一种接种混合丛枝菌根真菌扦插繁育茶苗的方法

摘要

本发明涉及茶苗繁育技术领域，尤其是一种接种混合丛枝菌根真菌菌株扦插繁育茶苗的方法。本发明借助传统茶苗扦插繁育方法，在苗床上撒施高效AM真菌混合菌剂，覆盖心土扦插插穗，扦插70‑90d后喷施植物激素，促进茶苗与AM真菌共生，不但提高了AM真菌对扦插茶苗的的侵染率，从而增强菌根化繁育效果，提高茶苗成活率、发芽率、愈伤组织形成率，还能提高茶苗生长性能如株高、根长等，提高了茶苗繁育质量，生产优质菌根化茶苗，操作性强，适宜普遍推广。

说明书

技术领域

本发明涉及茶苗繁育技术领域，尤其是一种接种混合丛枝菌根真菌扦插繁育茶苗的方法。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科山茶属茶树种，原产于我国西南，是我国重要的经济作物之一。当前国内茶苗的主要繁育方式为扦插繁育，该法具有可保留母穗优良性状、便于茶园标准化生产及管理等优点；但也存在扦插茶苗存活率低、生长缓慢、生根率低、移栽后适应性差等缺陷。为了提高扦插繁育育苗质量和生产优质茶苗，将其接种上丛枝菌根真菌进行菌根化扦插育苗得到了广泛的研究与尝试。

例如：王曙光等(丛枝菌根(AM)对无性繁殖茶苗生长及茶叶品质的影响.植物学报.2002,19(4):462-468)公开了采用温室盆栽试验，分别接种丛枝菌根(AM)真菌Acaulospora lavis(光壁无梗球囊霉,菌号：34)、Glomus manihot(木薯球囊霉，菌号：38)和Glomus caledonium(苏格兰球囊酶，菌号：90036),观察AM对枝条繁殖茶苗生长和茶叶品质的影响，试验结果显示：接种AM真菌明显促进了无性繁殖茶苗生长，无论是株高还是地上、地下干重都高于不接种者，且差异达极显著水平；AM对茶树吸收无机元素有明显的促进作用，尤其对P、Ca、Mg等的吸收；接种AM真菌的茶苗根际细菌、放线菌数量和酸性磷酸酶活性都明显高于CK；接种AM真菌还提高了茶叶水浸出物、氨基酸、咖啡碱和茶多酚的浓度，改善了茶叶品质。但是，在该研究中，主要集中于对扦插生根后的茶苗苗木进行接种AM菌剂，即就是研究对于已经拥有根系的茶苗进行促生长研究，而对于扦插插穗无根系期间的促生长作用如何，并未在该研究中得以体现研究；而茶树扦插繁育过程中，对于扦插插穗能否生根，直接关系扦插插穗成活率以及后续的生长质量。

再例如：专利号为201310085299.0的丛枝菌根真菌在烟草大面积栽培中的应用方法，采用初始丛枝菌根真菌菌剂单独接种扩繁，每种菌种扩繁后的丛枝菌根的繁殖体孢子密度＞30个/g干土，采用漂浮育苗的方法对烟草进行丛枝菌根真菌菌剂混合接种获得菌根化的烟苗，并将菌根化的烟苗直接应用于大田生产，移栽时进行二次接种；可见，该研究是在种子发芽阶段接种真菌处理，实现种子发芽生根，实现根系浸染真菌；再利用二次补充接种在带有根系的烟苗，实现促生根生长的目的；但该研究也并未开展对扦插插穗无根系期间的促生长作用如何进行研究。

