地尔硫卓用于治疗微生物感染

摘要

本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种影响呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

说明书

技术领域

本发明涉及用于预防和/或治疗病原微生物感染的化合物。

更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物感染的化合物。

背景技术

呼吸道和/或肠道上皮病原微生物的感染

急性呼吸道感染(IRA)是全世界会诊、住院和死亡的主要原因之一，尤其是幼儿的主要死亡原因，每年有近200万人死亡。每年，为了治疗这些不同的呼吸道感染，社会成本估计在15亿至20亿欧元之间。

在引起IRA的病原体中，病毒占主导地位。在大多数儿童肺炎病例中发现病毒，并且它们是成人细菌性肺炎的诱因。就频率和发病率而言，最具代表性的病毒包括甲型和乙型流感病毒，这也是复发性大流行的风险因素；以及呼吸道合胞病毒(hRSV或hRSV)、副流感病毒(hPIV)和人间质性肺病毒(hMPV)。此外，冠状病毒科(Coronaviridae)的新型病毒(例如SRAS和最近描述的MERS-CoV病毒)的出现极有可能是一个严重的健康新问题。

造成IRA的其他病原体是细菌。最有代表性的致病菌包括肺炎球菌(S.pneumonia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和流感嗜血杆菌(H.influenza)。这些致病菌是病原体，可导致呼吸道合并感染的合并发病率和合并死亡率增加，并导致抗生素抗性的细菌菌株的出现和传播的增加，这从根本上挑战了常规抗生素治疗在人和动物中的疗效。

除流感病毒外，目前尚无有效预防或治疗由这些不同呼吸道致病病毒导致的感染的疫苗或抗病毒分子。此外，就流感病毒而言，目前非常关注的是交货时间表和可变的疫苗接种效果、以及越来越多的对抗病毒药具抗性的病毒的出现。

目前尚无针对呼吸道合胞病毒(hVRS，在本申请中也称为英文缩写hRSV)和人间质性肺炎病毒(hMPV)的特异性疫苗或治疗。肺泡病毒科(Pneumoviridae)的这些病毒是包膜病毒(150至600nm)，其具有非节段性的单股负链ARN基因组。对编码F和G蛋白的基因进行系统发育分析，可以将hMPV(如hVRS)分别分为两个主要的组，A和B，并将其中的每个组细分为两个亚组A1、A2、B1或B2。与这些肺泡病毒相关的病理主要是小儿细支气管炎、成人感冒和流感样疾病、或老年人或免疫抑制患者的重症肺炎。

同样，目前没有针对人副流感病毒(hPIV)的特异性疫苗或治疗。在1950年代后期发现的这些病毒是包膜病毒(150至250nm)，具有单股负链ARN基因组，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)。它们在遗传上和抗原性上分为4类(1至4)。已经描述了hPIV-4的其他主要亚型(A和B)以及hPIV-1和hPIV-3的亚组/基因型。hPIV-1至hPIV-3病毒是婴儿、幼儿、免疫抑制的个体、慢性病和老年人下呼吸道感染的主要原因。它们尤其会引起肺炎。

关于引起超级感染的致病菌的抗生素抗性，欧洲疾病控制中心估计，欧洲每年有25,000例死亡是由抗生素抗性导致的。在美国亚特兰大CDC观察到了相当过度死亡率。正如Lord J.O’Neil在报告中模拟的，到2050年抗生素抗性的影响，相信抗性的增加将导致这些数字的急剧增加。

2017年2月，世卫组织发布了代表全球威胁的抗性细菌清单：铜绿假单胞菌尤其代表紧急情况，因为它对大量抗生素具有抗性；对甲氧西林(SARM)具有抗性的肺炎球菌和金黄色葡萄球菌引起各种肺部和骨感染以及败血症，特别是在最敏感的患者中。

在这些细菌中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是在环境中发现的革兰氏阴性杆菌，存在于超过50％的住院患者的呼吸道中。铜绿假单胞菌是一种普遍存在的微生物，其具有在多种环境条件下生存的能力。该微生物不仅在植物和动物中引起疾病，而且在人中也引起疾病，在免疫抑制的癌症患者和患有重度烧伤或囊性纤维化的患者中引起重症感染。

用于铜绿假单胞菌感染的标准抗生素疗法组合了β-内酰胺(头孢他啶、亚胺培南或美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦)与氨基糖苷(妥布霉素、阿米卡星)和/或氟喹诺酮。铜绿假单胞菌的多重抗性菌株的出现(对以下三种主要类别中的至少两类的全部抗生素具有抗性：β-内酰胺、氨基糖苷、氟喹诺酮)构成了选择抗生素的问题，因为治疗库仍然非常有限。

因此，开发新的预防和治疗方法是主要的公共卫生目标。治疗这些病原体感染的新策略的成功很大程度上基于更好地表征其细胞生物学及其与其宿主的分子和功能上的相互作用。

肠道感染也是住院的主要原因，在某些情况下引起死亡。在发达国家，具有免疫能力的成年人中最常见的急性胃肠炎的病因是诺如病毒和轮状病毒，以及以下细菌种和细菌属：弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、和艰难梭菌(Clostridium difficile)。

III型干扰素

III型干扰素，也称为lambda(λ)干扰素，其通过有助于初始抑制病原体传播而不触发炎性反应，构成呼吸道和肠道上皮中抗微生物防御的第一线(Andreakos等人，2017)。响应于宿主细胞传感器(例如Toll样受体或细胞质效应子)的病原体激活，这些III型干扰素可在很早期有效产生。这些III型干扰素(通过激活JAK/STAT通路)激活许多所谓的干扰素刺激基因(ISG)的表达，从而通过失活例如病毒进入细胞(IFITM基因)或其复制(OAS、OASL、IFIT1、IFIT2、IFIT13、ISG15基因)，而赋予对呼吸道病原体的抑制活性。

这种早期的抗病原性应答(称为“III型干扰素”应答)在呼吸道上皮对流感病毒感染的初始固有应答中尤为突出(Galani等人，2017)。

在治疗乙型和丙型肝炎感染的临床试验中，已经对III型干扰素进行了评估，并且与使用I型干扰素的治疗相比，III型干扰素显示出较不显著的副作用(Chan等人，2016)。最近提出使用III型干扰素作为流感病毒感染的非炎性抗病毒治疗(Davidson等人，2016)。

