一种液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法

摘要

本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为磷酸盐—离子对缓冲液，流动相pH为1.6～2.0，检测波长为215nm。本发明方法精密度高，重复性好，回收率高，可以广泛用于不同来源的羧甲司坦原料药及其对应制剂的质量检测。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法。

背景技术

羧甲司坦(Carbocysteine)，是一种化痰止咳药，用于治疗慢性支气管炎、支气管哮喘等疾病引起的咳嗽、咳痰，另外，可用于小儿非化脓性中耳炎，以防耳聋，羧甲司坦化学名为S-(羧甲基)半胱氨酸(S-Carboxymethyl-L-cysteine)，分子式为C

在羧甲司坦的生产和贮藏过程中，可能会由于起始物料和中间体去除不完全以及贮藏过程中生成的降解杂质而影响药物的纯度，这些影响药物纯度的物质称为有关物质。上述有关物质皆无治疗作用，还可能影响药物的稳定性和疗效，甚至危害人体健康。

羧甲司坦在生产和贮藏过程中，可产生以下A～G的杂质，其结构式和化学式等信息如下表所示：

中国专利CN-201611113881.3公开一种用液相色谱法分离检测羧甲司坦原料药及含羧甲司坦制剂有关物质的方法，其特征在于，十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲溶液-有机相为流动相，实现羧甲司坦与以下三个有关物质的分离和测定。

余琼娥等发表了《HPLC测定羧甲司坦及其制剂有关物质》，该文献报导了一种HPLC法测定羧甲司坦及其制剂的有关物质检查方法，采用Diamonsil

谭少云等年发表了《HPLC法测定羧甲司坦无糖口服溶液中羧甲司坦的含量及有关物质》，该文献报导了一种羧甲司坦的含量测定以及有关物质检测的方法。采用采用HPLC法，以Diamonsil

杂质A，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G为羧甲司坦合成过程中较易引入的杂质，杂质B为合成羧甲司坦的起始原料。申请人发现，以上专利文献只能部分分离测定羧甲司坦与其杂质，并不能实现同时分离测定羧甲司坦与该七个杂质，且目前尚未见关于羧甲司坦与该七个杂质的同时分离测定方法，本发明从现有技术的不足出发，提供一种分析方法，能够准确，快速分离测定羧甲司坦与该七个杂质，且流动相中不含有机溶剂，对分析仪器的要求较低，进而在日常生产中控制羧甲司坦的质量、提高药品疗效、降低毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法，该方法较现有技术公开的方法更具有普适性，表现为：采用该方法可以实现各杂质的同时分离，进而有利于实现对原料药或制剂中有关物质更准确的定量分析，以及有利于实现对原料药或制剂在制备、贮存过程中潜在可能产生的未知杂质的有效质量控制。

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：

色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以磷酸盐—离子对缓冲液为流动相进行洗脱，检测波长215nm，柱温20～30℃，流动相速度0.8～1.20mL/min，其中磷酸盐—离子对缓冲液用磷酸调节pH值至1.6～2.0；

样品溶液配制：采用磷酸盐溶液分别配制含羧甲司坦及其杂质各1～2.5mg/mL的溶液；

测定：进样量20～30μL，将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。

所述离子对试剂为辛烷磺酸钠，所述离子对试剂浓度为8.0～12.5mmol/L。

在本发明的通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法中，所采用的色谱柱、流动相中磷酸缓冲液、离子对试剂的浓度、种类、流动相pH值、速度以及柱温是影响检测效果的重要因素。

具体的，所述高效液相法所采用的流动相中磷酸盐—离子对缓冲液由磷酸盐缓冲液与离子对试剂组成。羧甲司坦在C18柱上基本不保留，其结构上同时有2个羧基，1个氨基，根据这个特点，流动相加入适量的磷酸盐，以控制这些基团的离解，磷酸盐优选磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，最优选磷酸二氢钾。此外，磷酸盐缓冲液的浓度和pH值均会影响检测效果；对于流动相中磷酸盐缓冲液的浓度而言，检测样品为原料药或制剂制备得到的供试溶液，当pH值保持不变时，低浓度的磷酸盐缓冲液流动相不能实现所有杂质的基线分离，而采用高浓度的磷酸盐缓冲液流动相尽管可以实现较好的杂质分离度，但是其出峰时间较长进而影响检测效率。具体的，在本发明所述的通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法中，其中，磷酸盐缓冲液的浓度优选为15～25mmol/L，次优选为18～23mmol/L，最优选为20mmol/L。