为此，本研究者开展了通过接种丛枝菌根真菌促进茶苗扦插繁育育苗的研究，例如：专利申请号为201710942127.9的茶苗菌根化扦插繁育新方法，扦插插穗30d后接种扩繁菌土，在苗床扦插枝条中间开沟，施加菌土，翻土覆盖，接种后期施用少量尿素并喷施联苯菊酯防治茶树虫害，采用的菌种是单一的根内球囊霉或摩西球囊霉，实现对不同品种的扦插茶苗成活率、愈伤组织形成率、发芽率以及后期茶苗生长性能影响研究，得到结果为：达到茶苗成活率最高89.9±4.1％，愈伤组织形成率最高96.7±5.8％，发芽率最高76.0±13.9％，且仅适应特定的茶树树种采用特定的AM真菌的情形。再例如：专利申请号为201910097626.1的提高茶苗田间菌根化扦插繁育效果的方法，通过预先在扦插苗床上撒施扩繁好的AM真菌高效菌株根内根孢囊霉，并在扦插后喷施独角金内脂，从而促进茶苗田间菌根化扦插繁育效果，实现对菌根浸染率大幅度提高，达到94.97±1.5％，成活率达到了99.4±0.23％，改善了茶苗植株生长性能，使得茎高达到22.49±0.59cm，根长10.31±0.35cm，茎秆鲜重比34.07±4.3％，根干鲜重比40.27±3.025％。可见，本研究者已经开展了关于无根系扦插插穗接种AM真菌繁育茶苗的研究，且已经在无根系扦插插穗接种AM真菌繁育茶苗过程中，开展了特定茶树品种适应特定AM真菌、特定AM真菌与特定的植物激素共同作用指定的茶树品种的研究，但对于混合AM真菌与特定植物激素结合改善，改善繁育茶苗菌根化程度和生长性能的研究还未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种接种混合丛枝菌根真菌扦插繁育茶苗的方法。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

接种混合丛枝菌根真菌扦插繁育茶苗的方法，采用高效AM真菌混合菌剂撒施在苗床上，覆盖心土，扦插插穗；待扦插70-90d后，喷施植物激素，以促进AM真菌与茶苗共生；所述高效AM真菌混合菌剂是分别以根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)质量计，按照1:1:1混合而成；且所述物激素为独角金内脂或亚精胺。

优选，所述的独角金内酯，在喷施时候的浓度为1.0μmol/L；所述的亚精胺，在喷施时候的浓度为0.10mmol/L。

优选，所述的高效AM真菌混合菌剂制备是：采用种植三叶草扩繁菌株方法进行扩繁制备。

优选，所述的扩繁菌株方法，包括以下步骤：

(1)取黄沙土与河砂按1:1的质量比混合，并辐射灭菌(12kGy)，得基质，待用；

(2)将三叶草种子采用质量浓度为10％的NaOH清洗3-5min，蒸馏水洗干净后，用75％酒精浸泡20min，再用蒸馏水洗干净，晾干水分，待用；

(3)将步骤(2)所得种子与AM真菌菌剂共同施于步骤(1)所得的基质中，采用无菌水浇水培养12周后，剪掉三叶草地上部分，收集含三叶草根系的土壤，置于阴凉处风干，即得AM真菌菌剂。

优选，所述的三叶草为白三叶草。

优选，所述的苗床，长为8-10m，宽1.2-1.3m，高20-25cm；且相邻两个苗床之间的间隔为10-15cm。

优选，所述的心土为在无杂草或少杂草的荒坡上挖取的黄棕色酸性土壤，其覆盖厚度为3-5cm。

优选，所述的插穗，是在采春茶后，取30-50cm长的腋芽作为母穗；将母穗打顶，促使母穗上侧芽萌发，待侧芽长到10-15cm后，剪下侧芽作插穗。

优选，所述的扦插插穗是在苗床上采用水浇透至土壤含水量为70-80％，并压实土壤；再按照株距为0.5-1cm，行距为3-5cm扦插插穗；扦插完成后，盖上白色塑料薄膜，采用遮阳网遮阴处理。

优选，所述的方法还包括茶圃管理，采用人工除草，喷施1-2次浓度8ml/25Kg的联苯菊酯防治虫害；待茶苗长到第四片叶时，开始追施尿素，且在茶苗生长期内共施2次尿素，每次20kg/亩。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