有利的是，刺激内源性产生一种或多种III型干扰素，以抵抗呼吸道和/或肠道上皮的感染，特别是抵抗这些上皮的病毒感染。

但是，目前尚不知道具有这种刺激活性的治疗化合物。因此，到目前为止，仅测试了外源性III型干扰素的施用。

地尔硫卓，一种钙通道阻断剂

地尔硫卓是苯并硫氮杂卓家族的分子，在CAS 42399-41-7号中列出。该分子可以两种对映体(L-顺式和D-顺式)的形式存在，或以外消旋混合物的形式存在。

地尔硫卓已经被知道30多年了，并在欧洲和美国得到了药品监管部门的批准。它可以盐酸地尔硫卓的形式施用。

存在许多制剂，特别是缓释制剂。地尔硫卓以多种盖仑形式存在，例如用于局部应用的乳膏形式、用于口服施用的片剂或胶囊形式、用于制备注射溶液的粉末形式或用于吸入的药物制剂形式(WO 02/094238,US 4,605,552)。

其已知的生理作用是抑制钙通道，从而抑制细胞内钙流。具体地，地尔硫卓抑制钙跨膜进入心肌的肌纤维和血管的平滑肌纤维。这降低了到达收缩蛋白的细胞内钙浓度。

在人中，地尔硫卓的施用指征是其具有血管舒张作用，目的是降低心肌工作。因此，其可用于管理心肌和循环系统疾患，例如心绞痛、高血压、心肌缺血和心动过速。

地尔硫卓的其他治疗用途也已在文献中提出，尽管监管机构尚未批准将药物用于这些新的治疗用途。

国际申请WO87/07508描述了抑制钙流入细胞中的治疗性化合物(例如地尔硫卓)用于治疗与巨细胞病毒或疱疹相关的病毒感染的用途。

国际申请WO2011/066657描述了钙通道阻断剂(例如维拉帕米或地尔硫卓)用于治疗或预防病毒和/或细菌感染或自身免疫性疾病的用途。与病毒相关的特别是口腔疱疹、生殖器疱疹和带状疱疹。

国际申请WO2011/126071描述了抑制钙流入细胞中的化合物(例如地尔硫卓)用于治疗病毒感染的用途，特别是用于治疗与流感病毒相关的感染的用途。特别说明的是，地尔硫卓抑制病毒和钙通道之间的相互作用，从而阻断病毒进入细胞。

国际申请WO2016/146836公开了包含地尔硫卓的药物或兽医学组合物用于预防和/或治疗流感病毒感染。

专利EP1117408描述了地尔硫卓作为钙通道阻断剂化合物用于治疗与视网膜感光细胞变性相关的病理的用途。

然而，可能任未探索地尔硫卓的所有有益作用，并且非常可能与地尔硫卓作为药物相关的技术效果目前尚不完全清楚。

发明内容

本发明的技术问题涉及鉴定用于刺激编码III型干扰素蛋白的基因的表达的分子，目的是预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

实际上，在被呼吸道和/或肠道微生物感染的情况下，有利的是刺激身体对这些病原体的反应，但是却不引起炎性反应，因此避免了免疫系统的过度刺激。

然而，具有这种活性的治疗性化合物目前是未知的。

因此，正在积极地寻找有能力刺激编码蛋白(例如，白细胞介素29、白细胞介素28A和/或白细胞介素28B)的基因表达的治疗性化合物。

出人意料的是，发明人已经证明了这样的事实，即，地尔硫卓(一种钙通道阻断剂)在体外和体内也对这些编码III型干扰素蛋白的基因的表达具有刺激作用。

此外，发明人已经证明了这样的事实，即，地尔硫卓激活一组所谓的干扰素刺激基因(ISG)的表达，已知这些基因被I型和III型干扰素激活。ISG编码的蛋白参与抗细菌作用和/或参与“干扰素”信号传导。

因此，地尔硫卓可用于各种治疗应用，特别是用于预防和/或治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

地尔硫卓，在其作为激活编码一种或多种III型干扰素的基因表达的试剂的能力方面，特别适合于治疗病毒或细菌感染，而且还适合于治疗与存在至少一种病毒和至少一种细菌、或至少两种病毒、或至少两种细菌相关的合并感染，并且特别适合于治疗伴有原发性病毒感染的细菌超级感染。

本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂。

如本领域技术人员所知，鉴于关于该主题有大量科学文献，激活“干扰素III通路”使得可以治疗许多生理疾患，特别是与病原体感染相关的那些疾患。

特别地，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

本发明还涉及地尔硫卓，其用作激活至少一种所谓的ISG的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

本发明还涉及包含地尔硫卓的药物或兽医学组合物，其用于预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染，所述地尔硫卓用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂。

根据一个具体方面，所述药物或兽医学组合物的特征在于其为适合于通过吸入施用的盖仑形式。

附图说明

图1：表征重建的鼻源性人呼吸道上皮的3D模型(

图1A-通过RNAseq确定以下组中编码III型干扰素IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3(分别表示为IFNL1、IFNL2和IFNL3)的基因的表达率：

-在其基底外侧极通过其培养介质用地尔硫卓(90μM，共施用3次)处理3天的重建人呼吸道上皮(

-未经处理的重建人呼吸道上皮(基础表达水平为1)。

图1B-通过RNAseq确定以下组中编码IFI44L、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM1、ISG15、MX1、MX2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、RSAD2和STAT1的基因的表达率：

-在其基底外侧极通过其培养介质用地尔硫卓(90μM，共施用3次)处理3天的重建人呼吸道上皮，和

-未经处理的重建人呼吸道上皮(基础表达水平为1)。

在其余的分析中，仅考虑表达差异大于或等于2且校正的p值小于0.05的基因。

图1C-重建的鼻源性人呼吸道上皮的3D模型中，通过顶端地尔硫卓处理诱导的IFNL1基因表达。

在D0时通过顶极施用单剂量90μM地尔硫卓进行处理或未经处理(模拟)的重建的人呼吸道上皮(

图2：通过Rt-qPCR确认地尔硫卓诱导的与III型干扰素反应相关的8个基因。

以下组之间的IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFI27、IFN-λ1(IFNL1)、IFN-λ2(IFNL2)、IFI44L和IFITM1基因的表达率：

-通过其基底外侧极用地尔硫卓(90μM)处理3天的重建的人呼吸道上皮(图右栏)；和

-未经处理的重建的人呼吸道上皮(图右栏)。

与未经处理的上皮相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001和****p<0.0001。

图3：ELISA测量干扰素λ1(IL-29)的分泌。

在处理72小时后，通过ELISA测量通过其基底外侧极用地尔硫卓处理的(90μM，连续3天共施用3次)和未经处理的重建的人呼吸道上皮的顶极和基底外侧极的干扰素λ1(IL-29)的分泌水平(pg/mL)。

与未处理的上皮相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图4：地尔硫卓处理降低了感染的重建人呼吸道上皮(

