一种以金色链霉菌发酵生产四环素的发酵培养基及补料方法

摘要

本发明涉及一种以金色链霉菌发酵生产四环素的发酵培养基及补料方法，该所述发酵培养基及补料基料均采用甲酯化油脂作为辅助碳源。本发明引入甲酯化油脂，使其与淀粉形成辅助碳源，可以有效阻止脂肪酸的合成，从而加强产物代谢的通路，从而提高发酵水平，降低淀粉的消耗。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种以金色链霉菌发酵法生产四环素的发酵培养基及补料方法。

背景技术

四环素是一类四环类抗生素，目前大多采用发酵法生产，发酵过程是以金色链霉菌为发酵菌种，采用二级发酵模式生产，具体过程为：将金色链霉菌经过复壮、分离，孢子培养制备斜面孢子备用，然后将斜面孢子接入种子罐进行种子扩大培养，最后将培养好的种子接入发酵培养基中，通过过程补料、控制培养温度、pH、基质浓度等来控制菌体的初级、次级代谢，最终使菌体合成四环素。

现有技术中四环素发酵培养基采用的是淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及无机盐、微量元素等组成的混合营养物质，发酵过程补料采用的是淀粉、玉米浆、微量元素等组成的混合淀粉糖，并通过补入氨水控制发酵过程的pH。其中发酵过程中碳源物质以淀粉为主，油脂碳源在发酵体系中未见使用。现有工艺技术中，四环素发酵过程淀粉单耗月9～12千克/十亿四环素，消耗量极大。发酵过程大量消耗粮食作物，不仅使得原材料成本居高不下，发酵单位无法提升，而且发酵放罐碳残留高，造成后续废渣处理难度加大。因此，降低四环素发酵碳源单耗，减少淀粉等粮食作物的消耗，采用经济作物作为碳源等方向是当前四环素发酵发展的技术关键。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种提供可有效降低淀粉单耗，提高发酵单位，降低原材料成本的碳源的以金色链霉菌发酵生产四环素的发酵培养基。

本发明的另一目的是提供上述以金色链霉菌发酵生产四环素的补料方法。

本发明在发酵过程中引入甲酯化油体系，减少碳源向脂肪合成方向的代谢，从而加强向产物方向的代谢，提高碳源的产物合成效率，进而提高发酵单位。具体技术方案为：

一种以金色链霉菌发酵生产四环素的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基采用甲酯化油脂作为辅助碳源，该甲酯化油脂在发酵培养中的占比为0.2～0.5%，甲酯化油脂与淀粉的比例为1:8～1:12。

所述发酵培养基得具体原料组成为：淀粉2～5%，甲酯化油脂0.2～0.5%，黄豆饼粉1～3%，玉米浆2.0～3.0%，酵母粉0.2～0.5%，硫酸铵0.3～1.0%，轻质碳酸钙0.3～0.8%，微量元素及无机盐适量。

所述甲酯化油脂为植物性油脂与经甲酯化反应后所得到的甲酯化油，其甲酯率大于80%。

所述植物性油脂为豆油、棉籽油、菜籽油或棕榈油。

利用上述发酵培养基发酵生产四环素的补料方法，其特征在于在发酵过程中性发酵液补碳源和补氨水，

所述补碳源是指在发酵过程中补入淀粉糖和甲酯化油，其中

补淀粉糖，在发酵液总糖降至2.5%以下时补入，发酵过程中控制总糖2.0～3.0%，

补甲酯化油，在发酵20～30h时流加补入，补入速率为0.1～0.2g/hr/L培养液，

全程补入甲酯化油补入量与淀粉糖补入量折干比例为1:8～1:12，放罐前20～30hr停止补入甲酯化油脂；

补氨水是指根据发酵液pH补入氨水，控制发酵过程中发酵液pH5.7～6.0。

常规的四环素发酵工艺仅补入淀粉糖和氨水，本发明引入甲酯化油脂，使其与淀粉形成辅助碳源，可以有效阻止脂肪酸的合成，从而加强产物代谢的通路，从而提高发酵水平，降低淀粉的消耗。技术优势体现在：

1、本发明以天然油脂降解合成的甲酯化油作为四环素产生菌的发酵培养基和补料营养物，由于油脂经甲酯化后形成脂肪酸甲酯，脂肪链变短，容易被四环素产生菌分解利用，为发酵代谢提供部分脂肪酸和甲基，而且这部分物质可作为发酵代谢的前体物质，有利于四环素的合成。

2、本发明在四环素发酵基础料中添加甲酯化油，可以促使菌体对甲酯油的诱导利用，启动酶系建立，为过程流加提供初始酶系，保障甲酯化油补入后能够有效利用，避免积累，同时减少淀粉投料量，降低发酵液粘度，改善供氧，保证了发酵过程菌体生长良好。

3、本发明在发酵20～30h时流加补入甲酯化油，在四环素菌体量形成后进入次级代谢前期补入，菌体用基础培养基中的甲酯化油诱导酶系形成，与补料甲酯化油形成可持续利用过程，阻止或减少碳源向脂肪合成途径的通量，更有利于菌体向合成四环素方向转化，从而达到提高发酵目标产物四环素。

4、本发明将甲酯化油用于四环素发酵后，可节约粮食作物的使用，甲酯化油可以由豆油、菜籽油、棉籽油、棕榈油等经济作物进行甲酯化得到，工艺方案成熟，甲酯化工艺可分离副产物丙三醇，降低油脂成本，从而降低四环素发酵的原材料成本。