流动相中加入适量的离子对试剂，可以增加样品中羧甲司坦中阴离子在色谱柱上的保留时间。所述离子对试剂为辛烷磺酸钠。所述离子对试剂浓度优选为8.0～12.5mmol/L，最优选为9.2mmol/L。离子对试剂种类及浓度的变化对各个杂质的保留时间影响不一，过高和过低的浓度均会影响分离效果，过低的浓度，会使杂质E和杂质C出峰提前，从而造成峰重叠的现象，过高的浓度，不仅未能检测杂质B和杂质C，还会出现未知峰的干扰，因此。只有在上述合适的种类及浓度，杂质可达到与基线有效分离的效果。

对于流动相的pH值而言，检测样品为原料药或制剂制备得到的供试溶液，当磷酸盐缓冲液的浓度保持不变时，低pH值的流动相容易损坏分析柱，缩短分析柱的使用寿命，而高pH值的流动相不能实现所有杂质的基线分离，且当检测样品为破坏实验供试溶液时，升高pH值会影响未知杂质与主峰的分离度，进而影响检测效果，当流动相pH值为1.7时，有利于实现检测对各供试溶液中杂质的最好分离。

柱温同样是决定分离效果的重要因素之一，具体的，对于原料药或制剂制备得到的供试溶液，随着柱温降低杂质峰与主峰的分离度逐渐变大，但当检测样品为破坏实验供试溶液时，随着柱温降低未知杂质与主峰分离度有逐渐变小的趋势，直至重合；发明人综合得出，柱温优选25℃，分离效果最好。

所述高效液相法所采用的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，本领域的技术人员可以理解，即便是同样填料的色谱柱，其效能也存在区别，并影响检测效果；具体的，本发明所采用的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱可为ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)、Shim-pack GIST C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)或CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，优选为ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)。

综合现有技术公开的信息，所述的通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法，流动相速度优选1mL/min，样品配制溶液浓度优选为2mg/mL以及进样体积优选为25μL时，既可以获得较好的分离效果，又保证了分析效率。

在本发明所述的通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法中，所述杂质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F以及杂质G，所述杂质结构式为：

在本发明的一个优选的具体方案中，在本发明所述通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法中，所述杂质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F以及杂质G，所述杂质结构式为：

采用以下方式进行：

色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，以20mmol/L磷酸二氢钾和9.2mmol/L辛烷磺酸钠试剂组成的磷酸盐—离子对缓冲液为流动相进行洗脱，检测波长215nm，柱温25℃，流动相速度1.0mL/min，其中磷酸盐—离子对缓冲液用磷酸调节pH值至1.7；

样品溶液配制：采用磷酸盐溶液分别配制含羧甲司坦及其杂质各2mg/mL的溶液；

测定：进样量25μL，将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。

本发明相对于现有技术具有如下的有益效果：

本发明提供一种通过高效液相色谱法分离测定羧甲司坦及其杂质的方法，能控制羧甲司坦中的杂质含量，可实现羧甲司坦与各杂质的同时完全分离，其与各杂质的分离度均大于2.0，理论塔板数按羧甲司坦峰计算达到21012，在相同的信噪比4:1，进样体积为25μL时，检测限约为0.02μg/mL，线性范围的进样浓度约为0.0002～0.008mg/mL，精密度高，重复性好，回收率高。利用本发明的方法可以准确地进行原料药羧甲司坦及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证了羧甲司坦及其制剂的质量可控性。

附图说明

图1是实施例1所得HPLC谱图。

图2是实施例2所得HPLC谱图。

图3是实施例3所得HPLC谱图。

图4是对比例1所得HPLC谱图。

图5是对比例2所得HPLC谱图。

图6是对比例3所得HPLC谱图。

图7是对比例4所得HPLC谱图。

图8是对比例5所得HPLC谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1

仪器：Agilent 1260InfinityⅡ；

色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：20mmol/L磷酸二氢钾—9.2mmol/L辛烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：25℃；

流速：1mL/min；

检测波长：215nm；

配制含羧甲司坦及其杂质浓度：2mg/mL；

进样量：25μL；

流动相的配制：取磷酸二氢钾2.72g与辛烷磺酸钠2g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至1.7；

定位溶液的配制：分别精密称取5mg杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G，分别置于50mL量瓶中加稀释剂(0.02mol/L磷酸氢二钾溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G储备液。取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G各储备液适量作为定位溶液。

羧甲司坦系统适用性溶液的配制：精密称取20mg羧甲司坦工作对照品置于10mL量瓶中，取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G储备液各1mL加入其中，加稀释剂(0.02mol/L磷酸氢二钾溶液)溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