图4A-通过基底外侧极对人呼吸道上皮进行处理的时间顺序示意图：RSV感染后(第0天)、在感染后第5小时(5hpi)以及接下来的三天(感染后(pi)第1、2、3天)用地尔硫卓每天处理或未经处理的重建的上皮。在感染后第6天进行病毒定量。

图4B-在处理或未经处理的上皮顶极(即在上皮的培养上清中)通过RT-qPCR定量相对于ARN总量的RSV病毒基因组拷贝数(通过定量F基因的拷贝)。

图4C-在处理或未经处理的上皮中通过RT-qPCR定量相对于ARN总量的RSV病毒基因组拷贝数(通过定量F基因的拷贝)。

图4D-小鼠感染和口服(p.o.)处理的时间顺序的示意图：RSV感染后(5.10

图4E-在感染后第5天(天pi)，通过RT-qPCR定量相对于从利巴韦林(RSV RIB)或地尔硫卓(RSV DIL)处理的和未经处理的(RSV PBS)小鼠肺中提取的ARN总量的RSV病毒基因组拷贝数(通过定量F基因的拷贝)。

图5地尔硫卓处理降低了重建的人呼吸道上皮模型(

图5A-通过基底外侧极对人呼吸道上皮进行处理的时间顺序示意图：用0.1MOI的hPIV-3病毒感染后(第0天)、在感染后第5小时(5hpi)以及接下来的四天(第24、48、72和96小时pi)用地尔硫卓每天处理或未经处理的重建的上皮。在感染后120小时通过感染性滴定(TCID50/mL)进行病毒定量。

图5B-在感染后96小时(顶部)和120小时(底部)，与用地尔硫卓处理的重建的人呼吸道上皮(右图)不同，未经处理的重建的人呼吸道上皮(左图)中，在显微镜下有更多的很容易看到的hPIV-3病毒诱导的细胞病理效应。

图5C-从感染后48小时到感染后120小时，每天一次测量跨上皮电阻(TEER)，其反映了上皮的完整性。与用地尔硫卓处理不同，不进行处理的感染的重建人呼吸道上皮的TEER值从感染后第24小时开始显著降低。

图5D-从感染后第48小时至第120小时的冲洗液中，在LLC-MK2细胞中测定了在上皮顶极采集的样品的病毒滴度(DITC50/mL)。在不进行处理的情况下，在重建的人呼吸道上皮的顶端表面测量的病毒滴度在感染后第72小时达到峰值，值约为10

图6地尔硫卓处理降低了重建的人呼吸道上皮模型(

图6A-人呼吸道上皮的处理的时间顺序示意图：重建的人呼吸道上皮在感染前24小时通过其基底外侧介质用90μM地尔硫卓处理，或者在其顶端(apical)表面用10μL地尔硫卓(90μM)处理，然后以1MOI的铜绿假单胞菌(PAK菌株)感染，感染后分别在相同条件下再次用地尔硫卓处理2小时。

图6B-在这些实验条件(n＝2)下，在感染后24小时，从人呼吸道上皮顶端表面收集的细菌数量，比从用基底外侧介质中的地尔硫卓处理的人呼吸道上皮顶端表面收集的细菌数量显著降低(分别为115和106vs 76和106UFC，*p<0.05)。

图6C-在用地尔硫卓进行顶端处理的情况下，在感染后24小时(n＝2)观察到了对铜绿假单胞菌的类似作用，与未经处理的相比，从用地尔硫卓处理的人呼吸道上皮的顶端表面收获的细菌减少(分别为87和106vs 63.5和106UFC)。

图7地尔硫卓处理降低了重建的人呼吸道上皮模型(

图7A-人呼吸道上皮处理的时间顺序的示意图：在用0.1MOI的重组hMPV-GFP病毒(C-85473株)感染后，在感染后D0(5hpi)、D1和D3，用3个连续剂量的90μM地尔硫卓处理上皮(通过其基底外侧介质)、或未经处理(每个条件3个上皮)。在感染后第3天(上清)和感染后第5天(总上皮)进行病毒定量。

图7B-在感染后D4进行辐射荧光显微镜观察，以观察地尔硫卓处理对病毒复制的影响。在不进行处理的情况下，在感染后D4，在几乎所有上皮中都观察到对应于GFP病毒表达的荧光(左图)，而用地尔硫卓处理的感染上皮中，在感染后相同的时间，只有很少的荧光细胞(右图)。

图7C-在感染后第3天，对用地尔硫卓处理或未经处理的感染上皮的顶极进行洗涤，以收获所产生的病毒后代。提取基因组病毒ARN，并使用含有HMPV N基因的质粒，通过RT-qPCR(Biosystems

图7D-在感染后第5天，收获上皮细胞并裂解以提取总ARN。使用含有HMPV N基因的质粒阵列，通过RT-qPCR(Biosystems

图8：在BALB/c小鼠体内鼻滴注后地尔硫卓诱导的IFN-l2(IFNL2)基因表达

图8A-BALB/c小鼠通过鼻内滴注(i.n.)处理的时间顺序的示意图：在第0天(D0)处理(20mg/kg)或不处理(“模拟处理”的PBS对照组)小鼠、然后在接下来的两天每天处理或不处理(D0、D1和D2)、或每48小时处理直到第4天(D0、D2和D4)。在D5，对动物实施安乐死后将鼻腔切除。

图8B-通过RT-qPCR测量IFN-λ2(IFNL2)基因的表达，并表示为相对于基础水平(等于1)的表达率，所述基础水平为在未经处理的小鼠(模拟处理)中测得的基因表达。

具体实施方式

本发明涉及已知药物地尔硫卓的新治疗用途，地尔硫卓是苯并硫氮杂卓家族的分子，列于CAS的42399-41-7号，具有式(1)：

在本发明的上下文中，术语“地尔硫卓”是指所有形式的地尔硫卓，特别是盐的形式，尤其是盐酸地尔硫卓的形式。当分离它们时，该术语包括外消旋混合物以及每种对映体。该术语还包括地尔硫卓衍生物，即衍生自式(1)的分子，其具有刺激III型干扰素蛋白表达的相同生物学活性。

本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂。

迄今为止，地尔硫卓在其钙通道抑制作用方面被使用；通过抑制细胞内钙的运输，施用地尔硫卓对人和动物生物体产生了许多生理作用。

发明人已经证明了地尔硫卓的新技术效果，即，激活一个或多个编码III型干扰素的基因的表达。

根据本发明的一个优选方面，其表达被激活的基因是内源性基因，即，对于所考虑的生物体是天然基因，未经过任何遗传修饰。

本领域技术人员熟悉III型干扰素在不同生理情况下的参与，并且可以从科学文献中推断出这样的激活III型干扰素表达的化合物的治疗潜力。特别地，在文献中已经鉴定了对III型干扰素的作用敏感的细胞(即，表达其受体的细胞)。因此，本领域技术人员将容易确定可以从地尔硫卓的使用中受益的人和动物的病理。