经苗床上撒施高效AM真菌混合菌剂，覆盖心土扦插插穗，扦插70-90d后喷施植物激素，增强混合AM真菌对扦插茶苗侵染的能力，提高侵染率，从而改善形成根系的茶苗菌根化程度，增强菌根化繁育效果，提高茶苗生长性能。

本发明创造主要是采用特定的高效AM真菌混合菌剂与对应的植物激素相结合，再扦插后特定时间段内采用植物激素的喷施处理，达到了增强扦插插穗菌根化程度，提高茶苗生长性能的目的。

独脚金内酯：strigolactones analog，rac-GR24，CAS No.76974-79-3，分子式C

亚精胺：Spermidine，CAS No.124-20-9，分子式C

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

以下试验中所采用的“未含有AM真菌菌剂”是指等量的高效AM真菌混合菌剂辐射灭菌(12kGy)所得。

一、试验方法

1、高效AM真菌混合菌剂制备：

(1)取黄沙土(过2mm筛网)与河砂按1:1的质量比混合，并辐射灭菌(12kGy)，得基质，待用；

(2)将白三叶草种子采用质量浓度为10％的NaOH清洗3-5min，蒸馏水洗干净后，用75％酒精浸泡20min，再用蒸馏水洗干净，晾干水分，待用；

(3)将步骤(2)所得种子与AM真菌菌剂共同施于步骤(1)所得的基质中，采用无菌水浇水培养12周后，剪掉白三叶草地上部分，收集含白三叶草根系的土壤，置于阴凉处风干，即得高效AM真菌菌剂。

其中：AM真菌菌剂分别是：根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)。

试验菌剂：将上述3种高效AM真菌菌株分别采用白三叶草扩繁形成AM真菌菌剂后，再分别以根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)、摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)质量计按照1:1:1混合，制备成试验组高效AM真菌混合菌剂。

对照菌剂1：按根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)质量计1:1混合；

对照菌剂2：按摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)质量计1:1混合；

对照菌剂3：按根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)质量计1:1混合；

对照菌剂4-6：分别以根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)菌剂单独撒施。

2、苗床建立：

(1)地点：贵州省遵义市湄潭县湄江镇核桃坝村学堂组茶苗繁育基地；

(2)时间：2017年-2020年期间开展试验研究。

(3)整地建床：将基地在天晴天，深耕耙平后，在阳光暴晒3-5天后，按照长8-10m，宽1.2-1.3m，高20-25cm；且相邻两个苗床之间的间隔为10-15cm的规格建立苗床，将含有AM真菌菌剂撒施在苗床上，并覆盖3-5cm厚的心土。

菌土撒施按照：A：150kg/亩、B：300kg/亩、C：450kg/亩、D：500kg/亩标准撒施试验。

3、插穗制备：

(1)于当年5-6月份采摘完春茶之后，施肥，促进芽叶生长，促使腋芽形成长度为30-50cm长，作为母穗；

(2)将母穗打顶，促使侧芽萌发，并于当年10-11月份，且侧芽长到10-15cm长后，剪穗作插穗；

4、扦插管理：

(1)在当年10-11月份，将苗床采用水浇透至土壤含水量为70-80％，并压实；

(2)将插穗按照株距为0.5-1cm，行距为3-5cm扦插，扦插完成后，盖上白色塑料薄膜，且采用黑色遮阳网覆盖；

(3)次年3-4月份，揭开薄膜，保留遮阳网，人工除草，喷施植物激素；

(4)进入次年5-6月份后，根据茶苗实际生长情况，喷施1-2次浓度为8ml/25Kg的联苯菊酯防治茶树虫害；在茶苗长到第四片叶时，开始按照20kg/亩施尿素，且茶苗在苗床生长周期内共施肥2次。