测定：取定位溶液各25μL注入高效液相色谱仪，检出杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F和杂质G保留时间分别为9.249min、13.281min、48.205min、8.072min、4.362min(4.574min)、17.562min、3.206min。取羧甲司坦与杂质的混合溶液25μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，羧甲司坦峰与杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F和杂质G的保留时间分别为14.779min、9.238min、13.312min、48.512min、8.111min、4.368min(4.582min)、17.640min、3.209min。本实施例的色谱条件可以有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，羧甲司坦与杂质A～G达到基线分离，专属性强，灵敏度高。实验中发现，流动相添加了适量浓度的离子对试剂辛烷磺酸钠的磷酸二氢钾缓冲液，可抑制羧甲司坦上羧基与氨基的离解，同时增加其阴离子在色谱柱上的保留时间，因此，羧甲司坦与杂质A～G峰型良好，采用该方法可以实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。采用本实施例的色谱条件，不仅可以有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，羧甲司坦与杂质A～G达到基线分离，且基线平稳，不存在峰裂的情况，相邻色谱峰分离度大于2.0，更有利于辨识与定位。

实施例2

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：Shim-pack GIST C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：15mmol/L磷酸二氢钠—8.0mmol/L辛烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：23℃；

流速：0.8mL/min；

检测波长：215nm；

配制含羧甲司坦及其杂质浓度：1mg/mL；

进样量：20μL；

流动相的配制：取磷酸二氢钠1.8g与辛烷磺酸钠1.73g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至1.6；

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，羧甲司坦片溶液的图谱见图2。本实施例的色谱条件可以有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，羧甲司坦峰与杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F和杂质G的保留时间分别为13.600min、9.460min、12.240min、43.387min、7.873min、4.500min(4.673min)、16.627min、3.240min，羧甲司坦与杂质A～G达到基线分离，专属性强，灵敏度高。实验中发现，流动相添加了适量浓度的离子对试剂辛烷磺酸钠的磷酸二氢钠缓冲液，可抑制羧甲司坦上羧基与氨基的离解，同时增加其阴离子在色谱柱上的保留时间，因此，羧甲司坦与杂质A～G峰型良好，采用该方法可以实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

实施例3

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：25mmol/L磷酸氢二钾—12.5mmol/L辛烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：30℃；

流速：1.2mL/min；

检测波长：215nm；

配制含羧甲司坦及其杂质浓度：2.5mg/mL；

进样量：30μL；

流动相的配制：取磷酸氢二钾4.3g与辛烷磺酸钠2.70g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至2.0；

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，羧甲司坦片溶液的图谱见图3。结果显示采用该方法可以实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。本实施例的色谱条件可以有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，羧甲司坦峰与杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F和杂质G的保留时间分别为14.430min、9.49min、12.980min、46.907min、8.040min、4.560min(4.760min)、16.957min、3.293min，羧甲司坦与杂质A～G达到基线分离，专属性强，灵敏度高。实验中发现，流动相添加了适量浓度的离子对试剂辛烷磺酸钠的磷酸氢二钾缓冲液，可抑制羧甲司坦上羧基与氨基的离解，同时增加其阴离子在色谱柱上的保留时间，因此，羧甲司坦与杂质A～G峰型良好，采用该方法可以实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

对比例1

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：10mmol/L磷酸二氢钾—5.7mmol/L戊烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：15℃；

流速：0.5mL/min；

检测波长：215nm；

配制含羧甲司坦及其杂质浓度：0.5mg/mL

进样量：15μL；

流动相的配制：取磷酸二氢钾13.6g与戊烷磺酸钠1g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至1.5；

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，羧甲司坦片溶液的图谱见图4。结果显示，本对比例的色谱条件不可有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，杂质G与杂质E峰型重叠，杂质B与杂质C峰型重叠，杂质F与杂质D峰型重叠，不能区分。经分析，可能与离子对试剂的选择等有关，当选用戊烷磺酸钠时，会造成某些杂质相对保留时间发生变化，从而造成与其他峰型重叠。因此，该方法不可以完全实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

选用相同浓度的己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠为离子对试剂，其所得谱图峰型不佳，且各杂质峰存在重叠，认为除辛烷磺酸钠之外，其他离子对试剂不能完全将羧甲司坦以及其七个杂质进行分离。

对比例2

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：30mmol/L磷酸二氢钾—17.2mmol/L戊烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：35℃；

流速：1.5mL/min；

检测波长：215nm；

配制含羧甲司坦及其杂质浓度：3mg/mL；

进样量：35μL；

流动相的配制：取磷酸二氢钾4.08g与戊烷磺酸钠3g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至2.5；

溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，羧甲司坦片溶液的图谱见图5。结果显示，本对比例的色谱条件不可有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，杂质G与杂质E峰型重叠，不能区分，杂质B与杂质C未能检出。经分析，可能与离子对试剂的选择等有关，当选用戊烷磺酸钠时，会造成某些杂质相对保留时间发生变化，从而造成与其他峰型重叠，且过大的pH使保留时间降低，出峰加快。因此，该方法不可以完全实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