更准确地说，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活编码白细胞介素29、白细胞介素28A和白细胞介素28B的基因的表达的试剂。

因此，首次鉴定了用于激活“干扰素III通路”的治疗化合物，即，激活一个或多个编码III型干扰素的基因的表达的试剂。这是被鉴定具有这种活性的第一个化合物。

III型干扰素

III型干扰素，也称为lambda(λ)干扰素，构成了人或动物生物体抵御病原微生物感染的第一道防线。

2003年首次描述的这个新的干扰素家族包括人中的以下四种蛋白：

-干扰素λ-1(IFN-λ1)或白细胞介素29(IL-29)，

-干扰素λ-2(IFN-λ2)或白细胞介素28A(IL-28A)，

-干扰素λ-3(IFN-λ3)或白细胞介素28B(IL-28B)，

-干扰素λ-4(IFN-λ4)。

迄今为止，在小鼠中仅鉴定出了属于该干扰素III家族的两种蛋白(IFN-λ2/IL-28A和IFN-λ3/IL-28B)。

这些III型干扰素通过其常见的IFN-λR1受体(也称为IL-28RA)介导其作用。在该受体和IL-10R2受体之间形成杂合复合物以结合IFN-λ单体(有关综述，参见Donnelly&Kotenko，2010)。

在本发明的上下文中，“编码III型干扰素的基因”是指以下基因之一，或其同源物：

-编码IFN-λ1的基因，

-编码IFN-λ2的基因，

-编码IFN-λ3的基因，和

-编码IFN-λ4的基因，

如Kotenko等人,2003和O’Brien等人,2014的出版物中所述。

可以理解，以上引用的基因是人基因，但是如果地尔硫卓用于不同的动物物种时，则其表达被地尔硫卓激活的编码III型干扰素的基因将是所讨论物种中的至少一种同源基因。

诱导主要ISG的表达

本申请的实施例1证明了地尔硫卓在顶端或基底外侧处理后，诱导几种所谓的“干扰素刺激的”基因(ISG)，特别是“免疫”基因的表达。

值得注意的是，已在文献中描述地尔硫卓诱导ISG的表达，例如IFI44L、IFIT2、OAS1、IRF7、MX1或IFITM1。

呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物感染

IFN-λR1受体仅由上皮型细胞表达，因此将III型干扰素的作用局限于上皮。

在外部病原体的感染中，呼吸道和肠道上皮是受影响的第一器官，因为它们分别直接与吸入的空气以及摄入的水和食物接触。

因此，本发明具体地涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

表述“至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染”应理解为由存在至少一种病原微生物产生的感染，该微生物已经感染了个体或动物或可能会感染个人或动物。

事实上，应理解，本发明既涉及预防和/或治疗影响人的感染(也称为“个体”)，也涉及预防和/或治疗影响动物(特别是家畜)的感染。

术语“预防”是指预防或至少降低至少一种病原微生物在人或动物生物体中感染的可能性。在产生的III型干扰素的作用下，生物体的组织，特别是上皮组织变得更有抵抗力，并且能够更好地避免和/或限制所述微生物的感染。

根据本发明的具体实施方案，地尔硫卓用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

术语“治疗”是指抵抗人或动物生物体中的至少一种病原微生物的感染。通过地尔硫卓的施用，体内的病毒、细菌、真菌或寄生虫感染的比率将逐渐降低，甚至完全消失。术语“治疗”还指减轻与感染相关的症状(发烧，疲劳等)和/或预防/降低并发症特别是超级感染的风险。

根据本发明的具体实施方案，地尔硫卓用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

根据一个优选的方面，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染，其特征在于，所述至少一个基因选自编码白细胞介素29的基因、编码白细胞介素28A的基因和编码白细胞介素28B的基因。

根据具体的实施方案，地尔硫卓用作激活编码白细胞介素29、白细胞介素28A和白细胞介素28B的三个基因表达的试剂。

病原微生物

在本发明的上下文中，表述“病原微生物”是指能够在其他生物体(例如人或动物)中引起疾病的任何微生物。该表述具体地包括病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫和其他病原单细胞微生物。

优选地，“病原微生物”是对“III型干扰素”的细胞反应敏感的微生物，即，通过表达和分泌III型干扰素蛋白，其细胞感染将被全部或部分预防或抑制的微生物。

根据本发明的一方面，病原微生物是特异性感染呼吸道上皮的微生物。

根据本发明的另一方面，病原微生物是特异性感染肠道上皮的微生物。

根据本发明的另一方面，病原微生物是能够感染所有类型的上皮，特别是呼吸道和肠道上皮的微生物。

根据本发明的第一方面，感染是病毒感染，即呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物是病毒。

属于III型干扰素家族的蛋白在病毒靶上皮的抗病毒反应中起着至关重要的作用。因此，激活编码所述III型干扰素蛋白的基因的表达的试剂刺激并优化了感染上皮的抗病毒反应。

根据这个方面，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种感染呼吸道和/或肠道上皮的病毒的感染。

在本发明的上下文中，术语“病毒”包括任何类型的病毒，但是更特别地是感染脊椎动物真核生物体的病毒。这些病毒可以是ADN或ARN病毒。在本发明的上下文中，其在本文中更具体地指通过呼吸道和/或肠道上皮感染生物体的病毒。

根据本发明的具体方面，所述感染不是流感病毒感染。

在文献WO2011/126071和WO2016/146836中已经提出了地尔硫卓在治疗流感病毒感染中的治疗用途。然而，在现有技术中使用地尔硫卓是出于其对钙通道的作用，而不是其在激活编码III型干扰素的基因的表达中的作用。

根据本发明的一个具体方面，所述病原微生物是具有双链ADN基因组的I组病毒。这组病毒具体地包括疱疹病毒目的病毒，乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)以及多瘤病毒科(Polyomaviridae)和痘病毒科(Poxviridae)的那些病毒。

根据本发明的一个具体方面，所述病原微生物是具有单链ADN基因组的II组病毒，尤其包括细小病毒科(Parvoviridae)的病毒。

根据本发明的一个方面，所述病原微生物是具有双链ARN基因组的III组病毒，尤其包括呼肠孤病毒科(Reoviridae)的病毒，例如轮状病毒。

根据本发明的一个方面，所述病原微生物是具有正极性单链ARN基因组的IV组病毒。该组尤其包括：

-巢病毒目(Nidovirales)的病毒，例如冠状病毒科(Coronaviridae)的病毒；

-杯状病毒科(Caliciviridae)的病毒，包括诺沃克(Norwalk)病毒；

-黄病毒科(Flaviviridae)的病毒，尤其包括黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒和登革热病毒；