5、采用本发明，四环素发酵放罐指数可由1.8～1.9提高至2.0～2.1，放罐效价可达到33000～34000u/ml，同时缩短发酵周期10小时以上，降低淀粉单耗20～30%，放罐发酵液中总糖降低20%以上，发酵原材料成本可降低10～20%，发酵过程中发酵液粘度降低，进而有效提高发酵过程的供氧能力，降低能耗，改善了放罐发酵液质量，提高了发酵液过滤速度。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的具体实施方式作详细说明。应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

下述实施例中，甲酯化油的获得方式是：市场采购，也可将天然油脂在碱催化下与甲醇进行甲酯化反应，分离出丙三醇，得甲酯化油，其中甲酯率大于80%。天然油脂为天然植物油脂，包含豆油、棉籽油、菜籽油或棕榈油等。

下述实施例与常规发酵方案同期对照进罐，对比发酵水平变化。常规四环素发酵工艺如下：

将斜面孢子接种至灭菌好的种子培养基中，进行种子培养。

种子培养基：淀粉3～4%，黄豆饼粉2～3%，酵母粉0.3～1.0%，玉米浆0.2～1.0%，硫酸铵0.1～0.7%，轻质碳酸钙0.1～0.5%，微量元素及无机盐适量。

种子培养条件：全程温度30～35℃，通气量1:0.8～1.2v/v/min，搅拌条件下培养20～28hr得到种子液。

将培养好的种子液接入灭菌好的发酵培养基中进行发酵培养，接种量10～20%。培养周期170～180小时。

发酵培养基：淀粉7～10%，黄豆饼粉1.0～3.0%，酵母粉0.2～0.7%，玉米浆2.0～3.0%，硫酸铵0.3～1.0%，轻质碳酸钙0.3～0.8%，微量元素及无机盐适量。

发酵培养过程：根据总糖水平补入淀粉糖，控制总糖2.0～4.0%；根据pH补入氨水，控制pH5.8～6.0。培养温度29～33℃，通入空气比为1:1.1～1.4v/v/min并搅拌。

培养约170～180小时放罐，放罐效价30000～32000μ/ml，放罐总糖2.0～2.5%，发酵指数1.8～1.9，淀粉单耗10～12kg/十亿四环素。

实施例1

种子培养方式不变，发酵培养条件不变。

发酵培养基及补料选择豆油甲酯化油，甲酯率81.2%。

发酵培养基组成为：淀粉2.3%，甲酯化油脂0.2%，黄豆饼粉3%，酵母粉0.25%，玉米浆2.5%，硫酸铵0.65%，轻质碳酸钙0.45%，微量元素及无机盐适量，基础料中甲酯化油与淀粉的比例为1:8.7。

发酵过程补入淀粉糖，总糖减至2.0%开始补糖，控制总糖1.5～2.5%。

根据pH补入氨水，pH下降至6.0开始补入氨水，控制pH在5.8～6.0。

发酵24hr开始流加补入豆油甲酯化油，流加速率0.2g/hr/L发酵液，放罐前30hr停补，全程共补入甲酯油与淀粉折干比例为1:12。

162hr放罐，效价34820μ/ml，发酵指数2.053，放罐发酵水平提高11.5%，发酵原材料成本降低15.5%，放罐甲酯化油无残留。

实施例2

种子培养方式不变，发酵培养条件不变。

发酵培养基及补料选择棉籽油甲酯化油，甲酯率84.5%。

发酵培养基组成为：淀粉4%，甲酯化油脂0.4%，黄豆饼粉2%，玉米浆2.2%，酵母粉0.45%，硫酸铵0.75%，轻质碳酸钙0.55%，微量元素及无机盐适量，基础料中甲酯化油与淀粉的比例为1:10。

发酵过程补入淀粉糖，总糖减至2.0%开始补糖，控制总糖1.5～2.5%。

根据pH补入氨水，pH下降至6.0开始补入氨水，控制pH在5.8～6.0。

发酵25hr开始流加补入棉籽油甲酯化油，流加速率0.15g/hr/L发酵液，放罐前28hr停补，全程共补入甲酯油与淀粉折干比例为1:10。

165hr放罐，放罐效价34890μ/ml，发酵指数2.125，放罐发酵水平提高12.2%，发酵原材料成本降低14.3%，放罐甲酯化油无残留。

实施例3

种子培养方式不变，发酵培养条件不变。

发酵培养基及补料选择菜籽油甲酯化油，甲酯率86.7%。

发酵培养基组成为：淀粉3%，甲酯化油脂0.35%，黄豆饼粉2.5%，玉米浆2.7%，酵母粉0.3%，硫酸铵0.58%，轻质碳酸钙0.6%，微量元素及无机盐适量，基础料中甲酯化油与淀粉的比例为1:11.6。

发酵过程补入淀粉糖，总糖减至2.0%开始补糖，控制总糖1.5～2.5%。

根据pH补入氨水，pH下降至6.0开始补入氨水，控制pH在5.8～6.0。

发酵30hr开始流加补入菜籽油甲酯化油，流加速率0.17g/hr/L发酵液，放罐前25hr停补，全程共补入甲酯油与淀粉折干比例为1:11。

160hr放罐，放罐效价34290μ/ml，发酵指数2.103，放罐发酵水平提高11.2%，发酵原材料成本降低12.5%，放罐甲酯化油无残留。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明可以提供一种构思方式，对不同的植物油甲酯化油在本构思的前提下应用于四环素发酵培养基及补料，这些不同甲酯率或不同油脂所得的甲酯化油用于四环素发酵过程，均应视为本发明的保护范围。