喷施植物激素：每亩喷施5L。

独角金内酯：0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、等量清水对照；

亚精胺：0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、等量清水对照。

5、试验统计

侵染率：茶苗扦插繁育10个月后，采集茶苗根系，将其剪成约1cm长的根段，置于试管中，加入质量浓度为10％KOH，在90℃水浴锅中染色约30min，清洗脱色，在显微镜下观察侵染根段数，并按照：

侵染率(％)＝(侵染根段数/总根段数)×100％

繁育指标：茶苗扦插繁育10个月后，统计茶苗成活率，并随机调查1000株茶苗的发芽率及愈伤组织形成率；

生长指标：茶苗扦插繁育10个月后，每个苗床随机采取30株，统计茶苗的株高、根长、茎秆鲜重比、根干鲜重比。

6、适用品种

该试验方法适用于福鼎大白茶(Camellia sinensis‘Fuding Dabaicha’)等适宜进行扦插繁育的国家级茶树品种。该试验方法中采用的品种是：福鼎大白茶。且每个试验3次重复。

二、试验结果

1、菌剂接种量试验

①对扦插茶苗丛枝菌根侵染率影响情况

将菌剂接种量按照下表1中所述接种量撒施在苗床上，并对扦插茶苗根系侵染率统计，其结果如下表1所示：

表1

由表1可知：与对照菌剂和未含有AM真菌菌剂相比，试验高效AM真菌混合菌剂在苗床上后扦插插穗，菌根侵染率明显得到提高，且增加接种菌土剂量，侵染率也随之发生变化，其中300kg/亩接种剂量的侵染率与450kg/亩、500kg/亩接种剂量的侵染率无显著差异，但显著高于150kg/亩；因此，经综合比较接种成本与侵染效果，后续开展试验接种剂量统一确定为300kg/亩。

②对扦插茶苗繁育指标影响情况

将按照300kg/亩接种剂量接种菌剂的苗床上扦插所得的茶苗进行繁育指标统计，其结果如下表2所示：

表2

由表2可知，与对照菌剂和未含有AM真菌菌剂相比，采用试验高效AM真菌混合菌剂接种苗床，扦插插穗繁育茶苗，能够大幅度提高扦插茶苗成活率，提高茶苗发芽率和扦插茶苗的愈伤组织形成率。

③对扦插茶苗生长指标影响情况

将按照300kg/亩接种剂量接种试验混合AM真菌菌剂的苗床上扦插所得的茶苗进行生长指标统计，其结果如下表3所示：

表3

由表3可知，与对照菌剂和未含有AM真菌菌剂相比，采用高效AM真菌混合菌剂接种苗床，再扦插插穗，将有助于提高扦插茶苗生长性能，提高茶苗株高、根长、茎干鲜重比和根干鲜重比，保障育苗质量，生产优质茶苗。

经表1、表2、表3数据总结可知：采用根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)菌土、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)菌土、幼套近明囊(Claroideoglomusetunicatum)菌剂以菌种质量比计1:1:1混合制备所得的复合AM真菌菌剂，按照300kg/亩接种剂量撒施在茶苗育苗苗床上，再扦插插穗，能够有助于提高AM真菌对根系侵染率，提高茶苗繁育质量，改善茶苗生长性能，进而提高成活率和生根率，促进茶苗快速生长，保障茶苗繁育质量，生产优质茶苗。

2、菌剂接种+植物激素试验

①对扦插茶苗丛枝菌根侵染率影响情况

采用上述试验所得的高效AM真菌混合菌剂，按照300kg/亩撒施菌土在茶苗繁育苗床上，对扦插完成，70-90d后，采用植物激素进行喷施，按照每亩喷施5L，并按照上述侵染率统计方法统计，其结果如下表4所示：

表4

由表4可知，与对照菌剂和未含有AM真菌菌剂相比，采用植物激素在扦插后70-90d喷施，能显著提高AM真菌的侵染率，且不同AM真菌及组合接种后，与不同种类激素、不同浓度激素喷施后的侵染率不同；但在整体上，正如本研究者前期研究，例如：专利申请号为201910097626.1的提高茶苗田间菌根化扦插繁育效果的方法中公开的内容一样，植物激素的喷施，能够有助于AM真菌与宿主茶苗建立共生关系，从而提高侵染率。其中，采用复合AM真菌菌剂撒施在苗床上，再扦插插穗，在70-90d后喷施植物激素，相比单一AM真菌接种来说，其侵染率达到了97％以上，侵染效果更佳。