-小rna病毒科(Picornaviridae)的病毒，包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和甲型肝炎病毒；

-披膜病毒科(Togaviridae)的病毒，包括风疹病毒、罗斯河病毒、辛德比斯病毒和基孔肯雅病毒。

根据本发明的一个方面，所述病原微生物是具有单链负极性ARN(ssARN)基因组的V组病毒。该组具体地包括莫纳氏病毒目(Mononegavirales)的病毒，例如：

-博纳病毒科(Bornaviridae)的病毒，包括博纳病毒(Bornaviridae)，

-丝状病毒科(Filoviridae)的病毒，包括埃博拉病毒和马尔堡病毒(Marburg)，

-副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒和Henipavirus，

-弹状病毒科(Rhabdoviridae)的病毒，包括狂犬病病毒，

-沙粒病毒科(Arenaviridae)的病毒，包括拉沙热病毒(Lassa fever virus)，

-布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的病毒，包括汉坦病毒(Hantaviruses)和刚果克里米亚热病毒(Congo-Crimean Fever virus)，

-正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒。

根据本发明的一个具体方面，病原微生物是选自人呼吸道合胞病毒(hVRS)、副流感病毒(hPIV)、人间质性肺炎病毒(hMPV)、尼帕病毒(virus Nipah)、诺如病毒(novovirus)、猪瘟病毒(virus Swine fever)、腺病毒、冠状病毒、寨卡病毒、黄热病病毒、rheovirus、轮状病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒的病毒。

更具体地，病原微生物是选自人呼吸道合胞病毒(hVRS)、副流感病毒(hPIV)和人间质性肺炎病毒(hMPV)的病毒。

根据具体的实施方案，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗人呼吸道合胞病毒(hRSV)感染。

更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗人呼吸道合胞病毒(hRSV)感染的地尔硫卓。

根据另一种实施方案，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗人副流感病毒(hPIV)感染。

更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗人副流感病毒(hPIV)感染的地尔硫卓。

根据一个具体的实施方案，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗人间质性肺炎病毒(hMPV)感染。

更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗人间质性肺炎病毒(hMPV)感染的地尔硫卓。

根据本发明的第二方面，所述感染是非病毒感染。特别地，病原微生物可以选自细菌、真菌和寄生虫。

根据本发明的一个具体方面，病原微生物是细菌。

在致病菌中，尤其要提到以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。

还可以提及对肠道感染具有特异性的细菌，例如弯曲杆菌属(Campylobacterspp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和艰难梭菌(Clostridiumdifficile)。

根据本发明的一个具体方面，病原微生物不是衣原体属的细菌。

根据本发明的一个具体方面，病原微生物是选自以下细菌物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigellaspp)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和艰难梭菌(Clostridium difficile)。

根据一个具体的实施方案，病原微生物是铜绿假单胞菌物种的细菌。

根据具体的实施方案，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染。

更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗铜绿假单胞菌感染的地尔硫卓。

根据本发明的一个具体方面，病原微生物是真菌。

在致病性真菌中，尤其可提及烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)、腐皮镰孢霉菌(Fusariumsolari)。

根据另一个实施方案，本发明涉及地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗选自以下组的病原微生物的感染：铜绿假单胞菌、人呼吸道合胞病毒(hVRS)、副流感病毒(hPIV)和人间质性肺炎病毒(hMPV)。

更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗选自以下组的病原微生物感染的地尔硫卓：铜绿假单胞菌、人呼吸道合胞病毒(hVRS)、副流感病毒(hPIV)和人间质性肺炎病毒(hMPV)。

表述“至少一种病原微生物”是指一种或多种病原微生物存在于被感染的生物体中，从而使该生物体产生免疫反应。

特别地，生物体可能已经被病毒和细菌感染，这被称为生物体的合并感染。

根据一个具体方面，本发明涉及用于如上所述用途的地尔硫卓，其特征在于所述感染是至少一种病毒和至少一种细菌的合并感染。

有利地，然后将地尔硫卓用于同时治疗病毒感染和细菌感染，这限制了向患有这种合并感染的个体或动物施用的活性化合物的数量。

更具体地说，这种合并感染可以与在被感染的上皮上存在选自以下的病原微生物组合相关：

-人呼吸道合胞病毒(hRSV)和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-副流感病毒(hPIV)和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-人间质性肺炎病毒(hMPV)和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-尼帕病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-诺如病毒和至少一种选自以下物种的细菌：弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、和艰难梭菌(Clostridiumdifficile)；

-冠状病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-猪瘟病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-腺病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-寨卡病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-黄热病病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-呼肠孤病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-轮状病毒和至少一种选自以下物种的细菌：弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、和艰难梭菌(Clostridiumdifficile)；

-登革热病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；

-西尼罗河病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；和

-流感病毒和至少一种选自以下物种的细菌：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。

根据本发明的具体实施方案，作为激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，地尔硫卓将用于：

i)治疗呼吸道和/或肠道上皮的病毒感染；和

ii)防止呼吸道和/或肠道上皮的至少一种其他病原微生物的合并感染，例如细菌超级感染。

根据本发明的另一具体实施方案，作为激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，地尔硫卓将用于：

i)治疗呼吸道和/或肠道上皮的细菌感染；和

ii)防止呼吸道和/或肠道上皮的至少一种其他病原微生物的合并感染，例如病毒超级感染。

根据本发明的另一具体实施方案，作为激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，地尔硫卓将用于：

i)治疗呼吸道和/或肠道上皮的病毒感染；和

ii)治疗与呼吸道和/或肠道上皮的至少一种其他病原微生物的合并感染，例如细菌超级感染。

治疗组合

本发明还涉及如前所述的用于治疗用途的地尔硫卓，其特征在于其与至少一种其他活性剂组合使用，即，与一种或多种活性剂组合使用。

优选地，该其他活性剂是对人或动物生物体具有有益作用的治疗性化合物，其目的是预防或治疗病理。

特别地，该其他活性剂选自抗病毒化合物、抗细菌化合物、抗寄生虫化合物、抗真菌化合物以及预防或治疗性疫苗。

优选地，该其他活性剂选自抗病毒化合物和抗细菌化合物。

在本发明的上下文中，“抗病毒化合物”是指对至少一种病毒具有直接抑制作用(例如，抑制其复制)或对该病毒的靶细胞具有作用(例如，诱导细胞状态不利于病毒感染，从而预防病毒感染)的化合物。

