剂，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，并在4000rpm的转 速下离心5min，移取离心后的第二上清液，利用氮气将移取的所述第二上清 液吹干，顺次加入复溶液，在2000rpm的转速下涡旋混合2min，并在4000rpm 的转速下离心5min，取离心后的第三上清液作为待测样品。

当选用离心管对待处理样品进行前处理时，涡旋混合转速均为1500-2500 rpm，离心时的转速均为4500-12000rpm。比如，利用离心管对待处理样品进 行离心处理，得到离心后的第一上清液，将第一上清液置于离心管中，向第 一上清液内加入内标物，在2500rpm的转速下涡旋混合1min，顺次加入萃 取剂，在2500rpm的转速下涡旋混合3min，并在12000rpm的转速下离心5 min，移取离心后的第二上清液，利用氮气将移取的所述第二上清液吹干，顺次加入复溶液，在2500rpm的转速下涡旋混合2min，并在12000rpm的 转速下离心5min，取离心后的第三上清液作为待测样品。

优选地，所述复溶液包括：含有0-80％水的甲醇溶液。

针对复溶液来说，0-80％是指0％至80％范围内的任一值，比如，复溶液 为含有0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％以及80％水的甲醇溶 液。

本发明提供了甲苯磺丁脲的检测方法，通过液质联用仪对含有不同浓度 的甲苯磺丁脲的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第 一检测结果，由于标准溶液中含有内标物氯硝西泮，因此，基于各种浓度标 准溶液中的甲苯磺丁脲的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到甲苯 磺丁脲的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，可以得到离心后 的血清或血浆，顺次加入内标物和萃取剂进行萃取，降低杂质对待测样品的 干扰，得到能够进行检测的待测样品。利用液质联用仪在与标准溶液相同的 检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和 第二检测结果即可得到待测样品中甲苯磺丁脲的含量。而且无需进行冰冻等 复杂的前处理过程，也无需梯度洗脱便可完成对目标物的检测，因此能够缩 短待测样品的检测时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的甲苯磺丁脲的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的待测样品中的甲苯磺丁脲和内标物的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的甲苯磺丁脲在检出限测定时的色谱图；

图4是本发明一实施例提供的甲苯磺丁脲在定量限测定时的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的标准溶液中的甲苯磺丁脲和内标物的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的甲苯磺丁脲的线性关系图；

图7是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速0.2mL/min时的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速1.0mL/min时的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的柱温25℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的柱温55℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为60％:40％时的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为40％:60％时的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的洗脱流动相中水相与有机相体积比为30％:70％时的色谱图；

图15是本发明一实施例提供的萃取剂为正己烷时的色谱图；

图16是本发明一实施例提供的萃取剂为甲基叔丁基醚时的色谱图；

图17是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18时的色谱图；

图18是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters Atlantis dC18时的色谱图；

图19是本发明一实施例提供的色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Velox SP-C18 时的色谱图；

图20是本发明一实施例提供的内标物为喹硫平时内标物的色谱图；

图21是本发明一实施例提供的内标物为脱烷基喹硫平时内标物的色谱图；

图22是本发明一实施例提供的内标物为氯氮平时内标物的色谱图；

图23是本发明一实施例提供的内标物为氯丙嗪时内标物的色谱图；

图24是本发明一实施例提供的内标物为奥氮平时内标物的色谱图；

图25是本发明一实施例提供的复溶液为含有80％水的甲醇溶液时的色谱图；

图26是本发明一实施例提供的复溶液为甲醇时的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发 明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所 获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，通常液质联用仪对待测样品进行检测，待测样品需要至少100μL， 从而使得用户的依从性较差。

并且，采用梯度洗脱，对仪器的配置要求较高，通常需要配置四元泵或 者二元泵；其次，每次运行样品之间，需要设置平衡时间，以使系统中流动 相的比例到达初始流动相比例，这样就增加了检测过程的复杂性，增加了整 个检测过程中所需的时间，而且分析时间较长，从而导致待测样品中甲苯磺 丁脲整体的检测时间较长。