②对扦插茶苗繁育指标影响情况

将独角金内酯浓度为1.0μmol/L和亚精胺浓度为0.10mmol/L组的苗床上扦插所得的茶苗进行繁育指标统计，其结果如下表5所示：

表5

由表5可知，与对照菌剂和未含有AM真菌菌剂相比，试验菌剂采用植物激素独角金内酯或亚精胺在扦插后70-90d喷施，能提高茶苗成活率、发芽率、愈伤组织形成率，显著提高茶苗繁育性能。

③对扦插茶苗生长指标影响情况

将独角金内酯浓度为1.0μmol/L和亚精胺浓度为0.10mmol/L组的苗床上扦插所得的茶苗进行生长指标统计，其结果如下表6所示：

表6

由表6可知，与对照菌剂4和未含有AM真菌菌剂相比，试验菌剂采用植物激素独角金内酯或亚精胺在扦插后70-90d喷施，能显著提高茶苗生长性能如株高、根长、茎干鲜重比和根干鲜重比，促进茶苗生长，生产优质茶苗。

经表4、表5、表6数据结合可知，采用植物激素在扦插繁育70-90天后喷施，将会促进混合AM真菌对扦插茶苗的侵染，促使侵染效果更佳；同时有助于提高扦插成活率、发芽率和愈伤组织形成率，且还有助于改善茶苗后期生长性能，加快成苗速度。其中，采用根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)菌剂、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)菌剂、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)菌剂以菌种质量比计1:1:1混合制备所得的混合AM真菌菌剂，按照300kg/亩接种剂量撒施在茶苗育苗苗床上，再扦插插穗70-90d后，喷施植物激素，侵染效果最佳，茶苗生长性能最优异。

3、菌剂接种时机研究

研究设计：

设计1：按照本发明创造的撒施方法进行撒施在苗床上，并利用上述高效AM真菌混合菌剂接种量试验研究所得结论作为结果数据。

设计2：其余扦插育苗方法按照上述高效AM真菌混合菌剂接种量试验方法进行操作，将菌剂在插穗扦插后30d、60d、70d、90d左右，采用开沟撒施的方式接种。

菌剂：采用根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)菌剂、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)菌剂、幼套近明囊(Claroideoglomus etunicatum)菌剂以菌种质量比计1:1:1混合所得。

菌剂接种量为300kg/亩，每个设计组重复3次。

将侵染率情况统计如下表7所示：

表7试验菌剂不同接种时机对侵染率影响情况

由表7可知，接种时机对侵染率影响无显著差异；然而经考虑扦插后接种，需要解开苗床上的白色塑料薄膜以及遮阳网，且需要在扦插茶苗行间开沟撒施高效AM真菌混合菌剂，在撒施之后，还需要覆土覆盖薄膜；而此时茶苗正处于生长期，容易损坏茶苗，影响茶苗生长，同时劳动强度增大，繁育成本增加。因此，本研究者在研究过程中，针对侵染率作为重要考量指标研究，确定在扦插插穗前接种高效AM真菌混合菌剂，在扦插后70-90d内开展植物激素喷施，促使对茶苗根系侵染率大幅度提高，提高茶苗菌根化程度，改善茶苗繁育性能和生长性能，提高茶苗繁育质量。

本发明创造具体操作方法简单，劳动强度小，不易损伤茶苗，提高了茶苗繁育质量和生长效率，有利于在茶产业发展中推广应用，提高茶农经济效益。

本发明创造其他未尽事宜参照现有技术，或者本领域技术人员所熟知的公知常识，常规技术手段加以实现，即可。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。