根据抗病毒剂的作用方式将其分为不同类别。特别提及的是：

-干扰或阻止ADN或ARN合成的核苷酸类似物；以及参与ADN或ARN合成的酶(解旋酶，复制酶)的抑制剂；

-在病毒复制周期中抑制病毒成熟期的化合物；

-干扰与细胞膜结合或病毒进入宿主细胞的化合物(融合抑制剂或进入抑制剂)；

-通过阻断病毒在细胞内的分解，防止病毒进入后在宿主细胞内自体表达的试剂；

-限制病毒向其他细胞传播的试剂。

特别地，抗病毒剂选自：

i)对病毒具有直接抑制作用的病毒剂，例如利巴韦林和法匹拉韦；

ii)诱导总体上不利于病毒感染的细胞状态的活性剂；和

iii)选自以下化合物的化合物：

·取代的2-脱氧尿苷类似物；

·核苷类似物；

·焦磷酸盐类似物；

·蛋白酶抑制剂；

·病毒渗透到细胞内的抑制剂，例如，阿比朵尔；

·针对呼吸道合胞病毒(VRS)融合蛋白的A抗原位点表位的单克隆抗体，例如，帕利珠单抗(palivizumab)；和

·具有病毒抑制作用的反义寡核苷酸。

在本发明的上下文中，“抗细菌化合物”是指具有抗细菌活性的化合物，即抑制细菌的复制(抑细菌化合物)或破坏细菌(杀细菌化合物)或抑制细菌生物合成和/或毒性产物的分泌。这些化合物特别是抗生素。

特别地，抗细菌剂选自：

i)抗生素，尤其是大环内酯类的抗生素，尤其是罗红霉素；

ii)噬菌体，细菌的天然捕食者。

这些抗病毒剂和抗细菌剂是可商购的，其使用条件在参考著作，如LeDictionnaire Vidal中描述。

根据本发明的另一方面，与地尔硫卓组合使用的其他活性剂是抗真菌化合物或抗寄生虫化合物，特别地，选自全身性抗真菌化合物(两性霉素B、唑、棘白菌素)和全身性抗寄生虫化合物(例如抗疟疾、抗阿米巴、弓形虫病、利什曼病、肺孢子虫病、驱肠虫的药物)。

根据本发明的具体实施方案，至少一种其他活性剂是疫苗。

在本发明的上下文中，“疫苗”是指特异性刺激人或动物生物体的免疫系统的化合物或化合物的组合。特别地，疫苗包含抗原，即在生物体内诱导特异性免疫反应的化合物，该生物体将保留该反应的记忆。

这样的疫苗可以是预防性疫苗，即，旨在在生物体被病原微生物感染之前刺激特异性免疫反应。

示例包括但不限于不同类型的疫苗，其根据制备这些疫苗的抗原的性质分类。传统上使用的抗原如下：失活的感染原、减毒试剂、感染原的亚基、类毒素、表达源自病原体的抗原的病毒载体、携带核酸(ADN或ARN)的载体和抗体。

这种疫苗也可以是治疗性疫苗，即，旨在与生物体被病原微生物感染的同时刺激特异性免疫反应。

在所有情况下，应理解该疫苗可以在地尔硫卓治疗之前、期间或之后施用。

最后，根据本发明的一个具体方面，以上引用的所有活性剂可以彼此组合使用，例如以下类型的组合：

-地尔硫卓、抗病毒化合物和抗细菌化合物，

-地尔硫卓、抗病毒化合物和抗寄生虫化合物，

-地尔硫卓、抗细菌化合物和抗真菌化合物，

-地尔硫卓和预防性疫苗；或者

-地尔硫卓和治疗性疫苗，

可以同时或相继地向患有呼吸道和/或肠道上皮的一种或多种病原微生物感染的个体或动物施用。

药物或兽医学组合物

本发明还涉及包含地尔硫卓的药物或兽医学组合物，所述地尔硫卓用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂。

本发明还涉及包含地尔硫卓的药物或兽医学组合物，所述地尔硫卓用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，用于预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

更准确地，根据本发明的该组合物将包含地尔硫卓以及合适的药物载剂，以及任选地另一活性剂。

术语“合适的药物载剂”是指药学上可接受的载剂或赋形剂，即，向个体或动物施用时不伴有显著的有害作用的载剂或赋形剂，其是本领域技术人员所熟知的。

根据本发明的该组合物可以配制成任何施用类型，具体地，用于口服、舌下、通过吸入的鼻和/或口施用、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、眼或直肠施用。

合适的盖仑施用形式可以是，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液或混悬剂。

根据一个具体方面，所述药物或兽医学组合物的特征在于其为适合于通过吸入施用的盖仑形式，即，通过鼻和/或口途径施用。

吸入是指通过呼吸道吸收。这是一种以气体、微滴或粉末悬浮剂形式吸收治疗性化合物的方法。

通过吸入施用的两种类型可以分为：

·当组合物为粉末形式时，通过吹入法施用，和

·当组合物为气溶胶(悬浮剂)形式或溶液形式时(例如为水溶液形式时)，通过压力喷雾施用。然后将建议使用雾化器或喷雾器来施用药物或兽医学组合物。

通过吸入施用地尔硫卓的合适的盖仑形式选自：粉末、液滴的水悬浮剂或加压溶液。

根据本发明的一个方面，所述药物或兽医学组合物包含有效量的地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，以预防和/或治疗至少一种呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物的感染。

本领域技术人员将能够通过他们的常识容易地确定地尔硫卓的有效量，施用该有效量应获得对至少一个编码III型干扰素的基因的表达的作用。

本发明还涉及一种组合产品，其包含：

-地尔硫卓，其用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂，和

-至少一种其他活性剂，其选自抗病毒化合物、抗细菌化合物和预防病原微生物感染的试剂，

用于同时、分开或相继使用，以预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮的病原微生物感染。

本发明还涉及一种用于在感染或易感于至少一种病原微生物感染的个体中预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮感染的方法，所述方法包括向所述个体施用地尔硫卓，以激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达。

本发明还涉及一种用于在感染或易感于至少一种病原微生物感染的个体中预防和/或治疗呼吸道和/或肠道上皮感染的方法，所述方法包括向所述个体施用地尔硫卓，所述地尔硫卓用作激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达的试剂。

本发明还涉及一种用于在感染或易感于至少一种病原微生物感染的动物中预防和/或治疗被呼吸道和/或肠道上皮感染的方法，所述方法包括向所述动物施用地尔硫卓，以激活至少一个编码III型干扰素的基因的表达。

这种地尔硫卓的施用优选通过吸入进行。

实施例

应该理解的是，本节中提出的实施例不是限制性的，它们仅说明了如上所述的本发明。

实施例1通过RNAseq和RT-qPCR表征地尔硫卓诱导的III型干扰素基因的表达。

A-地尔硫卓应用于重建的人呼吸道上皮的基底外侧极(

根据供应商Epithelix的说明，在气液界面处维持培养重建的人呼吸道上皮(

然后将处理的和未经处理的上皮用150μL RLT缓冲液(Qiagen)裂解。根据供应商的说明，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总ARN。