并且，待测样品的检测中仅使用单一离子对进行定量，未采用定性离子 对，导致检测方法选择性较低，易存在杂质干扰的情况，从而导致待测样品 中甲苯磺丁脲的检测准确性较低。

基于上述问题，本发明实施例提供了甲苯磺丁脲的检测方法，如图1所 示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有 甲苯磺丁脲和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量 相同；

步骤102：利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标 准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中甲苯磺丁脲的 浓度和内标物的浓度，拟合甲苯磺丁脲的标准曲线方程；

步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

步骤105：向所述第一上清液内加入内标物，涡旋混匀，顺次加入萃取 剂，对所述第一上清液进行萃取，得到待测样品；

步骤106：利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得 所述待测样品的第二检测结果；

步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测 样品中甲苯磺丁脲的浓度。

在本发明实施例中，通过液质联用仪对含有不同浓度的甲苯磺丁脲的标 准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于 标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的甲苯磺丁脲的浓 度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到甲苯磺丁脲的标准曲线方程。通 过对待处理样品进行离心处理，可以得到离心后的血清或血浆，顺次加入内 标物和萃取剂进行萃取，降低杂质对待测样品的干扰，得到能够进行检测的 待测样品。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测 样品中甲苯磺丁脲的含量。而且无需进行冰冻等复杂的前处理过程，也无需 梯度洗脱便可完成对目标物的检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

在本发明实施例中，步骤101中的标准溶液中还包括空白样本，可以理 解的是，空白样本为未含有甲苯磺丁脲的血清或血浆。

下面以几个实施例对甲苯磺丁脲的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备标准溶液

(a)标准储备液的配制：

精确称取甲苯磺丁脲标准品5mg置于5mL容量瓶，用乙腈溶液进行溶 解，并定容于5mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为12 个月。

(b)标准工作液的配制

取适量步骤(a)中标准储备液，用含有90％乙腈的水溶液作为稀释液 进行稀释混合，得到含有0.1-50μg/mL甲苯磺丁脲的标准工作液，并在-80℃ 条件下保存，有效期为3个月；

其中，其中不同浓度的标准工作液为含有甲苯磺丁脲：0.1μg/mL、0.2 μg/mL、0.5μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的溶液。

(c)内标储备液的配制

取氯硝西泮标准品5mg置于5mL容量瓶，用乙腈溶液进行溶解，并定 容至5mL，得到内标储备液，并在-80℃条件下保存。

(d)内标工作液的配制

取适量步骤(c)中内标储备液，用含有90％乙腈的水溶液作为稀释液 进行稀释，得到含氯硝西泮25mg/L的内标工作液，并在-80℃保存。

(e)标准溶液的标定

用移液器移取步骤(b)中七种不同浓度的标准工作液10μL、步骤(d) 中的10μL内标工作液和10μL空白样本分别置于96孔板各孔中，并分别在 转速为2000rpm下涡旋混匀0.5min，混合制成七种含有不同浓度甲苯磺丁脲 标准品的混合溶液，向上述混合溶液中分别加入萃取剂，并在转速2000rpm 下混匀5min后，得到七种不同浓度的标准溶液，并且七种标准溶液中的内 标物的量相同。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用液质联用仪对实施例1中七种标准溶液分别进行检测，得到七种不 同浓度的甲苯磺丁脲的标准溶液的色谱图。

从上述甲苯磺丁脲的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中甲苯磺 丁脲和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得 到的甲苯磺丁脲的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的 纵坐标y1，以上述标准溶液中的甲苯磺丁脲的浓度与内标物的浓度的比值作 为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回 归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系 数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。

上述检测条件包括：

色谱柱：Agilent Extend C18，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为 50mm；

洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％甲酸的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：甲醇溶液，洗脱流动相中的水相与有机相 的体积比为50％:50％，分析时间为2.5min；