对比例3

参照专利CN201611113881.3报导的方法进行分离测定

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：Alltima C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相：20mmol/L磷酸二氢钾—20mmol/L辛烷磺酸钠离子对缓冲液-甲醇；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

检测波长：210nm；

流动相的配制：取磷酸二氢钾2.72g与辛烷磺酸钠4.33g，加水溶解并稀释至960mL，再加入甲醇40mL，用磷酸调节pH值至2.5；

取羧甲司坦或含羧甲司坦的制剂适量，用流动相溶解样品，配制成含羧甲司坦约2mg/mL的溶液；分别取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F和杂质G适量，用流动相溶解，配制成浓度约为0.5mg/mL的各杂质溶液；取各杂质溶液及羧甲司坦溶液适量，用流动相稀释，配制成系统适用性溶液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图6。结果显示，本对比例的色谱条件不可有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，杂质B与羧甲司坦主峰峰型重叠，不能区分。经分析，可能与离子对试剂的浓度有关，当离子对试剂浓度大于13mmol时，容易产生峰裂的现象，且该色谱柱的承受力也达到极限。因此，该方法不可以完全实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

对比例4

参照文献《HPLC测定羧甲司坦及其制剂有关物质》报导的方法进行分离测定

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：Diamonsil

流动相：50mmol/L磷酸二氢钾—2.5mmol/L庚烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：35℃；

流速：1.0mL/min；

检测波长：215nm；

流动相的配制：取磷酸二氢钾6.80g与庚烷磺酸钠0.5g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至2.5；

定位溶液的配制：分别精密称取5mg杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G，分别置于50mL量瓶中加稀释剂(流动相)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G储备液。取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G各适量作为定位溶液。

取羧甲司坦或含羧甲司坦的制剂适量，用流动相溶解样品，配制成含羧甲司坦约2mg/mL的溶液；

取各杂质储备液1mL及羧甲司坦工作对照品20mg，置10mL量瓶中，用流动相溶解稀释并稀释至刻度，配制成系统适用性溶液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图7。结果显示，本对比例的色谱条件不可有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，杂质A、杂质C与杂质G峰型重叠，不能区分。经分析，可能与pH有关，升高pH值会影响杂质与主峰的分离度，使某些杂质出峰时间提前，造成峰型重叠。因此，该方法不可以完全实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

对比例5

参照文献《HPLC法测定羧甲司坦无糖口服溶液中羧甲司坦的含量及有关物质》报导的方法进行分离测定

仪器：Agilent 1260 Infinity；

色谱柱：Diamonsil

流动相：50mmol/L磷酸二氢钾—2.7mmol/L己烷磺酸钠离子对缓冲液；

柱温：25℃；

流速：1.0mL/min；

检测波长：215nm；

流动相的配制：取磷酸二氢钾6.80g与己烷磺酸钠0.5g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至2.5；

定位溶液的配制：分别精密称取5mg杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G，分别置于50mL量瓶中加稀释剂(水)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G储备液。取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G各适量作为定位溶液。

取羧甲司坦或含羧甲司坦的制剂适量，用稀释剂溶解样品，配制成含羧甲司坦约2mg/mL的溶液；

取各杂质储备液1mL及羧甲司坦工作对照品20mg，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释，配制成系统适用性溶液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图8。结果显示，本对比例的色谱条件不可有效区分羧甲司坦和杂质A～G的出峰，杂质B、杂质E与杂质G峰型重叠，不能区分，杂质A不能检出。经分析，可能与pH有关，升高pH值会影响杂质与主峰的分离度，使某些杂质出峰时间提前，造成峰型重叠。因此，该方法不可以完全实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。

在后续的分析方法学验证中，采用实施例1、实施例2和实施例3的方法，各杂质的分离度均大于2.0，理论塔板数按羧甲司坦峰计算达到21012，在相同的信噪比4:1，进样体积为25μL时，检测限约为0.02μg/mL，线性范围的进样浓度约为0.0002～0.008mg/mL，精密度高，重复性好，回收率高，符合药品质量控制过程中对于分析方法的要求。

综上可知，本发明的分析方法可以同时检测到杂质A～G，实现相关杂质的一次性有效分离，并可以进一步实现定性检测和定量检测，有利于羧甲司坦原料药及制剂的质量控制。现有技术公开的方法，只能部分分离测定羧甲司坦与其杂质，并不能实现同时分离测定羧甲司坦与该七个杂质。因此，本方案的检测方法较现有技术公开的检测方法，具有更高的普适性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。