根据供应商的说明，使用ScriptSeq

使用Illumina’s bcl2fastq工具(版本为1.8.4)进行数据的多路分解以及将测序获得的BCL文件转换为FASTQ文件。使用FastQC软件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)对原始数据进行必要的质量控制。使用Trimmomatic工具进行“修剪”，其中最低质量阈值等于Q30。使用Kallisto软件在人基因组上(智人：GRCh38.p11)进行修剪读数的伪比对，然后使用R 3.3.1软件和EdgeR 3.14.0软件包进行统计分析。

使用线性模型计算用地尔硫卓处理的上皮与对照上皮细胞之间的基因表达差异，通过Benjamini-Hochberg方法校正p值。

在其余的分析中，仅考虑表达差异大于或等于2、且校正的p值小于0.05的基因。

使用DAVID 6.8工具对这些基因进行功能富集分析，并使用STRING工具进行相关性和相互作用研究。

图1A显示了在用地尔硫卓处理的人呼吸道上皮与未经处理的对照人呼吸道上皮之间观察到的III型干扰素IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的基因的表达率。

图1B显示了在地尔硫卓处理的人呼吸道上皮与未经处理的对照人呼吸道上皮之间观察到的III型干扰素反应基因(如IFI44L、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM1、ISG15、MX1、MX2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、RSAD2和STAT1)的表达率。

很明显地，用地尔硫卓处理重建的人呼吸道上皮3天，显著改变编码III型干扰素IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的基因的表达水平，使其显著增加(与未经处理的对照上皮相比，增加了100至200倍以上)。另外，该处理还显著刺激III型干扰素反应基因(例如IFI44L、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM1、ISG15、MX1、MX2、OAS1、OAS2、OAS3、OASL、RSAD2和STAT1)的表达。

B-地尔硫卓应用于重建的人呼吸道上皮的顶极(

上面我们已经表明，经由基底外侧极培养介质用地尔硫卓处理上皮(模拟在小鼠模型和人中的口服递送)诱导了IFN III通路的表达。

该实验的目的是确认当地尔硫卓通过上皮的顶极施用时(模拟体内通过鼻内途径的递送方式)，该分子的这种诱导也是有效的。

图1C代表与未经处理的上皮的内源性表达(对照)相比，用地尔硫卓顶极处理重建的人上皮模型(

获得的结果表明，用地尔硫卓经其顶极处理重建的人呼吸道上皮，诱导了IFNL1基因的显著过表达，与对照(未经处理的)上皮相比的表达率大于6：1。

这些结果使我们证实了，地尔硫卓经由重建的人呼吸道上皮顶极施用(该施用途径在体外模拟了体内的鼻内施用)、以及经由基底外侧极处理(模拟体内的口服施用)，也激活IFN III通路。

实施例2通过Rt-qPCR确认地尔硫卓诱导的与“III型干扰素”反应相关的8个基因的表达。

根据供应商Epithelix的说明，在气液界面处维持培养中的重建的人呼吸道上皮(

然后将处理的和未经处理的上皮用150μL RLT缓冲液(Qiagen)裂解。根据供应商的说明，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总ARN。逆转录步骤后，使用StepOnePlus

定量PCR引物(GAPDH：Hs02758991_g1,IFNL1:Hs00601677_g1,IFNL2:Hs00820125_g1,IFIT1:Hs01675197_m1,IFIT2:Hs00533665_m1,IFIT3:Hs00382744_m1,IFI27:Hs01086373_g1,IFI44L:Hs00915292_m1,IFITM1:Hs01652522_g1)和探针(TaqMan基因表达测定法)由Thermo Fisher Scientific提供。

每个样品进行三次重复分析，并将循环阈值(Ct)相对于GAPDH参考进行归一化。

通过2ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen,2001)确定地尔硫卓处理的细胞与未经处理的细胞之间的IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFI27、IFN-1、IFN-2、IFI44L和IFITM1基因的表达率。

图2代表获得的结果：与未经处理的上皮相比，用地尔硫卓处理重建的上皮后显示IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFI27、IFN-λ1、IFN-λ2、IFI44L和IFITM1基因的表达显著增加。

实施例3ELISA测量地尔硫卓刺激的III型干扰素λ1(IL-29)的分泌。

根据供应商Epithelix的说明，在气液界面处维持培养中的重建的人呼吸道上皮(

处理72小时后，根据供应商的说明(#3570-1H,Mabtech,Stockholm,Sweden)，通过ELISA测量用地尔硫卓处理的和未经处理的人呼吸道上皮的顶极和基底外侧极的干扰素λ1(IL-29)的分泌水平(pg/mL)。

图3代表获得的结果：通过上皮培养介质用地尔硫卓处理后，在顶极的IFNλ1(IL-29)的分泌急剧增加；在经处理上皮的基底外侧极也观察到显著的增加，但明显性稍弱。

实施例4地尔硫卓处理显著降低呼吸道合胞病毒的复制。

A-体外结果

根据供应商Epithelix的说明，在气液界面处维持培养中的重建的人呼吸道上皮(

感染后6天，用150μL RLT缓冲液(Qiagen)裂解已处理和未经处理的感染上皮的顶极样品以及上皮本身。在图4A中示意性地代表了实验的过程。

根据供应商的说明，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总ARN，通过RT-qPCR在顶极(即上清液中)(图4B)、以及在上皮中(图4C)定量病毒基因组拷贝数(F基因)。

图4B和图4C显示，在感染后通过其基底外侧极用地尔硫卓(90μM)处理重建的人呼吸道上皮时，培养上清液(图4B)和上皮(图4C)中病毒基因组的数量比未经处理的上皮低得多。因此地尔硫卓在重建的人呼吸道上皮模型中对呼吸道合胞病毒具有显著的抗病毒作用。