柱温为30℃；流速为0.4mL/min，进样量为5μL。

质谱检测条件：

所述液质联用仪采用ESI离子源，正离子扫描模式和多反应监测模式； 加热气流速：11L/min；加热气温度：350℃；雾化电压：40psi；毛细管电压： 3000V。

其中，液相色谱质谱联用仪中的质谱检测器离子对参数如下述表1所示：

表1

在本发明实施例中，由表1可以看出，质谱检测中采用定量(母离子为 271.1，子离子为91.1)-定性(母离子为271.1，子离子为74.1)双离子对， 这样可以增强甲苯磺丁脲检测方法的选择性，避免杂质对检测结果的干扰， 提高了甲苯磺丁脲检测方法的稳定性和准确性。

需要说明的是，不同浓度的标准溶液可按照处理待处理样品时的前处理 操作获得，即，涡旋转速时间、萃取剂、加入萃取剂后的涡旋时间和转速以 及离心转速和时间、复溶液、加入复溶液后的涡旋时间和转速以及离心转速 和时间均与待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的 准确度。

实施例3：待测样品的处理

3.1取待处理血液至少500μL，在离心速度为3500rpm下离心10min， 取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至 分析前备用。

3.2用移液枪移取10μL实施例1中的内标工作液于96孔板各孔中，然 后加入10μL步骤3.1中的血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋混合0.5min 后，加入萃取剂乙酸乙酯700μL后将96孔板封膜(比如，利用封板膜进行 封膜)，并在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在4000rpm的转速下 离心5min后，取第二上清液(上层有机相)500μL，利用氮气将移取的第 二上清液吹干，顺次加入100μL复溶液(含有50％水的甲醇溶液)，在2000 rpm的转速下涡旋混合1min，并在4000rpm的转速下离心5min，取离心后 的第三上清液5μL作为待测样品。

在本发明实施例中，采用96孔板可以实现待测样品的批量化前处理过 程，同时处理多个待测样本，缩短前处理过程所需的时间，从而极大地缩短 了甲苯磺丁脲的整体检测时间；而且96孔板转置自动进样，从而进一步简化 了甲苯磺丁脲的检测流程。

实施例4：待测样品的检测

利用液质联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到 待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中的甲苯磺丁脲的色谱峰面积 和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的甲苯磺丁脲的色谱峰面 积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为 y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中甲苯磺 丁脲的浓度。

综上可见，通过上述检测方法检测待测样品中的甲苯磺丁脲含量，仅需 取10μL的待处理样品进行处理，即可得到待测样品，从而可以使用户的依 从性较好。

实施例5：针对前处理的说明

本申请例1：

(1)10μL内标工作液+10μL血清或血浆，混合0.5min，得到混合液；

(2)加入700μL正己烷混合5min进行萃取并离心，得到第二上清液；

(3)取第二上清液500μL，氮气吹干；

(4)加100μL含有50％甲醇的水溶液复溶，混匀并离心，得第三上清 液为待测样品。

对比例1：(超高效液相串联质谱法快速测定CYP2C9酶活性[J].中国药 师,2014(11):1804-1808.)

(1)在100μL孵育液中，加入40μLHCL水溶液(0.1M)、50μL内 标工作液(20ng/μL氯磺丙脲)、800μL乙酸乙酯混合2min，并于-40℃冷 藏30min后，在4℃下离心，得到上清液；

(3)取上清液利用氮气吹干，加入200μL复溶液(乙腈与含0.1％甲酸 和0.5％氨水的水溶液体积比为4:6的混合溶液)复溶，混匀并离心，得上清 液为待测样本。

从本方案例1和对比例1可以看出，本发明的样品使用量仅为对比例样 本使用量的10％，更加符合科学伦理道德标准，使得待测人员依从性更高； 对比例1在孵育液中加入HCL水溶液和乙酸乙酯之后，还需要在-40℃下冷 藏30min后再进行萃取处理，相较于对比例1中的复杂前处理操作，本发明 节省了冷藏等待的时间，进而缩短了甲苯磺丁脲的整体检测时间。并且对比 例1中采用的复溶液用量较多，且需自行配置，本发明节省了复溶液的配置 时间，减少了试剂配制过程的误差，使用有机溶剂量少，成本更低，对环境 更友好。

实施例6：针对检测条件的说明

本申请例2：

(1)色谱柱：Agilent Extend C18色谱柱；

(2)洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％甲酸的水溶液；洗脱流动相 中的有机相包括：甲醇溶液；等度洗脱；

(3)流速：0.4mL/min，进样量5μL，分析时间2.5min。

对比例2：(UHPLC-MS/MS同时检测大鼠血浆中5种CYP450探针药 物[J].中国现代应用药学,2019.)

(1)色谱柱：Agilent Z0RBAX Eclipse Plus C18色谱柱；

(2)洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％甲酸的水溶液；洗脱流动相 中的有机相包括：乙腈溶液；梯度洗脱；

(3)流速：0.4mL/min，进样量5μL，分析时间3min。

图2中位于上方的为本申请待测样品中甲苯磺丁脲的色谱图，位于下方 的为本申请待测样品中甲苯磺丁脲内标物的色谱图。

图2的横坐标的单位长度为0.2，图2中位于上方的色谱图的纵坐标的 单位长度为0.5×10

从本申请例2和对比例2可以看出，本发明的样本分析时间为2.5min， 其中甲苯磺丁脲的保留时间约为1.8min，甲苯磺丁脲内标物的保留时间约为1.6min，相较于对比例2的分析时间短，而且本申请例2减少了分析时间及 洗脱流动相等试剂的消耗，降低了成本。其次，本申请例2的等度洗脱相对 于对比例2的梯度洗脱操作更简便，对色谱柱也更友好，得到的测定结果达 到了优于对比例2的结果。

实施例7：甲苯磺丁脲的检测方法的检出限和定量限

制备不同浓度的甲苯磺丁脲低浓度样本，分别加入10μL内标工作液， 加入10μL各个浓度的甲苯磺丁脲低浓度样本和10μL空白样本，从而制备 得到不同浓度的样本，按本实施例3中的前处理及实施例2中的检测条件进 行测定，甲苯磺丁脲的检出限和定量限如图3和图4所示。

图3为甲苯磺丁脲在检出限测定时的色谱图，图3中的横坐标的单位长 度为0.2，纵坐标的单位长度为0.5×10；

图4为甲苯磺丁脲在定量限测定时的色谱图，图4中的横坐标的单位长 度为0.2，纵坐标的单位长度为1.0×10。

由图3可知，信噪比(S/N)为3时，甲苯磺丁脲的检出限(LOD)为 0.013μg/mL；由图4可知，信噪比(S/N)为11时，甲苯磺丁脲的定量限(LOQ) 为0.055μg/mL。

由本实施例可知，甲苯磺丁脲的检出限及定量限分别为0.013μg/mL和 0.055μg/mL，灵敏度很高，对甲苯磺丁脲含量很低的生物样本也能准确定量， 保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例8：甲苯磺丁脲的检测方法的线性方程的获得和线性关系

将实施例1中七种不同浓度的标准工作液进行液质联用仪按照实施例2 中的检测条件进行测定，得到各浓度甲苯磺丁脲及内标物的色谱图，其中， 标准溶液中的甲苯磺丁脲和内标氯硝西泮的色谱图如图5所示；甲苯磺丁脲 的保留时间约为1.8min，内标氯硝西泮的保留时间约为1.6min。

图5中位于上方的为甲苯磺丁脲的色谱图，位于下方的为甲苯磺丁脲内 标物的色谱图。图5中的横坐标的单位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵 坐标的单位长度为1.0×10