B-体内结果

地尔硫卓(口服)处理降低感染挑战后BALB/c小鼠模型中呼吸道合胞病毒(VRS)的复制。

图4D示意性地代表小鼠感染和治疗的时间顺序：

-将BALB/c小鼠随机分为3组，每组5个个体，然后鼻内感染50μL含有5×10

-每24小时重复相同的处理，其中利巴韦林共处理3次，地尔硫卓或PBS共处理5次。

-在感染后第5天(D5，对应于病毒复制的峰值)，对每组小鼠实施安乐死，并无菌回收其肺，以通过RT qPCR(F基因)测量其肺的病毒滴度。

在感染后5天，相对于从肺中提取的ARN总量，对VRS病毒基因组拷贝数进行RT-qPCR定量(定量F基因的拷贝)，结果如图4E所示。

与对照组中(VRS PBS)的动物和利巴韦林处理组中(VRS RIB)的动物相比，地尔硫卓处理(VRS DIL)的动物的肺病毒滴度显著降低。

使用了以下统计检验：单因素方差分析以及Bonferroni事后检验，用于比较每种病毒与模拟条件(PBS处理)。*p＜0.05。

因此，地尔硫卓在体内小鼠模型中对呼吸道合胞病毒具有显著的抗病毒作用。

实施例5地尔硫卓处理显著减少3型副流感病毒的复制

实验设计如图5A所示。

用3型人副流感病毒(C243 ATCC VR-93株)以MOI 0.1感染重建的人呼吸道上皮，感染后2小时开始用90μM地尔硫卓处理基底外侧介质，每天处理，连续4天。从感染后48小时到感染后120小时，每天一次测量跨上皮电阻(TEER)，其反映了上皮的完整性。

如图5A所示，在感染后48小时(hpi)开始直至120hpi收集的洗涤液中的LLC-MK2细胞中测定了顶端感染性病毒滴度(DITC50/mL)。

图5B示出了在以下实验之后获得的结果：在96和120hpi，在显微镜下观察未经处理的重建的人呼吸道上皮(左图)和地尔硫卓处理的人呼吸上皮(右图)。与用地尔硫卓处理的人呼吸上皮不同，在未经处理的重建的人呼吸道上皮中，由hPIV-3诱导的细胞病变作用更强，并且在显微镜下很容易看见。

图5C显示了在重建的人呼吸道上皮上测得的TEER值，其作为感染后时间的函数：

-未经处理的，未感染的；

-未经处理的，用hPIV-3感染的；和

-用地尔硫卓处理，用hPIV-3感染的。

这些结果表明，如果不进行处理，TEER值将从24hpi开始显著降低，这与用地尔硫卓处理的重建的人呼吸道上皮测得的值不同，用地尔硫卓处理的重建的人呼吸道上皮其完整性似乎得到了更好的保留。

图5D显示了用地尔硫卓处理的和未经处理的重建的人呼吸道上皮的顶端表面随时间(从48至120hpi)测得的病毒滴度(在LLC-MK2中(DITC50/mL))。

在不进行处理的情况下，在重建的人呼吸道上皮的顶端表面测量的感染病毒滴度在感染后第72小时达到峰值，值约为10

总体而言，这些结果表明地尔硫卓处理在感染的重建人呼吸道上皮模型中减少了hPIV-3的病毒复制。

实施例6地尔硫卓处理显著减少了铜绿假单胞菌细菌的繁殖

实验设计如图6A所示。

重建的人呼吸道上皮在感染前24小时通过其基底外侧介质用90μM地尔硫卓预处理，或者在其顶端表面用10μL 90μM地尔硫卓预处理，然后以1MOI的铜绿假单胞菌(PAK株)感染，感染后再次用地尔硫卓处理2小时。

结果显示在图6B(基底外侧处理)和图6C(顶端表面处理)中。

在基底外侧的情况下(n＝2)，在感染后24小时，从人呼吸道上皮顶端表面收集的细菌数量，比从用基底外侧介质中的地尔硫卓处理的人呼吸道上皮顶端表面收集的细菌数量显著降低(分别为115和106vs 76和106UFC，*p<0.05)。

在用地尔硫卓进行顶端处理的情况下，在感染后24小时(n＝2)观察到了对铜绿假单胞菌的类似作用，与未经处理的相比，从用地尔硫卓处理的人呼吸道上皮的顶端表面收获的细菌显著减少(分别为87和106vs 63.5和106UFC)。

总体而言，这些结果表明地尔硫卓处理限制了人呼吸道上皮中铜绿假单胞菌的复制。

实施例7地尔硫卓处理显著减少人间质性肺炎病毒(hMPV)的繁殖。

在用地尔硫卓处理或未经处理的上皮中研究了鼻来源的重建人上皮模型(

实验的时间顺序显示在图7A中。

用重组的hMPV-GFP病毒(C-85473株)以0.1MOI感染人呼吸道上皮(Mucilair,Epithelix)，然后在感染后D0、D1和D3，用3个连续剂量的90μM地尔硫卓处理(通过上皮的基底外侧介质)或不处理(每种情况3个上皮)。

在感染后D4进行辐射荧光显微镜观察，以观察地尔硫卓处理对病毒复制的影响(图7B)。在不进行处理的情况下，在感染后D4，在几乎所有上皮中都观察到对应于GFP病毒表达的荧光，而用地尔硫卓处理的感染上皮中，在感染后相同的时间，只有很少的荧光细胞。

在感染后第3天，对处理或未经处理的感染上皮的顶极进行洗涤，以收获所产生的病毒后代。提取基因组病毒ARN，并使用含有HMPV N基因的质粒，通过RT-qPCR(Biosystems

qPCR结果表明，从未经处理的上皮收获的顶极上清液中存在大量病毒基因组。该病毒基因组定量反映了上皮感染后病毒后代产生的水平。相比之下，从地尔硫卓处理的上皮收集的顶端上清液中测得的病毒基因组量显著降低(2log10)(图7C)。

在感染后第5天，收集上皮细胞并裂解，以提取总ARN。通过Rt-qPCR(Biosystems

qPCR结果表明，未经处理的上皮中存在非常大量的病毒基因组。另一方面，用地尔硫卓处理的上皮中病毒基因组的量减少了4log10。

总体而言，这些结果表明地尔硫卓处理显著降低hMPV病毒的复制。

实施例8通过RT-qPCR测量体内地尔硫卓诱导的IFN-λ2(IFNL2)基因表达

图8A示意性地代表BALB/c小鼠通过鼻内滴注(i.n.)处理的时间顺序：在第0天(D0)处理(20mg/kg)或不处理(“模拟处理”的PBS对照组)小鼠、然后在接下来的两天每天处理或不处理(D0、D1和D2)、或每48小时处理直到第4天(D0、D2和D4)。在D5，对动物实施安乐死后将鼻腔切除。

根据供应商的说明，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从样品中提取总ARN。逆转录步骤后，按照出版物(Galani等人Immunity 2017)中描述的，使用StepOnePlus

通过RT-qPCR测量IFN-λ2基因(IFNL2)的表达，并在图8B中相对于在未处理(模拟处理)的小鼠中测量的基础水平(等于1)显示。

这些结果使我们可以确认，在小鼠模型中鼻内施用地尔硫卓、以及口服处理也可以激活IFN III通路。

参考文献

专利文献

WO 02/094238

US 4,605,552

WO 87/07508

WO 2011/066657

WO 2011/126071

WO 2016/146836

EP 1 117 408

参考文献

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