确定各色谱峰峰面积，以甲苯磺丁脲色谱峰面积与内标物色谱峰面积的 比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，甲苯磺丁脲的浓度与内标物的浓度的比 值作为标准曲线方程的横坐标x2，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进 行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y2＝a*x2+b，并且得系数c；线性方 程的测定结果见表2，线性方程图见图6。

表2

表2为一次实施例中的线性关系数据，由表2可知，甲苯磺丁脲在 0.1-50μg/mL的线性范围内，相关系数R

实施例9：甲苯磺丁脲的检测方法的回收率和精密度

取实施例1中甲苯磺丁脲标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加 样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测 定3批次，甲苯磺丁脲的回收率如表3。其中，本实施例中按照浓度由低至 高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。 甲苯磺丁脲在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为95.9％～ 101.4％，批内精密度为0.83％～2.29％，批间精密度为1.96％～2.63％。

表3

综合上述验证试验，本实施例的回收率，检出限和精密度等各项技术指 标均符合要求，该方法检测血液中甲苯磺丁脲，重现性良好，且加样回收率 良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

由图2和图5可见，待测样品中的甲苯磺丁脲的保留时间与其标准溶液 中的甲苯磺丁脲的保留时间一致，该方法以氯硝西泮为内标物，使得目标化 合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确 度和灵敏度高。

实施例10：针对流速和柱温的说明

图7至图11分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验， 区别为流速和柱温不同，图7至图11中，位于上方的均为甲苯磺丁脲的色谱 图，位于下方的均为甲苯磺丁脲内标物的色谱图。

图7为柱温30℃，流速0.2mL/min时的色谱图，图7中的横坐标的单位 长度为0.5，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10

图8为柱温30℃，流速0.3mL/min时的色谱图，图8中的横坐标的单位 长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10

图9为柱温30℃，流速1.0mL/min时的色谱图，图9中的横坐标的单位 长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×10

图10为柱温25℃，流速0.4mL/min时的色谱图，图10中的横坐标的单 位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10

图11为柱温55℃，流速0.4mL/min时的色谱图，图11中的横坐标的单 位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×10

通过图2以及图8至图11可见，流速在0.4mL/min，柱温在25℃至55℃ 范围内时，甲苯磺丁脲的保留时间在1.3min至2.0min之间，内标物的保留 时间在1.1min至1.7min，因此可以保证分析时间在2.5min内，但是柱温较 高则会影响色谱柱寿命。因此，对甲苯磺丁脲和内标物检测时的柱温范围设 置在25℃至55℃，以使目标物的保留时间相对最短。

由于流速小于0.3mL/min时会使得甲苯磺丁脲和内标物的保留时间增 加，导致目标物检测时间过长，影响待测样品的检测时效性。而流速大于1.0 mL/min时，内标物出峰较早，保留时间较短，存在受基质干扰的风险，同时 流速过大会使柱压升高，超过色谱柱所能承受的压力，对色谱柱造成不可逆 的损伤。

实施例11：针对洗脱流动相的说明

图12至图14分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验， 区别为洗脱流动相中的水相与有机相的体积比不同。图12至图14中位于上 方的均为甲苯磺丁脲的色谱图，位于下方的均为甲苯磺丁脲内标物的色谱图。

图12为洗脱流动相中水相与有机相体积比为60％:40％时的色谱图，图 12中的横坐标的单位长度为0.5，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为 0.2×10

图13为洗脱流动相中水相与有机相体积比为40％:60％时的色谱图，图 13中的横坐标的单位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.0×10

图14为洗脱流动相中水相与有机相体积比为30％:70％时的色谱图，图 14中的横坐标的单位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为 1.0×10

通过图2、图12至图14可见，水相在洗脱流动相中体积占比大于50％ 时，会使得甲苯磺丁脲的保留时间增大，导致目标物检测时间过长，影响待 测样品的检测时效性；而水相在洗脱流动相中体积占比小于40％时，会使甲 苯磺丁脲和内标物出峰较早，导致目标物的色谱峰易受杂质干扰，影响待测 样品的检测准确性。

实施例12：针对萃取剂的说明

图15和图16对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区 别为萃取剂的不同。图15和图16中位于上方的为甲苯磺丁脲的色谱图，位于 下方的为甲苯磺丁脲内标物的色谱图。

图15为萃取剂为正己烷时的色谱图，图15中的横坐标的单位长度为0.2， 位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10，位于下方的色谱图的纵坐 标的单位长度为1.0×10

图16为萃取剂为甲基叔丁基醚时的色谱图，图16中的横坐标的单位长 度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10

通过图2、图15和图16可见，萃取剂为正己烷时，甲苯磺丁脲的萃取 率较低，因而导致甲苯磺丁脲的响应值均较低，影响待测样品的检测灵敏度。 萃取剂为乙酸乙酯和甲基叔丁基醚时，待测样品和内标物的色谱峰的峰型、 峰宽和响应值均符合测试需求。

实施例13：针对色谱柱的说明

图17至图19对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，主 要区别为反相色谱柱的不同。图17至图19中位于上方的为甲苯磺丁脲的色 谱图，位于下方的为甲苯磺丁脲内标物的色谱图。

图17是色谱柱为Agilent ZORBAX Extend-C18(内径2.1mm×柱长50 mm、填料的粒径5μm)时的色谱图，图17中的横坐标的单位长度为0.2， 位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10

图18是色谱柱为Waters Atlantis dC18(内径2.1mm×柱长50mm、填 料的粒径5μm)时的色谱图，图18中的横坐标的单位长度为0.5，位于上方 的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10

图19是色谱柱为SHIMADZU Shim-pack Velox SP-C18(内径2.1mm× 柱长50mm、填料的粒径2.7μm)时的色谱图，图19中的横坐标的单位长 度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10

通过图2、图17至图19可见，利用Agilent Extend C18、Agilent ZORBAX Extend-C18、Waters Atlantis dC18以及SHIMADZU Shim-pack Velox SP-C18 色谱柱对待测样品进行检测得到的目标物的色谱峰均未出现前沿和拖尾的情 况，且峰宽也符合检测需求。

实施例14：针对内标物的说明

图20至图24对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区 别为内标物的不同。

图20是内标物为喹硫平时内标物的色谱图，图20中的横坐标的单位长 度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2×10

图21是内标物为脱烷基喹硫平时内标物的色谱图，图21中的横坐标的 单位长度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5×10

图22是内标物为氯氮平时内标物的色谱图，图22中的横坐标的单位长 度为0.5，纵坐标的单位长度为0.2×10

图23是内标物为氯丙嗪时内标物的色谱图，图23中的横坐标的单位长 度为0.5，纵坐标的单位长度为0.1×10

图24是内标物为奥氮平时内标物的色谱图，图24中的横坐标的单位长 度为0.5，纵坐标的单位长度为0.5×10

通过图20至图24可见，内标物为喹硫平、脱烷基喹硫平、氯氮平和氯 丙嗪时，内标物的色谱峰峰形异常且出峰较早，而当内标物为奥氮平时的出 峰时间较早，因此上述内标物均会影响待测样品的检测准确性。

实施例15：针对复溶液的说明

图25和图26对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区 别为复溶液的不同。图25和图26中位于上方的为甲苯磺丁脲的色谱图，位 于下方的为甲苯磺丁脲内标物的色谱图。

图25是复溶液为含有80％水的甲醇溶液时的色谱图，图25中的横坐标 的单位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10

图26是复溶液为甲醇时的色谱图，图26中的横坐标的单位长度为0.2， 位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.4×10

通过图2、图25和图26可见，复溶液为含有0-80％水的甲醇溶液时， 待测样品和内标物的色谱峰的峰型、峰宽以及响应值均符合测试需求。

需要说明的是，图2至图26的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均 为离子信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将 一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这 些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定 的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另 外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本 发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原 则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。